Summary
Isolering av celler fra dissekerte implantater og deres karakterisering ved flowcytometri kan i betydelig grad bidra til å forstå mønsteret av immunrespons mot implantater. Denne artikkelen beskriver en presis metode for isolering av celler fra dissekerte implantater og deres farging for flowcytometrisk analyse.
Abstract
Suksessen med å implantere laboratoriedyrket vev eller en medisinsk enhet i en person er underlagt immunresponsen til mottakerverten. Tatt i betraktning et implantat som fremmedlegeme, kan en fiendtlig og dysregulert immunrespons føre til avvisning av implantatet, mens en regulert respons og gjenvinning av homeostase kan føre til aksept. Analysere mikromiljøer av implantater dissekert ut under in vivo eller ex vivo innstillinger kan bidra til å forstå mønsteret av immunrespons, noe som til slutt kan bidra til å utvikle nye generasjoner av biomaterialer. Flowcytometri er en velkjent teknikk for å karakterisere immunceller og deres undergrupper basert på deres celleoverflatemarkører. Denne gjennomgangen beskriver en protokoll basert på manuell dicing, enzymatisk fordøyelse og filtrering gjennom en cellesil for isolering av ensartede cellesuspensjoner fra dissekert implantatvev. Videre har en flerfarget flowcytometri-fargeprotokoll blitt forklart, sammen med trinn for innledende cytometerinnstillinger for å karakterisere og kvantifisere disse isolerte cellene ved flowcytometri.
Introduction
Fremskritt innen medisin har ført til hyppig bruk av implanterte materialer for å støtte funksjonen eller gjenveksten av skadet vev 1,2. Disse inkluderer enheter som pacemakere, rekonstruktive kosmetiske implantater og ortopediske plater som brukes til beinbruddfiksering 3,4. Imidlertid spiller materialene som brukes til å lage disse implantatene og stedene der de er implantert, viktige roller for å bestemme suksessen til disse implantatene 5,6,7. Som fremmedlegemer kan disse implantatene generere en immunrespons fra verten som enten kan føre til avvisning eller toleranse8. Denne faktoren har drevet biomaterialforskning for å generere materialer som kan tiltrekke seg ønsket immunrespons etter implantasjon 9,10,11,12.
Immunresponsen er et viktig krav innen regenerativ medisin, hvor et vev eller et organ dyrkes rundt et biomaterialeskjelett (stillas) i et laboratorium for erstatning av et skadet vev eller organ13,14,15,16. I regenerativ medisin er målet å erstatte manglende eller skadet vev ved bruk av celler, signaler og stillas, som hver kan moduleres sterkt av immunresponser17. Videre, selv når mangel på immunrespons er ønsket, er det svært sjelden et fravær av immunaktivitet snarere enn tilstedeværelsen av en regulatorisk profil som er ønsket18. Teknikker som flowcytometri kan spille en betydelig rolle i å karakterisere mønsteret av immunrespons mot forskjellige biomaterialer som brukes til å belegge implantatenheter eller for å utvikle stillaser for vevsteknikk19.
Denne informasjonen vil i sin tur til slutt bidra til å utvikle biomaterialer for implantater som kan tolereres godt av immunsystemet eller i å utvikle stillaser som kan spille en konstruktiv rolle i vevsteknikk. Riktig forberedelse av prøver for analyse ved flowcytometri er et viktig skritt for å unngå unøyaktige resultater i immunkarakterisering via fluorescensaktivert cellesortering20,21. Derfor presenterer denne gjennomgangen en detaljert metodikk som kan brukes til isolering av celler fra stillasvev, farging av cellesuspensjonen og analyse ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Figur 1 gir en oversikt over flowcytometriprotokollen.
1) Reagens forberedelse
- Forbered medier for fortynning av enzymer og for vevskultur.
- Tilsett 5 ml 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineetansulfonsyre (HEPES) bufferløsning i 500 ml RPMI medium og rist godt. Oppbevar mediet ved 4 °C inntil videre bruk.
