Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av svarande möten med en antigenmärkt blockerande lesion

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Medan replikationsgaffelkollisioner med DNA-addukter kan inducera dubbelsträngsbrott, är mindre känt om interaktionen mellan replisomer och blockerande lesioner. Vi har använt närhetsligeringsanalysen för att visualisera dessa möten och för att karakterisera konsekvenserna för svarande komposition.

Abstract

Betydande insikt finns i det cellulära svaret på dubbelsträngbrott (DSB), inducerade av nukleaser, strålning och andra DNA-brytare. Delvis återspeglar detta tillgången på metoder för identifiering av brytplatser och karakterisering av faktorer som rekryterats till DSB vid dessa sekvenser. DSB uppträder emellertid också som mellanprodukter under bearbetningen av DNA-addukter bildade av föreningar som inte direkt orsakar brott och inte reagerar vid specifika sekvensställen. Följaktligen är tekniker som möjliggör analys av bindningsinteraktioner med responsfaktorer och reparationsproteiner okända för de flesta av dessa medel. Till exempel kan DNA-interstrandtvärbindningar (ICL) provocera avbrott efter replikationsgaffelmöten. Även om det bildas av läkemedel som ofta används som cancerkemoterapeutika, har det inte funnits någon metod för att övervaka deras interaktioner med replikationsproteiner.

Här beskriver vi vår strategi för att följa det cellulära svaret på gaffelkollisioner med dessa utmanande addukter. Vi kopplade ett steroidantigen till psoralen, som bildar fotoaktiveringsberoende ICL i kärnor i levande celler. ICL: erna visualiserades genom immunofluorescens mot antigenmärket. Taggen kan också vara en partner i Proximity Ligation Assay (PLA) som rapporterar nära associering av två antigener. PLA utnyttjades för att skilja proteiner som var nära associerade med de märkta ICL: erna från de som inte var. Det var möjligt att definiera svarande proteiner som behölls efter möten med ICL och identifiera andra som förlorades. Detta tillvägagångssätt är tillämpligt på alla strukturer eller DNA-addukter som kan detekteras immunologiskt.

Introduction

Det cellulära svaret på dubbelsträngbrott är väl dokumenterat på grund av en följd av allt kraftfullare metoder för att rikta raster till specifika genomiska platser 1,2,3. Säkerheten på plats möjliggör entydig karakterisering av proteiner och andra faktorer som ackumuleras på platsen och deltar i DNA Damage Response (DDR) och därigenom driver de icke-homologa ändfogningsvägarna (NHEJ) och homolog rekombination (HR) som reparerar brott. Naturligtvis introduceras många pauser av medel som strålning och kemiska arter som inte attackerar specifika sekvenser4. För dessa finns det dock procedurer tillgängliga som kan konvertera ändarna till strukturer som är mottagliga för märkning och lokalisering 5,6. Avbrott introduceras också genom biologiska processer, såsom immunoglobulinomläggning, och ny teknik tillåter också lokalisering7. Förhållandet mellan svarande faktorer och dessa platser kan sedan bestämmas.

Avbrott uppträder också som en indirekt följd av addukter bildade av föreningar som inte är inneboende brytare men stör DNA-transaktioner som transkription och replikation. De kan bildas som en egenskap hos det cellulära svaret på dessa hinder, kanske under reparation eller för att de provocerar en struktur som är sårbar för nukleasattack. Vanligtvis är det fysiska förhållandet mellan addukten, pausen och föreningen med svarande faktorer inferentiell. Till exempel bildas ICL av kemoterapeutika såsom cisplatin och Mitomycin C8 och som en reaktionsprodukt av abasiska platser9. ICL är välkända som potenta block till replikationsgafflar10, vilket stoppar gafflar som kan klyvas av nukleaser11. Den kovalenta kopplingen mellan strängar lindras ofta av vägar som har obligatoriska brott som intermediärer 12,13, vilket kräver homolog rekombination för att återuppbygga replikationsgaffeln14. I de flesta experiment följer utredaren responsen av faktorer av intresse för de brott som bildas nedströms kollisionen mellan en replikationsgaffel och en ICL. Men eftersom det inte har funnits någon teknik för lokalisering av en provocerande lesion, kan närheten av svaret och dess beståndsdelar till ICL endast antas.

