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Methodenartikel

Systematischer Ansatz zur Identifizierung neuartiger antimikrobieller und Antibiofilmmoleküle aus Pflanzenextrakten und -fraktionen zur Vorbeugung von Zahnkaries

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DOI:

10.3791/61773

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31. März 2021

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Natürliche Produkte sind vielversprechende Ausgangspunkte für die Entwicklung neuer Medikamente und therapeutischer Mittel. Aufgrund der hohen chemischen Vielfalt ist es jedoch eine anspruchsvolle und zeitaufwändige Aufgabe, neue therapeutische Verbindungen aus Pflanzen zu finden. Wir beschreiben einen vereinfachten Ansatz zur Identifizierung von antimikrobiellen und antibiofilmen Molekülen aus Pflanzenextrakten und -fraktionen.

Zusammenfassung

Natürliche Produkte liefern strukturell unterschiedliche Substanzen, mit einer Vielzahl von biologischen Aktivitäten. Die Identifizierung und Isolierung von Wirkstoffen aus Pflanzen ist jedoch aufgrund der komplexen Pflanzenmatrix und der zeitaufwändigen Isolations- und Identifizierungsverfahren eine Herausforderung. Daher wird ein schrittweiser Ansatz zum Screening natürlicher Verbindungen aus Pflanzen, einschließlich der Isolierung und Identifizierung potenziell aktiver Moleküle, vorgestellt. Es umfasst die Sammlung des Pflanzenmaterials; Herstellung und Fraktionierung von Rohextrakten; Chromatographie und Spektrometrie (UHPLC-DAD-HRMS und NMR) Ansätze zur Analyse und Identifizierung von Verbindungen; Bioassays (antimikrobielle und antibiobiofilmische Aktivitäten; bakterielle "Haftfestigkeit" an der Speicheldrüsenpellicle und anfängliche Glucan-Matrix, die mit ausgewählten Behandlungen behandelt werden); datenanalyse. Das Modell ist einfach, reproduzierbar und ermöglicht eine konsistente Steuerung von Hochdurchsatzuntersuchungen mehrerer Verbindungen, Konzentrationen und Behandlungsschritte. Die gewonnenen Daten bilden die Grundlage für zukünftige Studien, einschließlich Formulierungen mit den aktivsten Extrakten und/oder Fraktionen, Isolierung von Molekülen, Modellierung von Molekülen zu spezifischen Zielen in mikrobiellen Zellen und Biofilmen. Ein Ziel zur Kontrolle des karogenen Biofilms besteht beispielsweise darin, die Aktivität von Streptococcus mutans Glucosyltransferasen zu hemmen, die die Glucane der extrazellulären Matrix synthetisieren. Die Hemmung dieser Enzyme verhindert den Biofilmaufbau und verringert seine Virulenz.

Einleitung

Die frühesten Modelle der Medizin, die in Gesellschaften verwendet wurden, basierten auf natürlichen Produkten (NPs). Seitdem sucht der Mensch nach neuen Chemikalien in der Natur, die in Medikamente umgewandelt werden können1. Diese Suche führte zu einer kontinuierlichen Verbesserung der Technologien und Methoden für ethnobotanische Screening1,2,3. NPs bieten eine reiche Quelle strukturell vielfältiger Substanzen, mit einer breiten Palette von biologischen Aktivitäten, die für die Entwicklung alternativer oder adjuvanser Therapien nützlich sind. Die inhärente komplexe Pflanzenmatrix macht die Isolierung und Identifizierung der Wirkstoffe jedoch zu einer anspruchsvollen und zeitaufwändigen Aufgabe4.

NPs-basierte Medikamente oder Formulierungen können verwendet werden, um zu verhindern und/oder behandeln mehrere Bedingungen, die oral, einschließlich Zahnkaries4. Zahnkaries, eine der weltweit am weitesten verbreiteten chronischen Krankheiten, ergibt sich aus der Wechselwirkung von zuckerreicher Ernährung und mikrobiellen Biofilmen (Zahnbelag), die auf der Zahnoberfläche gebildet werden, was zu einer Demineralisierung führt, die durch organische Säuren verursacht wird, die aus dem mikrobiellen Stoffwechsel gewonnen werden, und wenn sie nicht behandelt werden, führt zu Zahnverlust5,6. Obwohl andere Mikroorganismen assoziiert werden können7, Streptococcus mutans ist ein kritisches karogenes Bakterium, weil es sauerogen ist, saure, und ein extrazellulärer Matrix-Builder. Diese Art kodiert mehrere Exoenzyme (z.B. Glykosyltransferasen oder Gtfs), die Saccharose als Substrat8 verwenden, um die extrazelluläre Matrix zu bilden, die reich an Exopolysacchariden ist, die eine Virulenzdeterminantesind 9. Auch der Pilz Candida albicans kann die Produktion dieser extrazellulären Matrix7antreiben. Obwohl Fluorid, das in verschiedenen Modalitäten verabreicht wird, die Grundlage für die Vorbeugung von Zahnkaries10bleibt, sind neue Ansätze als Hilfsstoffe erforderlich, um seine Wirksamkeit zu erhöhen. Darüber hinaus basieren die verfügbaren Anti-Plaque-Modalitäten auf der Verwendung von Breitspektrum-Mikrobiziden (z. B. Chlorhexidin)11. Als Alternative sind NPs mögliche Therapien zur Kontrolle von Biofilmen und zur Vorbeugung von Zahnkaries12,13.