- Beregn volumet av enzymoppløsningen.
MERK: Volumet av enzymoppløsningen er volumet av mediet som inneholder enzymer (kollagenase og DNase I) som vil være nødvendig for å fordøye terninger vev i 6-brønnsplater; Det avhenger av antall prøver.- Bruk følgende ligning til å beregne ønsket volum:
(Antall prøver som skal fordøyes) × 5 ml serumfritt RPMI med 10 mM HEPES-buffer
MERK: For eksempel, for 0,1 til 0,3 g dissekert milt, bruk 5 ml medium for å fremstille enzymoppløsningen. Den enzymatiske fordøyelsesprotokollen beskrevet i dette manuskriptet er primært for bløtvev (varierende fra 0,1 til 1 g) dissekert fra mus som inkluderer hjerne, nyre, hud, lever, lunger, milt, muskler, samt kapsler rundt subkutane implantater laget av syntetiske materialer eller ekstracellulære matriksproteiner. Fordøyelse av hardt bruskvev kan kreve forskjellige forhold og volumer av fordøyelsesenzymer, som bare kan fastslås ved optimalisering. - Beregn mengden kollagenase og DNase jeg trengte for enzymløsningen.
MERK: I denne protokollen ble 0,25 mg / ml kollagenase og 0,2 mg / ml DNase I brukt. Arbeidskonsentrasjonene som kreves for kollagenase og DNase kan variere for forskjellige typer vev19.
- Bruk følgende ligning til å beregne ønsket volum:
- Forbered en 1:1000 levedyktig fargestoffløsning ved å tilsette 1 μL av levedyktighetsfargestoffet (se materialtabell) til 999 μL fosfatbufret saltvann (PBS) og virvel løsningen. Oppbevar oppløsningen i mørket ved 4 °C inntil videre bruk.
- Forbered fargebufferen ved å tilsette 1 g bovint serumalbumin (BSA) til 100 ml PBS, og virvel oppløsningen til BSA er fullstendig oppløst. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C inntil videre bruk.
2) Sette opp enzymatiske fordøyelsesplater
- Sett opp en 6-brønns plate med 70 μm cellesiler i hver brønn. Tilsett 3 ml av det tilberedte mediet fra trinn 1.1.1 i hver brønn, og inkuber på is.
- Oppbevar det gjenværende mediet (2 ml/brønn) i en inkubator eller vannbad ved 37 °C for å suspendere den beregnede mengden kollagenase og DNase I (trinn 1.2.2).
3) Isolering av celler
- Legg dissekerte implantater/vev i tallerkener, og terning fint med saks. Alternativt kan du bruke en mekanisk forstyrrelsesmetode ved hjelp av en vevsdissosiator eller håndholdt homogenisator. På grunn av det høye antallet leukocytter, dissekere milten for å bruke som en fargekontroll i hvert løp.
MERK: Siden noen materialer induserer høyere nivåer av fibrose, gjelder denne protokollen for både svært fibrotiske og minimalt fibrotiske materialer. Imidlertid bør hver behandlingsmetode evalueres for både celleutbytte og levedyktighet etter fordøyelse før farging. Unngå perifer blodforurensning under disseksjon. - Tilsett kollagenase og DNase I (volum beregnet i trinn 1.2.2) til gjenværende RPMI (2 ml) som er varmet opp til 37 °C. Tilsett 2 ml av den komplette enzymløsningen til hver brønn.
- Plasser platene i en inkubert shaker i 45 minutter ved 37 °C og 100 o / min.
MERK: Vær forsiktig når du stabler plater, da dette kan hemme riktig varmeoverføring. - I mellomtiden forbereder du en fjæringsdispenseringsspiss ved å hakke 3-4 mm fra enden av en 1000 μL-spiss med saks. Etter inkubering, pipetter suspensjonen i brønnene opp og ned for å blande den grundig ved hjelp av den hakkede spissen. Plasser cellesilen på toppen av et 50 ml konisk rør og pass den fordøyde løsningen gjennom cellesilen.
