Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Dieses Protokoll kann uns helfen, die Immunantwort des Wirts gegen verschiedene Biomaterialien zu charakterisieren, was anschließend dazu beitragen kann, bessere zukünftige medizinische Implantate zu entwickeln. Die Durchflusszytometrie liefert uns Informationen über Immunzellen, die ein Biomaterial infiltrieren, was uns hilft, Mechanismen zu bestimmen, wie Zellen auf Verletzungen und Materialimplantation reagieren, sowie Ziele für verbesserte Therapeutika. Dasselbe Protokoll kann modifiziert werden, um die Immunantwort in verschiedenen Situationen zu charakterisieren.

Sezieren Sie den Quad-Muskel von Mäusen, die vor einer Woche ein ECM-Implantat erhalten und in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern serumfreiem Medium gesammelt wurden. Zum Schluss das Gewebe mit einer Schere würfeln. Als nächstes gibst du fünf Milliliter Verdauungsenzymmedium in das Röhrchen.

Legen Sie das Röhrchen mit Verdauungsmedien und gewürfeltem Gewebe für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 100 U/min in einen Schüttelinkubator. Am Ende der Inkubationsfiltration wird die aufgegeschlossene Gewebesuspension durch ein 70-Mikron-Sieb in ein einzelnes 50-Milliliter-Röhrchen gefiltert. Verwenden Sie einen Fünf-Milliliter-Spritzenkopf, um feste Taschentücher zu zerdrücken, und waschen Sie das Sieb mit PBS bei Raumtemperatur.

Entsorgen Sie alle verbleibenden Rückstände im Sieb und stellen Sie das Volumen des Röhrchens auf 50 Milliliter mit PBS bei Raumtemperatur ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 10 Milliliter kalter fünf-Millimolar-EDTA-Lösung in PBS. Wenn Blutzellen in der Probe vorhanden sind, wird das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert, 10 Minuten lang inkubiert und dann neun Milliliter EDTA hinzugefügt.

Lassen Sie die Suspension 10 Minuten auf Eis. Stellen Sie dann die Lautstärke mit kaltem PBS auf 50 Milliliter ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets und 100 Mikroliter kaltes PBS.

10 Mikroliter der Suspension in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 10 Mikrolitern Trip und Blau zum Zählen mischen. Geben Sie das verbleibende Zellvolumen in jede Vertiefung einer V-Boden-96-Well-Platte. Entnehmen Sie 20 Mikroliter Zellen aus der Vertiefung und geben Sie sie in eine neue Vertiefung, um sie als ungefärbte Kontrolle zu verwenden.

Verwenden Sie dann PBS, um das endgültige Volumen in jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter zu bringen. Sammeln Sie die Zellen am Boden der Plattenvertiefungen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern einer Konzentration von eins bis 1000 Lebensfähigkeitsfarbstoff pro Well. Am Ende der Inkubation wird jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern frischem PBS gewaschen und die Pellets in 200 Mikroliter Färbepuffer pro Vertiefung resuspendiert.

Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern einer bis 100-fachen Verdünnung des Monozytenblockers. Inkubieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang auf Eis und fügen Sie dann 50 Mikroliter Antikörpercocktail hinzu. 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis inkubieren.

Anschließend werden die Vertiefungen mit 100 Mikrolitern Färbepuffer pro Vertiefung gewaschen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und waschen Sie sie mit 200 Mikrolitern Färbepuffer. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male, gefolgt von der Resuspension der Zellen in 400 Mikroliter Färbepuffer.

Bevor Sie die Probe analysieren, führen Sie eine ungefärbte Probe aus, damit die Zellpopulation in einem Seitenstreudiagramm im Vergleich zu einem Vorwärtsstreudiagramm angepasst werden kann. Führen Sie als Nächstes die gefärbte Probe aus. Extrahieren Sie die autofluoreszierende Signatur.

Importieren Sie dann die FCS-Dateien, um sie als Steuerelement für die Entmischung zu verwenden. Klicken Sie auf das Symbol zum Aufheben der Entmischung, um den Assistenten zum Aufheben der Entmischung zu öffnen, und führen Sie die Entmischung mit allen Steuerelementen für einzelne Farben durch, indem Sie die positiven und negativen Populationen ansteuern. Klicken Sie als Nächstes auf den Abschnitt QC und sehen Sie sich den Komplexitätsindex an.

Der Komplexitätsindex ist ein Maß dafür, wie unterscheidbar eine Sammlung von spektralen Signaturen ist, wenn die spektralen Signaturen nicht miteinander vermischt sind. Zum Schluss können Sie das Sample entmischen, indem Sie auf Live Unmix klicken. Hier können die Ergebnisse einer 14 Farbfakten an Kontroll-Mausgewebe beobachtet werden.

In dieser Analyse konnten mehrere Lobbyisten-Populationen, wie z.B. ly6g-positive Neutrophile und ly6c-Monozytenklassen mit mittlerer und hoher Expression beobachtet werden. CD11c-hohe MHC-zwei positive dendritische Zellen waren leicht zu erkennen, wenn sie gegen CD11b gerichtet wurden, um Makrophagen und andere myeloische Zellen wie Neutrophile und Monozyten auszuschließen. Eine Untergruppe von CD206-positiven CD86-positiven dendritischen Zellen konnte identifiziert werden, indem man sich auf diese CD11c-positive Population konzentrierte, die sowohl CD86 hohe M1-ähnliche dendritische Zellen als auch CD206 hohe M2-ähnliche dendritische Zellpopulationen umfasst.

F4/80 zeigte einen Expressionsgradienten, wie er häufig in verschiedenen Makrophagenpopulationen beobachtet wird. Siglec-F war sowohl in F4-80-positiven als auch in negativen Populationen vorhanden, was höchstwahrscheinlich einer Makrophagen-Untergruppe bzw. Eosinophilen entspricht. Obwohl die Färbung mit Zelloberflächenmarkern diese Bezeichnungen von Zelltypen ermöglicht, ist es wichtig zu beachten, dass Zellen, die verschiedene Marker exprimieren, auf funktionelle Weise und nicht auf eine eher binäre Klassifizierung betrachtet werden sollten.

Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, denken Sie daran, dass das Verständnis der autofluoreszierenden Signatur Ihrer unterfärbten Proben vor dem Entwerfen Ihres Panels der Schlüssel ist, um eine bessere und gemischte Wirkung zu erzielen. Neben der Analyse von Zellen können die isolierten Zellen in spezifische Populationen sortiert werden, um sie mit zellulären Assays, in vitro, transkriptomischer Analyse oder für mikroskopische Analysen zur Bewertung der Zellmorphologie auszuwerten. Die zunehmende Komplexität der durchflusszytometrischen Analysen von Biomaterialien trägt dazu bei, die Lücke zwischen grundlegenden immunologischen Studien und der Entwicklung neuer Therapeutika zu schließen.