Vi har utvecklat en strategi för att möjliggöra analys av proteinföreningar med icke-sekvensspecifika kovalenta addukter, illustrerad här av ICL. I vårt system introduceras dessa av psoralen, en fotoaktiv naturlig produkt som använts i tusentals år som en terapeutisk behandling för hudsjukdomar15. Vårt tillvägagångssätt bygger på två viktiga egenskaper hos psoralener. Den första är deras höga frekvens av tvärbindningsbildning, som kan överstiga 90% av addukterna, i motsats till de mindre än 10% som bildas av populära föreningar såsom cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den andra är föreningens tillgänglighet till konjugering utan förlust av tvärbindningskapacitet. Vi har kovalent kopplat trimetyl psoralen till Digoxigenin (Dig), en sedan länge etablerad immunotag. Detta möjliggör detektion av psoralenaddukterna i genomiskt DNA genom immunfärgning av Dig-taggen och visualisering genom konventionell immunofluorescens17.

Detta reagens tillämpades, i vårt tidigare arbete, på analys av replikationsgaffelmöten med ICL med hjälp av en DNA-fiberbaserad analys16. I det arbetet fann vi att replikering kunde fortsätta förbi en intakt ICL. Detta var beroende av ATR-kinaset, som aktiveras av replikationsstress. Omstarten av replikeringen var oväntad med tanke på strukturen hos CMG-replikativ helikas. Detta består av MCM-heterohexameren (M) som bildar en offsetgapad ring runt mallsträngen för ledande strängsyntes som är låst av proteinerna i GINS-komplexet (G, bestående av PSF1, 2, 3 och SLD5) och CDC45 (C) 18. Förslaget att replikering skulle kunna återupptas på sidan av ICL distalt till sidan av den svarande kollisionen argumenterade för en förändring av svarets struktur. För att ta itu med frågan om vilka komponenter som var i svaret vid tidpunkten för mötet med en ICL utvecklade vi det tillvägagångssätt som beskrivs här. Vi utnyttjade Dig-taggen som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 för att förhöra ICL: s nära samband med proteiner i repliken20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av celler