MERK: 70 μm cellesil er tilstrekkelig til å skille celler fra implantert biomateriale, slik som alginat. Hvis større renhet er nødvendig, bruk prosesser som tetthetsgradientseparasjon for å oppnå en beriket populasjon av leukocytter. - Skyll brønnene med 1x PBS-løsning, og overfør skyllevolumet gjennom silen, etterfulgt av å tilsette vaskene av silen med 1x PBS-løsning til volumet i røret når 50 ml.
MERK: 1x PBS må være ved romtemperatur for å forhindre økning i viskositeten til fordøyelsen og for å tillate cellepelletering under sentrifugering. - Sentrifuger røret ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering aspireres supernatanten forsiktig med en serologisk pipette uten å forstyrre pelleten. Suspender pelleten på nytt i 1000 μL 1x PBS, og overfør suspensjonen til et mikrosentrifugerør.
- Bland 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL trypanblått, og legg suspensjonen på tellekammerets lysbilder for å telle celler ved hjelp av en automatisk celleteller eller på et hemocytometer for å telle via den konvensjonelle metoden under et mikroskop. Alternativt kan du bruke flowcytometri celletelling perler.
4) Farging for flowcytometri
- Se figur 2 for et eksempel på plateoppsett for et 14-fargers eksperiment med 45 prøver, fluorescens minus en (FMO) kontroller, kompensasjonskontroller og en fullstendig farget miltprøvekontroll. Etter å ha estimert totalt antall celler, beregne volumet av cellesuspensjonen som kreves for farging 1 × 10 6 celler for hver prøve, og 0,5 × 106 celler for hver kompensasjon og FMO-kontroll. Dispenser det nødvendige volumet av cellesuspensjonen i brønnene på en V-bunn 96-brønnplate, og utgjør volumet til 100 μL med 1x PBS.
MERK: Som et eksempel, hvis 1000 μL cellesuspensjon oppnådd ved trinn 3.6 inneholder 40 × 10 6 celler, vil det for 1 × 10 6 celler være nødvendig med 1000/40 × 106 = 25 μL cellesuspensjon. - Sentrifuger platen ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, aspirer supernatanten, og resuspender deretter cellene i prøvebrønnene og i en kompensasjonskontrollbrønn for å bestemme levedyktigheten, med 100 μL av en 1:1000-løsning av levedyktighetsfargen (se materialfortegnelse).
- For celler i de andre kompensasjonsbrønnene samt FMO og ufargede brønner, resuspender dem med 100 μL 1x PBS.
- Inkuber cellene i mørket i 30 minutter ved 4 °C.
- I mellomtiden forbereder du en overflateantistoffcocktail for farging av prøven og FMO-kontroller: 50 μL per prøve eller FMO. Se tabell 1 for et eksempel på antistoffcocktail.
- Etter inkubering, tilsett 100 μl 1x PBS til hver brønn, spinn ned ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender i 200 μL fargebuffer (1x PBS + 1% BSA); sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, og resuspender cellene i kompensasjonen, FMO, og ufargede brønner med 50 μL 1x PBS. Tilsett 50 μL av antistoffcocktailen til de respektive prøvebrønnene og FMO-brønnene. Legg de respektive antistoffene til de forskjellige kompensasjonsbrønnene.
- Inkuber platen i 45 minutter i mørket ved 4 °C. Etter inkubering tilsettes 150 μL fargebuffer i hver brønn, og sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, resuspender cellene med 200 μL fargebuffer og sentrifugerer cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis du analyserer prøver uten fiksering, resuspender dem i 200 μL fargebuffer, og fortsett til seksjon 6 om cytometeroppsett og prøveanalyse. Hvis du fikserer cellene, aspirer supernatanten etter vask, og tilsett 100 μL av et fikseringsmiddel som 4% paraformaldehyd. Hvis farging for intracellulære markører, fortsett til seksjon 5 om intracellulær farging, og fikser og permeabiliserer cellene (se materialfortegnelse). Inkuber celler i 20 minutter i mørket ved 4 °C.