Der weitere Fortschritt bei der Entdeckung neuer bioaktiver Verbindungen aus Pflanzen umfasst notwendige Schritte oder Ansätze wie: i) die Verwendung zuverlässiger und reproduzierbarer Protokolle für die Probenahme, wenn man bedenkt, dass Pflanzen häufig intraspezifische Variabilität aufweisen; ii) die Herstellung umfassender Extrakte und ihrer jeweiligen Fraktionen in kleinem Maßstab; iii) bei der Charakterisierung und/oder Dereplikation ihrer chemischen Profile die Erfassung multidimensionaler Daten wie GC-MS, LC-DAD-MS oder NMR, z. B. angenommen; iv) die Verwendung tragfähiger und ertragsfähiger Modelle zur Bewertung der Bioaktivität; v) die Auswahl potenzieller neuer Treffer auf der Grundlage multivariater Datenanalysen oder anderer statistischer Instrumente; vi) die Isolierung und Reinigung der zielgerichteten Verbindungen oder vielversprechenden Kandidaten durchzuführen; und (vii) die Validierung der entsprechenden biologischen Tätigkeiten unter Verwendung der isolierten Verbindungen2,14.

Dereplikation ist der Prozess der schnellen Identifizierung bekannter Verbindungen in Rohextrakt und ermöglicht die Unterscheidung neuartiger Verbindungen von denen, die bereits untersucht wurden. Außerdem verhindert dieser Prozess die Isolierung, wenn bioaktivität bereits für bestimmte Verbindungen beschrieben wurde, und es ist besonders hilfreich, "häufige Hitter" zu erkennen. Es wurde in verschiedenen ungezielten Arbeitsabläufen eingesetzt, von der großen zusammengesetzten Identifizierung oder der Beschleunigung der aktivitätsgesteuerten Fraktionierung bis hin zur chemischen Profilerstellung von Extraktsammlungen. Es kann vollständig in metabolomische Studien für die ungezielte chemische Profilierung von CE oder die gezielte Identifizierung von Metaboliten integriert werden. All dies führt letztlich dazu, Extrakte vor den Isolationsverfahren1,15,16,17zu priorisieren.

Daher beschreiben wir im vorliegenden Manuskript einen systematischen Ansatz zur Identifizierung antimikrobieller und antibiofilmieller Moleküle aus Pflanzenextrakten und -fraktionen. Es umfasst vier multidisziplinäre Schritte: (1) Sammlung von Pflanzenmaterial; (2) Herstellung von Rohextrakten (CE) und Fraktionen (CEF), gefolgt von ihrer Analyse des chemischen Profils; (3) Bioassays; und (4) biologische und chemische Datenanalysen (Abbildung 1). So präsentieren wir das Protokoll entwickelt, um die antimikrobiellen und antibiofilmischen Aktivitäten von Casearia sylvestris Extrakte und Fraktionen gegen Streptococcus mutans und Candida albicans13zu analysieren, sowie die Verfahren für die phytochemische Charakterisierung und Datenanalyse. Der Einfachheit halber liegt der Fokus dabei darauf, den Ansatz zum Screening natürlicher Verbindungen mit dem Bakterium zu demonstrieren.

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Abbildung 1: Flussdiagramm des Systematischen Ansatzes zur Identifizierung aktiver Moleküle aus Pflanzenextrakten und -fraktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

1. Sammlung von Pflanzenmaterial

  1. Pflanzenmaterial
    1. Zeichnen Sie den Zugang zu Pflanzenmaterial auf elektronischen Plattformen auf, die den Zugang zum genetischen Erbe in dem Land regeln, in dem die Sammlung stattfinden wird. Melden Sie sich beispielsweise in Brasilien beim National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge – SisGen (Website https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx) an.
    2. Sammeln Sie Proben des Pflanzenmaterials von Interesse (z. B. Blätter, Stiele, Wurzeln, Blumen, Früchte). Registrieren Sie, ob das Material während der Fortpflanzungs- oder Vegetativphase gesammelt wurde.
    3. Zeichnen Sie die Erfassungsparameter auf (Datum, Georeferenzierung, durchschnittliche Jahrestemperatur und mittlerer Feuchtigkeitsprozentsatz).
    4. Identifizieren Sie die Proben genau, und ein Taxonom muss die Echtheit bestätigen.
  2. Stabilisierung und Lagerung von Pflanzenproben
    1. Separate Pflanzenorgane in einzelnen Plastiktüten oder Flaschen unmittelbar nach der Sammlung.
    2. Potentien mögliche enzymatische Reaktionen durch (i) sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff, (ii) Dehydrieren in einem zirkulierenden Luftofen (40 °C) oder (iii) Gefriertrocknung der Proben durch Lyophilisierung.
    3. Bewahren Sie das stabilisierte Material in hermetisch verschlossenen Säcken bei Raumtemperatur oder in einem Gefrierschrank bis zum Gebrauch auf (-20 oder -80 °C, je nach Lagerzeit oder Verwendungszweck).
    4. Schleifen Sie die Proben in einer analytischen Mühle (Messer oder Kugel, je nach Gewebetyp oder Verfügbarkeit) und standardisieren Sie die Partikelgröße mit standardisierten Sieben.
    5. Wiegen Sie die Proben einzeln für die nachfolgenden Extraktionsschritte.