  1. Dag 1
    1. Förbehandla 35 mm odlingsskålar med glasbotten med en cellhäftande lösning.
    2. Plattceller i de förbehandlade rätterna en dag före behandling. Cellen ska dela aktivt och 50-70% sammanflytande på experimentets dag.
      OBS: HeLa-celler användes i detta experiment med Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin. Det finns ingen begränsning för vidhäftande cellinjer. Icke-vidhäftande celler måste dock centrifugeras på objektglas och fixeras före analysen av PLA.
  2. Dag 2
    1. Bered en stamlösning av Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) genom att suspendera en fryst alikvot av tidigare syntetiserat Dig-TMP i 1:1 EtOH:H2O. Bestäm koncentrationen genom att mäta OD vid 250 nm av en 100x utspädning (iH2O) av den upplösta Dig-TMP. Extinktionskoefficienten för Dig-TMP är 25 000. Kontrollera koncentrationen genom att mäta OD vid 250 nm före varje användning och beräkna stamkoncentrationen: Abs x 100 x 106/25,000 = Koncentration (i μM). I allmänhet är stamlösningen cirka 3 mM. Lösningen kan förvaras i –20 °C i ungefär en månad.
      OBS: Dig-TMP måste syntetiseras kemiskt i förväg, enligt proceduren som beskrivs här. Återflöde 4'-klormetyl-4,5',8-trimetylpsoralen med 4,7,10-trioxa-1,13-tridekanedi-amin i toluen under kväve i 12 timmar. Ta bort lösningsmedlet och återvinn aminometyl-4,5',8-trimetylpsoralenprodukten 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatridca)] med kiselgelkromatografi. Konjugera produkten till digoxigenin NHS-ester i dimetylformamid och trietylamin vid 50 °C i 18 timmar. Avlägsna lösningsmedlet och rena återstoden genom preparativ tunnskiktskiselgelkromatografi. Eluera produktbandet kloroform: metanol: 28% ammoniumhydroxid (8:1:0.1) blandning. Indunsta lösningsmedlen och lös upp pelleten i 50% EtOH:H2O.
    2. Tillsätt Dig-TMP-buljong i 50 % EtOH:H2Otill cellodlingsmediet till en slutlig koncentration på 5 μM. Bringa mediet till 37 °C. Aspirera mediet från plattorna, tillsätt det förvärmda Dig-TMP-materialet och placera plattorna i en inkubator (37 °C, 5 %CO2) i 30 minuter så att Dig-TMP kan balansera.
    3. Medan cellerna inkuberar, förvärm UV-boxen (se materialförteckning) till 37 °C.
    4. Placera plattorna i den förvärmda UV-lådan och exponera cellerna för en dos av 3 J / cm2 UVA-ljus i 5 minuter för detta experiment. Plattorna placerades ovanpå ett termoblock som hölls vid 37 °C under bestrålningen. Beräkna tiden med formeln:
      Equation 1
    5. Aspirera mediet med pipett, tillsätt färskt förvärmt medium och lägg tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C, 5%CO2 i 1 timme.
    6. Ta bort media och tvätta disken en gång försiktigt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    7. Ta bort PBS och tillsätt 0,1% formaldehyd (FA) i PBS i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Detta förhindrar cellavlossning under CSK-R (cytoskelettextraktionsbuffert innehållande RNas, beskrivs i 1.2.9.) förbehandling som krävs för att extrahera de cytoplasmatiska elementen och minska PLA-bakgrunden.
    8. Aspirera av FA och tvätta disk med PBS en gång.
    9. Tillsätt CSK-R-buffert och inkubera i 5 minuter vid RT för att avlägsna cytoplasma [CSK-R-buffert: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 μg / ml RNas A]. Aspirera bufferten, tillsätt färsk CSK-R och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: Ett lager av CSK-buffert kan lagras vid 4 °C, och Triton X och RNaseA läggs till strax före användning.
    10. Tvätta med PBS tre gånger.
    11. Fixera celler med 4% formaldehyd i PBS i 10 minuter vid RT.
    12. Tvätta celler med PBS. Utför detta steg tre gånger.
    13. Tillsätt kall 100% metanol och inkubera i 20 min vid -20 °C.
    14. Tvätta celler med PBS tre gånger. Vid denna tidpunkt kan celler förvaras i PBS i en fuktig kammare vid 4 ° C i upp till en vecka.
    15. Inkubera celler i 80 μl 5 mM TritonX-100 i 10 minuter vid 4 °C.
    16. Inkubera celler med 100 μl 5 mM EDTA i PBS kompletterat med 1 μl 100 mg/ml RNas A i 30 minuter vid 37 °C.
    17. Tvätta celler med PBS tre gånger.
    18. Förvara cellerna i blockerande buffert (5 % BSA och 10 % getserum i PBS) i en fuktig kammare över natten vid 4 °C.

2. Närhetsligeringsanalys

OBS: Utför närhetsligeringsanalys dag 3.