MERK: Siden fiksering kan påvirke fluorescensintensiteten til noen fluoroforer, må du evaluere hvert panel både med og uten fiksering. - Etter inkubering, tilsett 100 μL 1x PBS, etterfulgt av sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten, resuspender i 1x PBS og sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellene i 200 μL fargebuffer, og oppbevar ved 4 °C før flowcytometrisk analyse.
5) Intracellulær farging
- Fortsett fra trinn 4.11 for fiksering og permeabilisering for intracellulære markører, tilsett 100 μL av den aktuelle bufferen. Sentrifuger cellene ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten og re-suspender pellets i 200 μL av fikseringsmiddeloppløsningen; sentrifuger cellene ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten, og resuspender pellets med intracellulære antistoffer fortynnet i riktig buffer.
MERK: Antistofftyper og fortynninger vil avhenge av målcellene. For eksempel er en vanlig intracellulær markør gaffelhodeboks P3 for regulatoriske T-celler, som ofte brukes ved en 1:100-fortynning. - Inkuber cellesuspensjonen i mørket i 45 minutter ved 4 °C. Etter inkubering, tilsett 150 μL av den aktuelle bufferen, og sentrifuger suspensjonen ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 200 μL fargebuffer etterfulgt av sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer og resuspender cellene i 200 μL fargebuffer for flowcytometrisk analyse.
6) Cytometer og kompensasjonsoppsett
- Umiddelbart før du kjører prøvene, må du forberede kompensasjonsperler (se materialtabell) hvis du bruker perlebasert kompensasjon i motsetning til cellebasert kompensasjon.
- Merk separate mikrosentrifugerør for hvert fluorokrom-konjugert antistoff, og tilsett 100 μL 1x PBS etterfulgt av en full dråpe anti-mus negative kontrollkompensasjonsperler og en dråpe positive kontrollkompensasjonsperler til hvert rør. Tilsett 1 μL av passende antistoff til hvert separate rør. Vortex og ruge i 5 min før oppkjøp.
MERK: Siden noen fargestoffer, for eksempel BUV737, ikke kan bindes til perler, bruk en cellebasert kontroll.
- Merk separate mikrosentrifugerør for hvert fluorokrom-konjugert antistoff, og tilsett 100 μL 1x PBS etterfulgt av en full dråpe anti-mus negative kontrollkompensasjonsperler og en dråpe positive kontrollkompensasjonsperler til hvert rør. Tilsett 1 μL av passende antistoff til hvert separate rør. Vortex og ruge i 5 min før oppkjøp.
- Kalibrer flowcytometeret før hvert eksperiment ved å kjøre cytometeroppsettet med sporingsperlene, og oppretthold strømningscytometerinnstillingene for hvert eksperiment.
- Før du analyserer prøven, juster flowcytometeret ved å kjøre en ufarget prøve for å justere cellepopulasjonen på et sidespredningsplott (SSC) versus fremoverspredning (FSC) slik at cellepopulasjonen faller i midten av plottet og ikke er utenfor skalaen.
- Kjør den fargede prøven kort for å justere spenningene for FSC og SSC og for hver kanal for å sikre at ingen hendelser faller utenfor den logaritmiske skalaen for hver kanal. Registrer 5000 hendelser for hver kompensasjonskontroll, etterfulgt av gating av positive og negative populasjoner. Beregn kompensasjonsmatrisen og kjør deretter prøvene, samle minst 1000 hendelser for populasjonene av interesse.