2. Herstellung von Rohextrakten (CE) und Fraktionen (CEF) zur chemischen Profilanalyse und Bioassays

  1. Herstellung von Rohextrakten (CE)
    HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 2Adargestellt.
    1. Bereiten Sie ein Extraktionslösungsmittel mit einem hydroalkoholischen Gemisch (z. B. Ethanol (EtOH) 70% oder ternäre Mischungen von Wasser, EtOH und anderen Modifikatoren, definiert durch die experimentelle Konstruktion von nach früheren Berichten definiert).
    2. Verwenden Sie das Verhältnis Probengewicht (Trockengewicht, mg)/ Extraktionslösungsmittel (ml) von 50 bis 100 mg für jede ml Lösungsmittel.
    3. Für schnelle und reproduzierbare Extraktionen verwenden Sie Chargenextraktionen mit Mikroröhren.
      HINWEIS: An dieser Stelle sollten mindestens drei Replikationen verwendet werden, um statistische Analysen zu ermöglichen.
    4. Führen Sie Ultraschall-unterstützte Extraktionen (VAE) durch, um es schnell, einfach und billig zu machen.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal (jeweils 15 min) für die beste Effizienz.
    6. Nach jedem Extraktionsschritt den festen Rückstand durch Zentrifugation dekantieren und den Überstand entfernen.
    7. Kombinieren Sie die Überstande einzeln, filtern und speichern Sie Aliquots für gleichzeitige chemische Analysen und Bioassays. Entfernen Sie bei Bedarf das Extraktionslösungsmittel unter Vakuum, Stickstofffluss oder Lyophilisierung, und registrieren Sie das Gewicht und die Ausbeute.
    8. Bei -20 °C lichtgeschützt aufbewahren.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, um das CE zu überprüfen und die Protokolle auszuwählen, die die gewünschte Aktivität darstellen.
  2. Fraktionierung von Rohextrakten (CEF)
    HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 2Bdargestellt.
    1. Verwenden Sie Patronen mit mindestens 1 g Adsorbierung. Wenn Alkaloide potenziell im CE vorhanden sind, verwenden Sie Lösungsmittel, die 0,1 % Ameisensäure (FA) enthalten.
    2. Verdünnung der Probe in dem am besten geeigneten Lösungsmittel (oder Lösungsmittelgemisch), um eine 100 mg/ml Probenlösung zu erhalten. Dann übertragen Sie 1 ml der Probenlösung auf eine vorkonditionierte Festphasen-Extraktionspatrone - SPE (1 g Adsorbent, 6 ml Kapazität).
    3. Führen Sie die Fraktionierung mit etwa drei toten Volumen jedes Extraktionseluents (zu einer Patrone von 1 g, es entspricht 2 ml jedes Lösungsmittel). Wenn Alkaloide potenziell im CE vorhanden sind, verwenden Sie Lösungsmittel, die 0,1 % FA enthalten.
    4. Sammeln Sie eine Fraktion nach Eluentenzusammensetzung und sparen Sie Aliquots für simultane chemische Analysen und Bioassays.
    5. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum, Stickstofffluss oder Lyophilisierung und registrieren Sie das Gewicht und die Ausbeute.
      HINWEIS: Wenn das CE in der ursprünglichen Elutionsmischung schwer aufzulösen ist, dispergieren Sie das CE in einer festen Phase (z. B. C18 oder Celite) im Verhältnis 1:1 (w/w), bevor Sie das Material auf die Oberseite der Patrone laden.
      ACHTUNG: Wiegen Sie die Mikroröhren im Voraus, um die Massenausbeute von Extrakten und Fraktionen zu berechnen.
  3. Chemische Profilerstellungsanalyse
    HINWEIS: Wenn man bedenkt, dass jede Pflanzenart optimierte und spezifische Methoden für ihre chemische Analyse erfordert, beschreiben wir in den folgenden Abschnitten die häufigsten analytischen Ansätze zur Analyse von Pflanzenmaterialien. Als praktisches Beispiel wurde eine Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie entwickelt und validiert für die simultane Analyse von Phenolverbindungen und Clerodan-Typ Diterpene differential biosynthetisiert durch zwei Sorten von Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). Das UPLC-DAD Gerät war mit einem Entgaser, einer Quaternärpumpe, einem automatischen Sampler, einem UV-Vis Photodioden-Arraydetektor und einem Ofen ausgestattet (siehe Details in Bueno et al. 201518). Ähnliche Ansätze, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden, können je nach anderen Pflanzenarten und/oder Pflanzenmaterialien optimiert werden.
    1. Chromatographische Analyse- und Silbentrennungsmöglichkeiten
      1. Verwenden Sie für Separationen mit ultrahoher Flüssigkeitschromatographie (UPLC) eine chromatographische C18-Säule (z. B. 150 × 2,1 mm, 2,6 m, 100 ,), die durch eine kompatible Vorsäule geschützt ist.
        HINWEIS: Je nach Pflanzenart/Material können andere Säulenphasen oder chromatographische Modi verwendet werden. Herkömmliche HPLC können auch verwendet werden; in diesem Fall ist eine geeignete chromatographische Säule zu wählen. Um hervorragende Trennungen zu erzielen, passen Sie die chromatographischen Bedingungen unter Berücksichtigung der Durchflussrate (L/min), der Säulentemperatur (°C) und des Injektionsvolumens (L) an. Die mobile Phase besteht in der Regel aus Wasser (A) und Acetonitril oder Methanol (B) unter Verwendung linearer oder mehrstufiger Elutionsgradienten oder isotratischer Elution. Modifikatoren wie Puffer, Säuren, Basen oder andere können ebenfalls verwendet werden.