  1. Färgning av antikroppar
    1. Bered 40 μl primär antikroppslösning per platta: Tillsätt lämplig volym primära antikroppar för att uppnå önskad spädning (musanti-digoxigenin- och kaninantikroppar mot en svarande komponent såsom MCM5, CDC45, PSF1 eller pMCM2, spädningar specificerade i materialtabellen) i blockerande buffert (för att nå en slutlig volym på 24 μl). Blanda genom att knacka och låt det stå i 20 minuter vid RT. Förbered en masterblandning för flera prover och blanda genom att knacka innan du applicerar på brunnarna.
    2. Tillsätt 40 μl primär antikroppslösning till mitten av brunnen och inkubera i en fuktig kammare i 1 timme vid 37 °C. Låt PLA-proberna och blockeringsbufferten värmas upp till rumstemperatur under färgning.
    3. Tvätta celler med PBS-T [PBS-T: 0,05 % Tween-20 i 1X PBS] vid rumstemperatur. Utför det här steget tre gånger.
    4. Bered under tvätt 40 μL PLA-sondlösning per skål (PLA-sonder består av en sekundär antikropp som känner igen antingen kanin eller mus IgG, kovalent kopplad till en PLUS- eller MINUS-oligonukleotid): 8 μL PLA-sond anti-mus-PLUS + 8 μL PLA-sond antikanin-MINUS-antikropp + 24 μL blockerande buffert. Blanda och låt det stå i 20 min vid RT. Förbered en masterblandning för flera prover och blanda väl innan du applicerar på brunnarna. Placera lösningen i mitten av brunnen i plattan.
    5. Ta bort den sista tvätten, tillsätt 40 μL PLA-sondlösning till mitten av brunnen och inkubera i en fuktig kammare i 1 timme vid 37 °C.
    6. Tvätta i buffert A tre gånger, i 10 min vardera, på en lutande plattform vid RT. Under tvätt, ta ligeringsblandningen till RT.
  2. Ligering och förstärkning
    1. Bered 40 μl ligeringsblandning per platta: 8 μl (5x) ligeringsmassa + 31 μl destillerat vatten + 1 μl ligas. Förbered masterblandningen för flera plattor och blanda väl innan du applicerar på brunnarna.
    2. Tillsätt 40 μl ligeringslösning till varje platta och inkubera i fuktig kammare i 30 minuter vid 37 °C.
    3. Tvätta cellerna 3x med buffert A, vardera i 2 minuter, på en lutande plattform vid RT.
    4. Bered 40 μl amplifieringslösning per skål: 8 μl (5x) amplifieringsmaterial + 31,5 μl destillerat vatten + 0,5 μl DNA-polymeras. Förbered en masterblandning för flera prover och blanda väl innan du applicerar på brunnarna.
    5. Tillsätt 40 μl förstärkningslösning till varje platta och inkubera i en fuktig kammare vid 37 °C i 100 minuter.
    6. Aspirera av förstärkningslösningen och tvätta med buffert B. Utför 6 tvättar vardera i 10 minuter, på en lutande plattform vid RT.
    7. Tvätta en gång med 0,01x buffert B i 1 min vid rumstemperatur.
    8. Aspirera buffert B och inkubera plattor med sekundära antikroppar, Alexa Fluor 488 antimus IgG och Alexa Fluor 568 antikanin IgG i blockerande lösning vid lämpliga utspädningar i blockerande buffert, i en fuktig kammare, i 30 minuter vid 37 °C eller över natten vid 4 °C.
    9. Tvätta cellerna tre gånger med PBS-T, i 10 minuter vardera på en lutande plattform vid RT.
    10. Aspirera PBS-T och montera i monteringsmedium med DAPI. De monterade plattorna kan avbildas omedelbart eller förvaras vid 4 °C i mörker i högst 4 dagar före avbildning.

3. Bildbehandling och kvantifiering

  1. Utför avbildning i ett epifluorescerande eller konfokalt mikroskop (om 3D-avbildning är önskvärt, täck minst 3 μm i 15 staplar). Utför experiment i tre exemplar och avbilda tillräckligt många fält för att göra minst 100 observationer per prov eller tillstånd. Avbilda alla fält och prover, inklusive kontroller, med samma exponeringsinställningar.
  2. Kvantifiera med en lämplig bildanalysprogramvara (se Materialförteckning för öppen källkod och kommersiell programvara som kan utföra denna analys i enstaka eller flera planbilder).
    1. Segmentera cellkärnor baserat på DAPI-färgning. Utför detektering av nukleära PLA-prickar. Tilldela PLA-punkter till motsvarande kärna. Exportera PLA-punkter per kärnresultat som en csv-fil (se kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2).
  3. Statistisk analys (se Materialförteckning för förslag på programvara med öppen källkod och kommersiell programvara).
    1. Kontrollera om proverna följer en normalfördelning med ett Shapiro-Wilk-test.
    2. Bestäm om det finns en signifikant skillnad mellan två prover med hjälp av ett Student-t-test (om antagandet om normalfördelning uppfylls) eller ett Wilcoxon-Rank Sum-test (om antagandet om normalfördelning bryts för ett prov).
  4. Datavisualisering: Generera punktdiagram i kombination med låddiagram för att visualisera datafördelning, median (Q2), 25 th (Q1) och 75th percentil för de olika exemplen (se Materialtabell för föreslagen öppen källkod och kommersiell programvara).