MERK: Kompensasjon på paneler med større farger bør verifiseres, da automatisert kompensasjon kan være utsatt for over- eller underkompensasjon. Hver parameter skal grafes mot alle andre parametere for å overvåke tegn på over- eller underkompensasjon, og hver enkeltfargekontroll bør evalueres. Kompleks kompensering av større fargeeksperimenter bør utføres ved hjelp av en samarbeidspartner eller en kjernefasilitet med omfattende flowcytometrierfaring. Nyere typer strømningscytometre som spektrale cytometre utnytter hele spekteret av en fluorofor gjennom en prosess kjent som spektral unmixing, noe som kan gi et renere skille mellom fluorescerende overlapping sammenlignet med standardkompensasjon alene22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosessen med å utvikle flowcytometripaneler for immunanalyse er ofte avhengig av sammenligning av resultater med eksisterende data og litteratur på feltet. Kunnskap om hvordan populasjoner kan oppstå i flowcytometri er avgjørende for riktig tolkning av data. Uansett kan populasjoner og celletyper vises forskjellig i forskjellige vev, så noe variasjon kan forventes. I sammenheng med veldefinerte kontrollvev kan slik fargeoptimalisering evalueres mot kjent vev som har godt undersøkte celletyper. Figur 3 viser resultatene av en 14-farget FACS på kontrollmusevev. I dette tilfellet ble milten brukt til å identifisere alle markører som var farget for, og for å vise at fargingen var teknisk funksjonell. Fra dette tidspunktet ble det lettere å teste under ukjente forhold, være trygg på fluoroforvalget og optimalisere protokollen for forskjellige vevskilder. Figur 3 viser også populasjoner av ulike celletyper isolert fra en murinmilt19.
Her kunne flere åpenbare populasjoner, som Ly6G + nøytrofiler, og forskjellige ekspresjonsnivåer av Ly6C på forskjellige monocyttklasser observeres. CD11chiMHCII + dendrittiske celler var lett synlige når de ble kontrollert mot CD11b for å utelukke makrofager og andre myeloide avstamningsceller som nøytrofiler og monocytter. En undergruppe av CD206+CD86+ dendrittiske celler kunne bli funnet ved å fokusere på denne CD11c+-populasjonen. CD86 og CD206 ble inkludert i fenotype myeloide celler som å være i en mer M1-lignende (CD86hi) versus i en mer M2-lignende (CD206hi) polarisasjonstilstand. F4/80 viste en gradering av ekspresjon, som ofte kan observeres i ulike makrofagpopulasjoner. Siglec-F var tilstede i to populasjoner, F4/80+ og F4/80-, mest sannsynlig tilsvarende henholdsvis en makrofag-undergruppe og eosinofiler. Selv om disse betegnelsene på celletyper kan gjøres, er det viktig å merke seg at celler som uttrykker forskjellige markører, bør ses på en funksjonell måte i motsetning til en mer binær klassifisering. Erkjennelsen av at hva som regnes som en makrofag kan variere i milten og fremmedlegemekapselen rundt et implantat, er viktig og unngår potensiell feiltolkning av resultatene.
Figur 1: Oversikt over flowcytometrifargeprotokoll. Forberedelse inkluderer disseksjon av vevet av interesse etterfulgt av 1) manuell dicing, 2) enzymatisk fordøyelse, 3) celleanstrengelse og vasking, og 4) farging med fluorescerende merkede antistoffer etterfulgt av flowcytometrisk analyse. Illustrasjonen er laget med Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på plateoppsett for flowcytometrifarging. Denne utformingen inkluderer prøver, fluorescens minus en (FMO) kontroller, kompensasjon kontroller, og en kontroll vevsprøve (milt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater fra 14-farget FACS-farging på kontrollmusevev. Myeloid cellefenotyping av murine miltceller med eksempler på hand-gating og automatisert t-stokastisk nabo-embedding (t-SNE) klyngealgoritme for datavisning. Denne figuren er gjengitt fra Sadtler og Elisseeff19. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; SSC = side spredning; CD = klynge av differensiering; PE = phycoerythrin; CCR = C-C kjemokinreseptortype; MHC = stort histokompatibilitetskompleks; PerCP = peridinin klorofyllproteinkompleks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagens/antistoff | μL per prøve |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc-blokk | 1 |