      2. Führen Sie die Pflanzenmaterialanalyse (CE und/oder CEF) durch und registrieren Sie alle zugehörigen Daten, wie z. B. Spektraldaten (mit UV-Vis und/oder bevorzugt MS-Detektoren), Aufbewahrungszeit (min) und andere, abhängig von der verfügbaren Silbentrennung.
        HINWEIS: Die Flüssigchromatographie (LC) ist in der Regel mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) als LC-HRMS (gekoppelt) und wird häufig für die schnelle Annotation von Metaboliten in CE ou CEF15verwendet.
      3. Wenn qualitative Daten erforderlich sind und quantitative Daten erforderlich sind, bereiten Sie sorgfältig Kalibrierkurven vor und injizieren Sie sie nach demselben Protokoll.
        HINWEIS: Die Entwicklung der besten chromatographischen Bedingungen kann mit Hilfe der Gestaltung von Experimenten durchgeführt werden, wie von Bueno et al. 201518beschrieben, oder ähnliche Literatur. Es ist wichtig, die Einbeziehung interner Standards bei der Methodenentwicklung zu berücksichtigen. Sie werden sehr geschätzt, da sie korrekte technische Abweichungen während der Probenvorbereitung und Injektionen und eine weitere Normalisierung für die Datenanalyse ermöglichen.
  4. Univariate und multivariate Datenanalyse
    1. Exportieren Sie die registrierten Chromatogramme in einem geeigneten Format (z.B. ASCII, .txt. oder .csv Format). Eine einzelne Datenmatrix kann durch Verbinden und Ausrichten der Chromatogramme festgelegt werden, wenn mehrere Proben analysiert werden und Vergleiche erforderlich sind. Die resultierenden Matrizen müssen die Chromatogramme entsprechend dem verwendeten internen Standard normalisiert werden.
    2. Analysieren Sie die Daten der Pflanzenmetabolomik mit multivariaten und univariaten Methoden. Erforschen und visualisieren Sie Metabolomics-Datasets durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Variablen mit multivariaten statistischen Methoden, einschließlich unbeaufsichtigter Hauptkomponentenanalyse (PCA) und hierarchischer Clustering-Analyse (HCA), oder überwachter partieller Analyse der kleinsten Quadrate (z. B. PLS, OPLS, PLS-DA). Univariate Methoden wie ANOVA, Student's, Tukey und Welch es t-test sind besonders interessant für die genaue Analyse quantitativer Unterschiede zwischen den Proben19.
  5. Dereplikation und Verbindungen Anmerkung
    HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist die schnelle Online-Identifikation bekannter NPs, um eine mühsame Isolierung zu vermeiden, die gleichzeitig mit der uni- oder multivariaten Datenanalyse durchgeführt werden kann.
    1. Führen Sie die Identifikationsstufen der nachgewiesenen oder Zielverbindungen aus:
      1. Identifizierte Verbindung, einschließlich vollständiger 3D-Struktur und Stereochemie (Stufe 0);
      2. Identifizierung durch zwei orthogonale Parameter, wie Retentionszeit und MS/MS-Spektrum (Stufe 1);
      3. Angeblich annotierte Verbindungen und zusammengesetzte Klassen (Stufen 2 und 3);
      4. Nicht identifizierte oder nicht klassifizierte Metaboliten, die anhand analytischer Daten (Stufe 4)19,20unterschieden werden können.
    2. Charakterisieren Sie die bekannten Verbindungen anhand der kommerziellen oder öffentlichen Datenbanken. Unter den wichtigsten Datenbanken können hervorgehoben werden: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) und die Global Natural Products Social Molecular Networking – GNPS-Datenbank (https://gnps.ucsd.edu)19.
      HINWEIS: Es gibt verschiedene Ebenen von Anmerkungen und sie hängen von der binlegierten Technik ab, die während der Studie verwendet wird, und können Folgendes umfassen: die Unterstützung von MS- (oder NMR) basierten Spektraldatenbanken und in silico spektralen Vorhersagealgorithmen.
    3. Isolierung, Reinigung und vollständige zusammengesetzte Identifizierung
      HINWEIS: Wenn eine bestimmte Verbindung (deren Identität durch die statistischen Methoden vermutet wurde) eine vollständige strukturelle Identifizierung benötigt, besteht der erste Schritt, um diese Aufgabe zu erfüllen, darin, die gewünschten Verbindungen in größerem Maßstab zu isolieren und zu reinigen. Dies kann durch Skalieren der bereits entwickelten Protokolle erreicht werden.
      1. Führen Sie die schnelle und direkte Isolierung der Zielverbindung(en) durch präparative chromatographische Techniken, die gut etabliert und optimiert sind. Semipräparative HPLC mit Trockenlasteinspritzung kann verwendet werden, um die Kompromisse zu vermeiden, die in der Regel zwischen hoher Belastung und Probenlösung1gemacht werden müssen.
      2. Erreichen Sie die vollständige strukturelle Charakterisierung und Identifizierung isolierter Verbindungen. Dies kann durch die Kombination verschiedener Techniken erfolgen:
        1. Kernspinresonanz (NMR);
        2. Massenspektrometrie (MS);
        3. Spektrometrische Techniken in den Regionen Ultraviolett (UV) und Infrarot (IR) sind ebenfalls sehr nützlich für die Charakterisierung der funktionellen Gruppen;
        4. Der Einsatz von chiroptischer Spektroskopie wie elektronischer und schwingungsförmiger kreisförmiger Dichroismus (EkD bzw. VCD), Raman-Optik (ROA) und Röntgenkristallographie sind wichtige Techniken zur absoluten Konfigurationscharakterisierung.

3. Bioassays

HINWEIS: Biologisches Screening: Um die potenzielle Bioaktivität von CE und CEF schnell zu bewerten, sollte das erste Screening natürlicher Substanzen organisiert und unkompliziert erfolgen.

  1. Vorbereitung von CE und CEF für Bioassays
    1. Rekonstituieren Sie die Trockenmasse mit den bestmöglichen Lösungsmitteln (die experimentell bestimmt werden können). Das experimentelle Design21,22 definiert die Stammlösung und die Konzentration von Lösungsmitteln.
    2. Berechnen Sie die Lösungsmittelkonzentration der Lagerlösung. Verwenden Sie dazu die Formel: C1 x V1 = C2 x V2, wobeiC1 die Stammlösung (mg) von CE und/oder CEF darstellt; V1 stellt das Lösungsmittelvolumen dar; C2 ist das Gewicht des CE und/oder CEF; V2 ist das Endvolumen (ml) der Lagerlösung.
      HINWEIS: Wir haben beispielsweise 84,15 % EtOH und 15 % Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittelkonzentration der Stammlösung ausgewählt. Wir haben die Lagerkonzentration des CE auf 6 mg/ml und des CEF auf 1 mg/ml13vorbereitet. Das Lösungsmittel zur Verdünnung des CE und der CEF hängt von der Methode der Bewertung der biologischen Aktivität ab. Das als Fahrzeug verwendete Lösungsmittel darf die biologische und toxikologische Aktivität nicht beeinträchtigen. Typischerweise wird Wasser, DMSO, EtOH oder ein wässriges Lösungsmittel auf Basis von EtOH verwendet, um Pflanzenextrakte oder Pflanzenderivate4,13zu löslich.
  2. Vorbereitung von Prüforganismen
    1. Reaktivieren Sie einen mikrobiellen Stamm, z. B. S. mutans UA159 on blood agar (48 h, 37 °C, 5% CO2), und kultur it in liquid culture medium (z.B. Tryptone-Hefe-Extraktbrühe [TYE: 2,5% (w/v) Trypton mit 1,5% (w/v) Hefeextrakt] mit 1% Glucose (w/v) (TYEg) für 16 h, 37 ° C, 5%CO2.
    2. Führen Sie eine Verdünnung der Ausgangskultur des Mikroorganismus um 1:20 in demselben Kulturmedium durch (das Verdünnungsverhältnis der Anfangskultur kann sich je nach experimentellem Design ändern).
    3. Inkubieren, bis es die Wachstumsphase in der Mitte des Protokolls erreicht.
    4. Bereiten Sie das Inokulum für Bioassays mit einer definierten Population (z. B. 2x106 koloniebildende Einheiten pro Milliliter - KBE/ml) in TYEg für antimikrobielle Assays und TYE mit 1% Saccharose (w/v) (TYEs) für Biofilme-Assays vor.
      HINWEIS: Die Wachstumsbedingungen hängen vom getesteten Mikroorganismus ab.
  3. Antimikrobielle Aktivität
    HINWEIS: Die Schritte sind in Abbildung 3dargestellt.
    1. In einer 96-Well-Platte fügen Sie eine Aliquot(L) der CE- und/oder CEF-Lagerlösung (Behandlungen) hinzu. Das Volumen des Aliquots wird durch die Testkonzentration definiert, die auf der Grundlage früherer Studien ausgewählt werden muss. Um z. B. CE bei der Testkonzentration von 0,5 mg/ml zu testen, verwenden Sie ein Aliquot der Stammlösung von 16,67 l bei 6 mg/ml. Verwenden Sie für diese Berechnung die Formel: C1 x V1 =C2 x V2, wobeiC1 die Lagerkonzentration ist,V1 das Volumen der Stammlösung aliquot,C2 die Testkonzentration undV2 das Volumen der 96-Well-Platte (was 200 l entspricht). In diesem versuchsweise Zustand beträgt die Testkonzentration der Lösungsmittel (Fahrzeug) 7% EtOH und 1,25% DMSO.
    2. Fügen Sie eine Reihe von Kontrollen für jede Platte: eine Säule mit Behandlungen, ohne das Inokulum (leere Kontrolle pro Behandlung, helfen, Trübung durch die Behandlung selbst von mikrobiellem Wachstum zu unterscheiden); eine Säule mit Fahrzeug und Inokulum (Verdünnung stagnisiert CE oder CEF oder 0 mg/ml-Kontrolle); eine Spalte mit nur dem Kulturmedium (Kulturmedium Kontrolle) und einer Spalte mit nur inoculum (mikrobielle Wachstumskontrolle).
    3. Passen Sie mit TYEg die Lautstärke auf 100 l an. Als nächstes inkubieren, zum Beispiel, 24 h, 37 °C, 5%CO2 (je nach getesteten Mikroorganismen).
    4. Impfen Sie 100 l Mikroorganismus Inokulum (1x 106 KBE/ml) in die 96-Well-Platte.
    5. Analysieren Sie das Bakterienwachstum nach Trübung durch visuelle Inspektion der Brunnen (klar oder trüb). Klar: bedeutet, dass es kein visuelles Wachstum des Mikroorganismus gibt. Bewölkt: bedeutet, dass es ein visuelles Wachstum des Mikroorganismus gibt.
    6. Messung der Absorption (optische Dichte oder O.D.) der Bakterienkultur in jedem Brunnen (ELISA-Leser mit 540 nm). Als nächstes übertragen Sie 100 l der Kulturen auf Mikroröhren, die 900 l Der Salinelösung (0,89 % NaCl) enthalten, durch Wirbeln gut vermischen. Fahren Sie als Nächstes mit einer zehnfachen seriellen Verdünnung bis zum gewünschten Wert fort.
    7. Impfen Sie ein Aliquot der gewünschten Verdünnung in bestimmten Agarplatten (in Duplikat). Zum Beispiel 10 l einer spezifischen Verdünnung auf Blut-Agar-Platten.
    8. Inkubieren. Die Bedingungen können sich zwischen Mikroorganismen ändern, z. B. S. Mutane: 48 h, 37 °C, 5%CO2.
    9. Führen Sie Koloniezählt auf den Platten für die spätere Umwandlung in CFU/mL als (EineAnzahl von Kolonien x 10n)/q. In dieser Formel entsprichtn dem absoluten Wert der Verdünnung (0, 1, 2 oder 3), und q entspricht dem Betrag in ml, der für jede auf der Agarplatte plattierte Verdünnung pipettiert wird. Außerdem kann die CFU/mL in Protokollwerte konvertiert werden.
      HINWEIS: Wenn Pflanzenextrakte dem Kulturmedium zugesetzt werden, kann es zu Ausfällungen von Partikeln aus den Extrakten kommen. Diese Tatsache kann es schwierig machen, die Ergebnisse zu interpretieren. Dasselbe tritt auf, wenn ein Mikroplattenleser die Trübung misst, da in einigen Fällen Zellen an der Unterseite der Mikroplatte verklumpen. Darüber hinaus kann die Farbe der Pflanzenblattextrakte je nach verwendetem Extrakt die Quantifizierung der Trübung23,24erschweren. Eine alternative Methode verwendet Farbstoffe, die zeigen, ob die mikrobiellen Zellen metabolisch aktiv sind oder nicht24.
  4. Antibiofilm-Aktivität
    ANMERKUNG: Die Schritte zur Bewertung der Auswirkungen von Behandlungen auf die Biofilmbildung sind in Abbildung 4dargestellt.
    1. Bildung und Verarbeitung von Biofilmen
      1. Verdünnung der Behandlungen im Kulturmedium (TYEs) in einer 96-Well-Platte, wie in den Schritten des Antimikrobiellen Aktivitätsprotokolls beschrieben.
      2. Inkubieren Sie die Platte. Im Beispiel mit S. mutans wird die Inkubation während 24 h, bei 37 °C und 5%CO2durchgeführt.
      3. Nach der Inkubation die Platten auf einen Orbitalshaker (5 min, 37 °C, 75 Umdrehungen pro Minute) legen, um die Zellen zu lösen, die nicht am Biofilm haften. Entsorgen Sie dann das Kulturmedium, das die nicht haftenden Zellen enthält, und waschen Sie die restlichen Biofilme dreimal mit 0,89% NaCl, um nicht anhaftende Zellen zuentfernen.
    2. Quantifizierung von Biomasse aus behandelten Biofilmen
      HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 4Adargestellt.
      1. Bewahren Sie die Biofilme auf der Platte auf und fügen Sie jedem Brunnen 50 L 1% kristallviolette wässrige Lösung hinzu.
      2. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 35 min.
      3. Waschen Sie die gebeizten Brunnen mit MilliQ-Wasser (dreimal) und trocknen Sie sie dann 60-90 min an der Luft.
      4. Elute das Kristallviolett aus den gebeizten Brunnen mit 200 l von 99% EtOH durch Inkubation der Platte in einem Orbital-Shaker (5 min, 37 °C, 75 U/min).
      5. Übertragen Sie einen 150 L Aliquot aus jedem Brunnen mit dem eluierten Farbstoff auf eine andere Platte und quantifizieren Sie die Probenbiomasse (ELISA-Leser 570 nm).
    3. Quantifizierung der lebensfähigen mikrobiellen Population (KFU/ml) der behandelten Biofilme
      HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 4Bdargestellt.
      1. Entfernen Sie die gewaschenen Biofilme mit einer Pipette und 200 l NaCl 0,89% von der Platte und übertragen Sie die resultierende Suspension einzeln auf sterile Mikroröhrchen.
      2. Verwenden Sie eine zusätzliche 200 l NaCl 0,89% pro Bohrgut und übertragen Sie sie in das entsprechende Rohr, das bereits 200 l der ursprünglichen Biofilmsuspension enthält. Führen Sie diesen Prozess durch, bis eine Gesamtsuspension von 1 ml Biofilm pro Originalbrunnen erreicht ist.
      3. Verwenden Sie ein Aliquot aus jedem Rohr, um eine zehnfache serielle Verdünnung durchzuführen.
      4. Impfen Sie ein Aliquot der gewünschten Verdünnung in bestimmten Agarplatten (in Duplikat). Zum Beispiel 10 l einer spezifischen Verdünnung auf Blut-Agar-Platten.
      5. Inkubieren Sie Agarplatten (z. B. 48 h, 37 °C, 5%CO2), und zählen Sie dann die Kolonien, um die CFU/ml wie oben beschrieben zu bestimmen.
  5. Phase der biologischen Aktivitätsvalidierung
    1. Salivary Pellicle Formation
      1. Verwenden Sie Hydroxyapatit (HA) Perlen (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Typ I 80 'm) als Oberfläche, um den Speicheldrüsenfilm25zu bilden. Diese Perlen Oberfläche imitieren Zahnschmelz.
      2. Die HA-Perlen (z.B. 10 mg) in Mikroröhrchen wiegen und sterilisieren. Verwenden Sie dann Adsorptionspuffer (AB-Puffer: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, in dd-H2O, pH 6.5]25 mit 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,02% Natriumazid (NaN3), um die Perlen zu waschen.
      3. Sammeln und bereiten menschlichen Speichel26. Es ist notwendig, dass die institutionellen Ethikkommission enden wird.
      4. 500 L Speichel in Mikroröhren geben und brüten (40 min, 37 °C, 24 U/min).
      5. Als nächstes entfernen Sie den Speichelüberstand und waschen Sie die Perlen (dreimal mit AB-Puffer mit PMSF und NaN3). Die sHA-Perlen (HA-Perle mit Speichelel-Pellicle) sind nun für nachgeschaltete Assays bereit.
        HINWEIS: Speichel wird von gesunden Freiwilligen gesammelt. Nach der Entnahme den Speichel (1: 1 v/v) mit AB-Puffer und Zentrifuge (1699 x g, 20 min, 4 °C) verdünnen. Sterilisieren durch Filtration (Polyethersulfon-Membranfilter mit geringer Bindung an 0,22 m Proteine)26. Die Institutional Ethics Committee muss der Studie zustimmen. In unserem Fall hat die Ethikkommission der Institution die Studie genehmigt (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Ablösung von S. Mutanen nach Haftung am Film speicheln und Mit ausgewählten Extrakten behandelt
      1. Kultivieren Sie den Mikroorganismus bis zur mittleren Wachstumsphase, wie oben beschrieben.
      2. Wenn die Kulturen die gewünschte O.D., Zentrifuge (4000 × g für 20 min) erreichten, mit 0,89% NaCl-Lösung waschen und das Pellet mit 0,89% NaCl mit dem gleichen Anfangsvolumen des Kulturmediums wieder aufhängen.
      3. Wenn Sie einen Streptokokken wie S. mutansverwenden, beschallen Sie die Kulturen mit einer Sonde zum Abketten (30 s, 7 W, dreimal). Wenn Sie einen einzelnen Zellorganismus verwenden, kann dieser Schritt übersprungen werden.
      4. Überprüfen Sie die O.D. (540 nm), um die Konzentration auf 2 x 106 KBE/ml einzustellen.
    3. Adhäsion von S. Mutanen am Speichelalapellicle (sHA) und Ablösung der haftenden Zellen
      HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 5dargestellt.
      1. Erhalten Sie die sHA-Proben wie oben beschrieben.
      2. Fügen Sie ein Aliquot (im Beispiel fügen wir 500 l) ausgewählter Behandlungen (bei der Testkonzentration; z. B. 0,5 mg/ml) oder Kontrollen in Mikroröhrchen hinzu, die Proben von sHAenthalten.
      3. Inkubieren Sie die sHA-Proben mit Behandlungen oder Kontrollen (30 min, 37 °C, 24 Rpm); dann die Perlen dreimal mit AB-Puffer (mit PMSF und NaN3) waschen.
      4. Fügen Sie die Mikroorganismus-Kultur hinzu. Im Beispiel fügen wir jedem Mikrorohr 500 l S. Mutans-Kultur (2 x 106 KBE/ml) hinzu.
      5. Inkubieren (1 h, 37 °C, 24 Rpm) und entfernen Sie dann ungebundene Zellen, indem Sie dreimal mit AB-Puffer waschen.
      6. Setzen Sie jede Probe mit einem Aliquot (im Beispiel fügen wir 1000 l) AB-Puffer hinzu und beschallen Sie sie mit einer Sonde (30 s, 7 W).
      7. Verwenden Sie ein Aliquot jeder Suspension für eine zehnfache serielle Verdünnung, um die Anzahl der lebensfähigen Kolonien durch Beschichtung auf bestimmten Agarplatten (48 h, 37 °C, 5%CO2)zu bestimmen. Als Nächstes zählen Sie die Kolonien, um die CFU/ml wie oben beschrieben zu bestimmen.
        HINWEIS: Der Schritt der Beschallung wird durchgeführt, um Zellen zu lösen, die an sHAhaften.
    4. Haftung von S. Mutanen an der anfänglichen Glucan-Matrix (gsHA) und Ablösung der haftenden Zellen
      HINWEIS: Die Schritte sind im Flussdiagramm in Abbildung 6dargestellt. Das GtfB-Enzym wurde aus dem Kulturüberstand Streptococcus milleri KSB8 gereinigt, der zur Herstellung von GtfB entwickelt wurde. Die Reinigung erfolgte mit einer Chromatographie-Säule, die Hydroxyapatitperlen mit Puffern enthält, die zwei Proteasehemmer (0,1 mM PMSF und 0,02 % NaN3)27,28enthalten. Anschließend wurde das Enzym auf Acrylamid-Gel (SDS-PAGE) überprüft und mit Silbernitrat gebeizt. Aliquots des Enzyms wurden bei -80 °C bis zur Verwendung gespeichert.
      1. Erhalten Sie die sHA-Proben wie oben beschrieben. Als nächstes fügen Sie ein Aliquot (im Beispiel fügen wir 500 l) des GtfB-Enzyms zu jeder Röhre hinzu und inkubieren in einem Homogenisator (40 min, 37 °C, 24 U/min). Dann dreimal mit AB-Puffer (mit PMSF und NaN3) waschen.
      2. Fügen Sie jedem Mikroröhrchen ein Aliquot (z. B. 500 l) Saccharosesubstrat (100 mmol Saccharose) hinzu, das die Behandlungen (oder Kontrollen bei der Testkonzentration, z. B. 0,5 mg/ml) enthält.
      3. Inkubieren Sie die Proben in einem Homogenisator (4 h, 37 °C, 24 Rpm). Führen Sie dann drei Waschungen mit AB-Puffer (mit PMSF und NaN3) durch, um die Behandlungen und den Überschuss an Saccharose zu entfernen, die nicht in die synthetisierten Glucane (Proben von gsHA)eingebaut sind.
      4. Fügen Sie jedem Mikrorohr ein Aliquot (im Beispiel fügen wir 500 L) von S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) hinzu.
      5. in einem Homogenisator (1 h, 37 °C, 24 Rpm) inkubieren und dreimal mit AB-Puffer (mit PMSF und NaN3) waschen, um ungebundene Zellen zu entfernen.
      6. Setzen Sie jede Probe mit einem Aliquot (z.B. 1000 l) AB-Puffer (mit PMSF und NaN3) wieder ab und beschallen Sie mit einer Sonde, um Zellen zu lösen, die an gsHA (30 s, 7 W) haften.
      7. Verwenden Sie ein Aliquot jeder Suspension für eine zehnfache serielle Verdünnung, um die Anzahl der lebensfähigen Kolonien durch Beschichtung auf bestimmten Agarplatten (48 h, 37 °C, 5%CO2)zu bestimmen. Als Nächstes zählen Sie die Kolonien, um die CFU/ml wie oben beschrieben zu bestimmen.

4. Biologische Datenanalyse

  1. Bioassays-Daten
    1. Geben Sie Rohdaten für die Bioassays in eine Kalkulationstabelle ein. Berechnen Sie das Protokoll der mikrobiellen Wachstumshemmung durch jede Behandlung als (ACFU/ml der Behandlungen + 1) x log10. Berechnen Sie dann den Log-Prozentsatz der mikrobiellen Wachstumshemmung im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung mit (Alog10 CFU/ml der Behandlung/mean Alog10 CFU/ml der Fahrzeugsteuerung)x 100%.
    2. Korrekte O.D. von planktonischen Kulturen und Biomasse, die durch Behandlungen (CE- und CEF-behandelte Gruppen) und durch Fahrzeugkontrolle (Negative Kontrolle) behandelt werden. Zur Korrektur subtrahieren Sie die Absorption von behandelten Brunnen von denen, die in Brunnen erhalten werden, die nur Kulturmedium (Ablank) enthalten, als (Abehandelte Gruppen medium /Anegatives Kontrollmedium)x 100%.
    3. Berechnen Sie nach dieser Korrektur den Prozentsatz der Biomassehemmung im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung als (Einebehandelte Biomasse/mittelWert AFahrzeugsteuerung)x 100%.
    4. Übermitteln Sie die Rohdaten, die für die statistische Analyse der Daten mit einer bestimmten Software generiert wurden.
      HINWEIS: Die Interpretation der Wirksamkeit einer bestimmten Behandlung wird anhand von Haltepunkten wie dem IC50/IC90bestimmt. Diese Werte sind definiert als die Mindestkonzentration einer Behandlung, die 50 % bzw. 90 % des Bakterienwachstums bzw. der Biofilmbildung hemmen kann24. Diese Parameter können helfen, die Daten zu interpretieren und eine Grundlage für die Auswahl von Verbindungen mit besserer Aktivität13,29.

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Ergebnisse

Wir liefern ein Beispiel für einen systematischen Ansatz, um die biologische Aktivität von Pflanzenextrakten und -fraktionen zu untersuchen, um potenziell aktive Moleküle für mögliche neue Antikariestherapien zu identifizieren: antimikrobielle und antibiobiofilmische Aktivitäten von Casearia sylvestris Extrakten aus verschiedenen brasilianischen Biomen gegen Streptococcus mutans und Candida albicans13.

Hintergrund
Komplexe ...

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Diskussion

Die wichtigsten Herausforderungen im Zusammenhang mit der Arbeit mit natürlichen Rohextrakten sind ihre komplexe Zusammensetzung und die Unzulänglichkeiten klassischer biogeführter Isolationsstudien. Obwohl dieser Prozess langsam ist, ist er wirksam und hat zu wichtigen Erkenntnissen in der NP-Forschung geführt. Um zu rationalisieren, sind prioritisierungsgetriebene Studien erforderlich, um zu rationalisieren. Daher ist die Verwendung moderner chemischer Profilierungsansätze für die Analyse von CE und Dereplikation vor d...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei Nécleo de Bioensaios, Biossénteese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) des Chemieinstituts der UNESP, Araraquara/SP für die Bereitstellung der Laboratorien für die Aufbereitung von Pflanzenmaterial. Wir danken auch dem Applied Microbiology Laboratory der Department of Dental Materials and Prosthodontics, UNESP, Araraquara/SP. Diese Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium der Forschungsstiftung von Sao Paulo (FAPESP #2013/07600–3 an AJC) und Stipendien plus Overhead-Fonds (FAPESP #2017/07408–6 und FAPESP #2019/23175-7 an SMR; #2011/21440–3 und #2012/21921–4 an PCPB) unterstützt. Der National Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung in Verbindung mit FAPESP stellte zusätzliche Unterstützung bereit (INCT CNPq #465637/2014-0 und FAPESP #2014/50926–0 an AJC).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-Mikrotiterplatten KasviFlachboden
AktivkohleLABSYNTHReinigungs- und/oder Fraktionierungsschritt
AnalysemühleIka LabortechniKModell A11 Basic
BlutagarplattenLaborclin
Chromatographische Säule C18Phenomenex Kinetex150 & mal 2,1 mm, 2,6 & Mikro m, 100Â
Dimethylsulfoxid Sigma-AldrichVehikellösung
ELISA-PlattenleserBiochrom Ez
EthanolJ. T. BakerFür Extraktions- und Fraktionierungsschritte und Zusammensetzung
EthanolSigma-AldrichVehikellösung
EthylacetatJ. T. BakerFraktionierungsschritt
GraphPad SoftwareLa JollaGraphPad Prism7
HexanJ. T. BakerFraktionierungsschritt
InkubatorThermo Scientific
IsopropanolJ. T. BakerFür den Extraktionsschritt
Lyophilisierer (ein Gefriertrockner)SavantModulyo
Nylon MilliporeLAC0,22 µ m x 13 mm
OrbitalschüttlerQuimisModell G816  M20
Polyamid Festphasen-ExtraktionskartuscheMacherey-NagelReinigungs- und/oder Fraktionierungsschritt
KieselgelMerck40– 63&dünnsp; μ m, 60  Â
Natriumchlorid (NaCl)Synth0,89% in Wasser
Festphasen-Extraktionskartuschen (SPE)Macherey-NagelReinigungs- und/oder Fraktionierungsschritt
TryptonDifco
UHPLC-DADDionexUltimate 3000 RS
UltraschallbadUNIQUEModell USC 2800
HefeextraktDifco
mobiler Phasen

Referenzen

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