4.3D visning av pMCM2: ICL interaktioner

  1. Bild PLA-plattor på ett konfokalmikroskop med hjälp av ett Plan Fluor 60x/1.25 numeriskt bländaroljemål. Skaffa 16 staplar som täcker 1,6 mm och generera 3D-rekonstruktionen med lämplig bildanalysprogramvara (se materialförteckning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA av Dig-TMP med replisomproteiner
Strukturen för Dig-TMP visas i figur 1. Detaljerna i syntesen, där trimetylpsoralen konjugerades genom en glykollänkare till digoxigenin, har diskuterats tidigare17,21. Inkubation av celler med föreningen följt av exponering för 365 nm ljus (UVA) fotoaktiverar föreningen och driver tvärbindningsreaktionen. Något mer än 90% av addukterna är ICL16. Dig-taggen kan visualiseras genom immunofluorescens som avslöjar närvaron av ICL i hela kärnan (figur 2). Immunofluorescens av ett svarande protein såsom MCM2 indikerar också en fördelning i hela kärnan, en fördelning som inte påverkas av införandet av ICL. Dessa resultat visade att det fokala utseendet hos svarande proteiner, såsom ses i DNA Damage Response (DDR) till DSB, inte är en egenskap hos svarande: ICL-interaktioner.

För att visualisera interaktionen mellan svar och ICL i experimentet som visas i fig 2 applicerade vi PLA, som rapporterar närheten av två antigener (figur 3a). Vi mätte frekvensen för association av MCM5 och Dig-taggen 1 h efter införandet av ICL (figur 3b). PLA-signalerna visade närheten av svar till ICL.

Replikeringsstress, inklusive den som presenteras av ICL, aktiverar ATR-kinas22. Bland de många substraten för ATR finns MCM-proteiner, inklusive MCM2 vid serin 10823. Ett svarsamt möte med ICL förväntas resultera i fosforylering av MCM2, bland många andra substrat. I enlighet med denna förväntan var PLA mellan pMCM2Ser108 och Dig-taggen positiv (figur 3c). I andra experiment fann vi att platåfrekvensen uppnåddes vid 1 h20. Vi tolkade dessa resultat som att svar som olika ligger i hela genomet, och varierande avstånd från en ICL, så småningom stöter på blocket, vilket utlöser ATR-aktivering och MCM2-fosforylering.

PLA-resultaten i föregående figurer presenteras som en komprimerad summering av flera optiska plan. Resultaten från enskilda kärnor kan emellertid också presenteras i en tredimensionell rekonstruktion, som visas för pMCM2: Dig-TMP PLA i Video 1. Denna analys indikerade att svarande möten med ICL kunde observeras i hela kärnan.

Vår studie av replikeringsgaffel visade att ICL-möten avslöjade ett oväntat återstartsfenomen för replikering16. Med tanke på den låsta ringstrukturen hos en funktionell replikomer var det av stort intresse att fråga om replikationsapparatens sammansättning förändrades vid kollision med en ICL. Eftersom mindre än 10% av replikationsgafflarna kommer i kontakt med en ICL, skulle det inte ha varit produktivt att bara analysera proteinsammansättningen för alla svar. PLA mellan Dig och olika komponenter tillät oss dock att ta itu med denna fråga. I motsats till de positiva resultaten med pMCM2 fann vi att proteinerna i GINS-komplexet misslyckades med att ge PLA-signal med ICL: erna. Å andra sidan var analysen med CDC45 positiv, vilket indikerar att det andra låsproteinet behölls (figur 4a,b). När celler inkuberades med en hämmare av ATR undertrycktes återstarten helt och GINS: Dig PLA var starkt positiv (figur 4c). Vår tolkning av dessa resultat var att i frånvaro av ATR-aktivitet behölls GINS-proteinerna, CMG-helikasen förblev i en låst konfiguration och det fanns ingen replikationsstart förbi ICL20.