| BD Brilliant flekkbuffer Plus | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| Totalt volum: | 50 μL |
Tabell 1: Eksempel på overflateantistoffcocktail. Et eksempel på antistoffcocktail for myeloid fenotyping av musevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne gjennomgangen beskriver en detaljert metodikk for å isolere celler fra biomaterialimplantater for å oppnå en jevn cellesuspensjon. I tillegg er det gitt en detaljert protokoll for farging av cellesuspensjonen for flerfarget flowcytometri, sammen med trinnene for å konfigurere et flowcytometer for optimale resultater. Celleisolasjonsmetoder kan involvere flere trinn, ofte ved hjelp av manuell vevsdisseksjon etterfulgt av enzymatisk fordøyelse med proteolytiske enzymer for å dissociere den ekstracellulære matrisen i vevet og forstyrre celle-cellekryssene for å frigjøre individuelle celler fra vevet. Etter fordøyelsen er det nødvendig med ytterligere behandling, for eksempel cellebelastning, for å fjerne gjenværende rusk og sikre en enkeltcellesuspensjon. Noen prøver som har høye nivåer av rusk eller andre celletyper (for eksempel svulster) kan kreve grundigere opprydding ved bruk av tetthetsseparasjonsmedier23. Uten skikkelig prøveopprydding kan data bli skjevt på grunn av rusk eller andre cellepopulasjoner som skjuler populasjonene av interesse. Overflødig rusk kan også føre til full eller delvis tilstopping av cytometerfluidikken.
Mens karakterisering av immunceller også kan utføres ved andre metoder, for eksempel lysmikroskopi, ved å utføre en differensialcelletelling på et cellecytospinpreparat, gir flowcytometri en mer nøyaktig karakterisering av cellene basert på celleoverflatemarkører. I tillegg er flowcytometridata mer presise da de kan karakterisere og kvantifisere millioner av celler i suspensjon og kan gi nøyaktige estimater av forskjellige celleundergrupper mye raskere enn manuell differensialtelling basert på bare 400 celler24. Resultatene vist i denne artikkelen er avhengige av en iterativ paneldesign med antistoffvalg gjort ved bruk av flere elektroniske verktøy for å sammenligne eksitasjons- og utslippsspektra og teoretisk overlapping avhengig av cytometerkonfigurasjonen. Når du designer større fargeeksperimenter, er det best å starte fra en ren skifer, i motsetning til tillegg til et mindre fargepanel, for å fullt ut vurdere antigen overflod, fluorofor lysstyrke og spektral overlapping.
Studier som analyserer forskjellige delmengder av spesifikke immunceller krever tilstrekkelig antall generelle celler til å utføre flowcytometri, da det å ha et mindre antall celler kan utgjøre en betydelig utfordring i isolasjonen ved cellesortering eller oppnå nøyaktige estimater. Denne utfordringen kan overvinnes ved å bruke magnetiske perler for å isolere og berike spesifikke immunceller, for eksempel nøytrofiler, i kortere perioder og med begrenset vask25. Isolerte celler fra vev i organer som lunger kan inneholde betydelige mengder slim, noe som kan gjøre cellesuspensjonen "klebrig" og resultere i et økt antall dubletthendelser under flowcytometri26,27. Tilsetning av chelaterende midler som 2 mM etylendiamintetraeddiksyre til fargebufferen kan forhindre aggregering av celler i slike prøver.
I tillegg kan suspendering av celler i et økt buffervolum også begrense dublettopprettelse ved å redusere celle-celle-interaksjoner. Fargeprosedyrer bør optimaliseres grundig for hvert enkelt vev, fargeprotokoll, flowcytometer og antistoffpanel. Noen fluoroforer kan være mer følsomme for fikseringsmidler, noen celletyper er mer følsomme for forskjellige celleisolasjons- og behandlingsmetoder, og mange celletyper oppfører seg forskjellig i forskjellige vev og forskjellige steder. Med riktig forberedelse og flittig analyse kan flowcytometri gi en detaljert cellulær og proteinnivåanalyse for å karakterisere stillaset og biomaterialets immunmikromiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet delvis av NIHs intramurale forskningsprogram, inkludert National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfraskrivelse: NIH, dets offiserer og ansatte anbefaler eller støtter ikke noe selskap, produkt eller tjeneste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