Figure 1
Figur 1: Struktur av trimetylpsoralen kopplad till digoxigeninantigenmärket. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescens av replikoprotein MCM5 och DIG TMP visar inte diskreta foci. Cellerna behandlades med Dig-TMP och UVA och efter 1 h immunfärgades för MCM5 och Dig. Den vita stapeln representerar 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: PLA mellan Dig-TMP och MCM5. a) En skiss över närhetsligeringstestet som tillämpas på interaktionen mellan MCM5-svarsproteinet och DIG-taggen på ICL. Systemet förenklas. I praktiken var primära antikroppar bundna av sekundära antikroppar kovalent kopplade till oligonukleotiderna. b) PLA mellan MCM5 och Dig-TMP. Observera de diskreta signalerna som indikerar interaktionsställen. Punkt- och låddiagram som visar signalfördelning (punktdiagram) samt medianen (rutdiagram röd stapel), 25: e och 75:e percentilerna (rutans ändar) och de högsta och lägsta värdena exklusive extremvärden (extrema linjer). Wilcoxon-Rank Sum-test bekräftade att det finns en signifikant skillnad mellan de två villkoren (p<0,001). De vita staplarna representerar 5 μm. (c) PLA mellan pMCM2 och Dig-TMP. Dessa signaler representerar mötet mellan svaret och ICL, vilket utlöser en ATR-beroende fosforylering av MCM2. PLA rapporterar variationen i mötesfrekvensen i olika celler. Den vita stapeln representerar 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: PLA mellan Dig-TMP och de svarande låsproteinerna. a) CDC45: Dig-TMP. Den vita stapeln motsvarar 5 μm. b) PSF1: Dig-TMP. Den minimala signalfrekvensen ökas kraftigt genom behandling med en ATR-hämmare, som blockerar traversvägen och frisättningen av GINS-komplexet som inkluderar PSF1. De vita staplarna representerar 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1: Tredimensionell rekonstruktion av pMCM2: Dig PLA-signaler visar fördelningen genom kärnan. PCNA är färgad i grönt, PLA i rött, DAPI i blått. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande fil 1: Cellprofiler-pipeline för PLA-kvantifiering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: IMARIS cellmodul batchparametrar för PLA-kvantifiering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om PLA är en mycket kraftfull teknik finns det tekniska problem som måste lösas för att få tydliga och reproducerbara resultat. Antikropparna måste ha hög affinitet och specificitet. Dessutom är det viktigt att minska de ospecifika bakgrundssignalerna så mycket som möjligt. Vi har funnit att membran och cellulärt skräp bidrar till bakgrunden, och vi har tagit bort dem så mycket som möjligt. Tvätten med tvättmedel som innehåller buffertar före fixering och tvätten med metanol efter fixering bidrar till att minska den ospecifika bindningen. Förbehållet är att tvättmedelsbehandling före fixering kan leda till cellavlossning. Vi finner att behandling av plattorna med ett celllim och prefix med 0,1% FA före CSK-behandlingen lindrar detta problem.

Det är också bra att identifiera icke-S-fasceller vid övervakning av S-fasspecifika händelser. Detta kan göras genom post-PLA-färgning med cellcykelmarkörer som PCNA eller NPAT24,25. Dessa markörer bekräftar inte bara S-fasfenomen utan de ger också en intern biologisk kontroll för icke-specifika interaktioner. Positiva signaler i G1-fasceller, i analyser som mäter händelser som bör vara exklusiva för S-fas, är en indikation på att ytterligare ansträngningar krävs för att minska icke-specifika interaktioner.

Encellsavbildningsstrategier har fördelar som inte är tillgängliga med andra metoder för övervakning av molekylära interaktioner. Homogeniseringstekniker, såsom används i immunoprecipitationsexperiment, eliminerar alla kopplingar till händelser i enskilda celler. Följaktligen förloras insikt om påverkan av cellcykelstatus eller variabiliteten över en cellpopulation. Men eftersom PLA rapporterar händelsefrekvenser i enskilda celler kan dessa insikter återställas.

En frekvent begränsning av PLA är bristen på immunologiska detektionsreagens för mål av intresse. Detta är ett problem när man tar itu med frågor om det cellulära svaret på DNA-störningar som introduceras av andra medel än direktbrytare. Vi har övervunnit den begränsningen genom att använda ett immunotaggat DNA-reaktivt reagens. Även om vi har fokuserat våra studier på interstrandtvärbindningar, finns det många genotoxiska föreningar, inklusive kemoterapiläkemedel, som skulle låna sig till detta tillvägagångssätt. Dessutom kan interaktioner mellan proteiner och DNA-strukturer, såsom G-quadruplexer, också undersökas med denna strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes delvis av NIH: s intramurala forskningsprogram, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746–08). J.H. stöds av National Natural Science Foundations of China (21708007 och 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Biologi utgåva 173 svarande blockerande lesion PLA närhetsligeringsanalys DNA-interstrandtvärbindningar antigenmärkta tvärbindningar

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualisering av svarande möten med en antigenmärkt blockerande lesion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter