Methodenartikel

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

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DOI:

10.3791/61778

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9. November 2020

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1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University

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Zusammenfassung

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Zusammenfassung

Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ist das oligodendrogliale Versagen ein häufiges frühes pathologisches Merkmal, aber wie es zur Entwicklung und Progression der Krankheit beiträgt, insbesondere in der grauen Substanz des Gehirns, bleibt weitgehend unbekannt. Die Dysfunktion von Oligodendrozyten-Linienzellen ist gekennzeichnet durch Mängel in der Myelinisierung und eine gestörte Selbsterneuerung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs). Diese beiden Defekte werden zumindest teilweise durch die Störung der Interaktionen zwischen Neuronen und Oligodendrozyten während des Aufbaus der Pathologie verursacht. OPCs führen während der ZNS-Entwicklung zu myelinisierenden Oligodendrozyten. In der reifen Hirnrinde sind OPCs die wichtigsten proliferativen Zellen (die ~5% der gesamten Gehirnzellen ausmachen) und kontrollieren die Neubildung von Myelin in Abhängigkeit von der neuronalen Aktivität. Solche Neuron-zu-Oligodendrozyten-Kommunikationen sind insbesondere im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie AD aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen deutlich unteruntersucht. In den letzten Jahren haben unsere Gruppe und andere bedeutende Fortschritte bei der Verbesserung der derzeit verfügbaren Protokolle zur individuellen Erzeugung funktioneller Neuronen und Oligodendrozyten aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gemacht. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere optimierten Verfahren, einschließlich der Etablierung eines Kokultursystems zur Modellierung der Neuron-Oligodendrozyten-Verbindungen. Unsere illustrativen Ergebnisse deuten auf einen unerwarteten Beitrag von OPCs / Oligodendrozyten zur Amyloidose und Synapsenintegrität des Gehirns hin und unterstreichen den Nutzen dieser Methodik für die AD-Forschung. Dieser reduktionistische Ansatz ist ein mächtiges Werkzeug, um die spezifischen heterozellulären Interaktionen aus der inhärenten Komplexität im Gehirn zu sezieren. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Protokolle zukünftige Studien zu oligodendroglialen Defekten in der Pathogenese der Neurodegeneration erleichtern.

Einleitung

Oligodendrozyten-Linienzellen – einschließlich Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), myelinisierende Oligodendrozyten und Übergangstypen dazwischen – bilden eine Hauptgruppe menschlicher Gehirnzellen1, die aktiv an vielen kritischen Funktionen für den ordnungsgemäßen Betrieb und die Aufrechterhaltung unseres zentralen Nervensystems während der neuronalen Entwicklung und des Alterns beteiligtsind 2,3,4 . Während Oligodendrozyten dafür bekannt sind, Myelin zu produzieren, um die Übertragung neuronaler Aktivität zu erleichtern und die axonale Gesundheit in der weißen Substanz zu unterstützen, sind OPCs reichlich vorhanden (~ 5%) in der grauen Substanz, wo Myelinisierung knapp ist und aktivitätsabhängige Signalfunktionen ausführen, um das Lernverhalten und die Gedächtnisbildung zu steuern 5,6,7,8 . Wie oligodendrogliale Zellen funktionieren und dysfunktional in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen ist zu wenig untersucht9. Die Unzulänglichkeiten eines geeigneten Modellsystems und Defizite im Allgemeinwissen, um einen experimentellen Weg nach vorne zu leiten, sind die Hauptgründe für diese Lücke.

Angesichts der jüngsten Durchbrüche bei der Gewinnung menschlicher Gehirnzellen aus pluripotenten Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), haben sich solche zellulären Modelle in Verbindung mit modernen Gen-Editing-Tools als robuste Werkzeuge zur Handhabung des komplizierten Nexus zellulärer Interaktionen im Gehirn erwiesen und sind in der Lage, humanspezifische Krankheitsmanifestationennachzuweisen10. 11. In Anbetracht der Tatsache, dass einzelne Gehirnzelltypen angesichts der gleichen AD-fördernden Bedingungen unterschiedliche und sogar widersprüchliche Wirkungen zeigen können12,13, bietet diese Stammzellmethodik auf einzigartige Weise zelltypspezifische Informationen, die zuvor unter Verwendung etablierter In-vivo- oder In-vitro-Modelle, die nur aggregierte Messwerte aus Sammlungen von Gehirnzelltypen liefern, übersehen wurden. In den letzten zehn Jahren wurde eine große Anzahl zuverlässiger Protokolle entwickelt, um menschliche Neuronen aus Transdifferenzierung von ES/iPS-Zellen oder direkter Umwandlung aus anderen terminaldifferenzierten Zelltypen (z. B. Fibroblasten) zu erzeugen14,15. Insbesondere die Anwendung wichtiger neurogener Transkriptionsfaktoren (z.B. Neurogenin 2, Ngn2)16 auf humane pluripotente Stammzellen kann eine homogene Population gut charakterisierter neuronaler Zelltypen für Reinkulturen erzeugen, ohne dass eine Kokulturierung mit Gliazellen erforderlich ist12,17,18. Für induzierte menschliche Oligodendrozyten gibt es einige veröffentlichte Protokolle, die funktionelle Zellen erzeugen können, die ihren primären Gegenstücken sehr ähnlich sind, mit einer breiten Palette von Effizienz und Bedarf an Zeit und Ressourcen 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Bisher wurde keines dieser Protokolle angewendet, um zu untersuchen, wie oligodendrogliale Zellen auf die AD-Pathogenese reagieren und diese beeinflussen.

Hier beschreiben wir unsere verbesserten Protokolle für Einzel- und Mischkulturen von humaninduzierten Neuronen (iNs) und OPCs/Oligodendrozyten (iOPCs/iOLs). Das hier beschriebene iN-Protokoll basiert auf dem weit verbreiteten Ngn2-Ansatz16 und hat zusätzlich die Eigenschaft, gliafrei zu sein. Die resultierenden iNs sind homogen und ähneln stark den exzitatorischen Neuronen der kortikalen Schicht 2/3 mit charakteristischer pyramidaler Morphologie, Genexpressionsmuster und elektrophysiologischen Merkmalen17,18 (Abbildung 1). Um einige der grundlegenden Barrieren bei der gerichteten Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu überwinden, haben wir eine einfache und effektive Methode der Vorbehandlung von niedrig dosiertem Dimethylsulfoxid (DMSO) entwickelt29,30 und berichteten über eine erhöhte Neigung menschlicher ES/iPS-Zellen, in iOPCs und iOLs31 zu transdifferenzieren, basierend auf einem weitgehend angepassten Protokoll von Douvaras und Fossati 32 . Wir haben das Protokoll weiter vereinfacht und eine robuste differenzierungsfördernde Verbindung, Clemastin 7,33,34, integriert, um den Prozess der oligodendroglialen Reifung zu beschleunigen. Als Ergebnis (Abbildung 2) können die iOPCs in 2 Wochen (~95% positiv für den Marker O4) und iOLs in vier Wochen (exprimierend für reife Marker MBP und PLP1) generiert werden. Interessanterweise fanden wir heraus, dass iOPCs allein eine bemerkenswerte Menge an Amyloid-β (Aβ) sezernieren, was mit den unabhängigen transkriptomischen Daten übereinstimmt, die die reichliche Expression des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und der Verarbeitungsprotease β-Sekretase (BACE1) in Oligodendrozyten-Linienzellen35,36 zeigen. Darüber hinaus fördert unser iN-iOPC-Kokultursystem die Umhüllung von Axonen durch MBP-positive iOL-Prozesse und bietet eine signifikante Unterstützung für die Synapsenbildung (Abbildung 3). Daher haben die Protokolle, die wir unten beschrieben haben, technische und biologische Vorteile gegenüber zuvor katalogisierten Neuron-Oligodendroglia-Co-Kultivierungsmethoden und versprechen eine bessere Modellierung der Neurodegeneration bei AD.

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Protokoll

1. Induktion menschlicher Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

  1. Lentivirus-Vorbereitung (~5 Tage, detailliertes Protokoll wie zuvor beschrieben16)
    1. Platte ~ 1 Million HEK293T-Zellen jeder T75-Kolben, um sie ~ 40% konfluent zu haben, wenn Transfektion durchgeführt wird. Transfizieren Sie sie mit Plasmiden, die Tetracyclin-induzierbares Ngn2 und puromycin-resistentes Gen (PuroR; unter derselben TetO-Promotorkontrolle), rtTA und die drei Helferplasmide pRSV-REV, pMDLg/pRRE und VSV-G (12 μg lentivirale Vektor-DNA und 6 μg jeder der Helferplasmid-DNA) exprimieren. Bereiten Sie mindestens drei Flaschen pro Lentivirus-Präparat vor. Verwenden Sie PEI für die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wechseln Sie die Medien nach 16 h und verwerfen Sie sie.
    2. Ernte freigesetzte Viruspartikel durch tägliches Sammeln von Kulturmedien und Ersetzen durch frische Medien für 3 Tage. Bündeln Sie die gesammelten Medien mit viralen Partikeln zur Reinigung. Filtern Sie das Virus durch einen 0,22 μm Filter und zentrifugieren Sie es bei 49.000 x g für 90 min. Resuspendieren Sie das Pellet in der entsprechenden Menge PBS-Glucose (~150 μL).
  2. Neuroneninduktion (~5 Tage)
    HINWEIS: Dieses Induktionsprotokoll (Abbildung 1A; Flussdiagramm) ist sowohl für iPS- als auch für ES-Zellen mit validierter Pluripotenz (die durch immunhistochemische Färbung gut charakterisierter Pluripotenzmarker untersucht werden kann; Abbildung 1B).
    1. Verwenden Sie kommerziell erhältliche menschliche H1-ES-Zellen am Durchgang von 52 (siehe Materialtabelle). Kulturieren Sie die Zellen auf extrazellulärer Matrixlösung, beschichtet mit 6-Well-Platten (~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte; siehe Materialtabelle) unter Verwendung von ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5%CO2.
    2. An Tag -2 ES-Zellen (80% konfluent) mit 1 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) ablösen und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Übertragen Sie die Zellen in eine Röhre; Waschen Sie den Brunnen mit 2 ml Medien und mischen Sie ihn im selben Röhrchen. Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min, resuspendieren Sie das Pellet in Medien und platen Sie die Zellen auf matrixbeschichtete 6-Well-Platten mit der Aussaatdichte von 1 x 105 Zellen pro Well.
    3. An Tag -1 werden Lentiviren, die Ngn2 plus PuroR und rtTA exprimieren, zusammen mit Polybren (8 μg/ml) in die ES-Zellen in frischem ES-Zellerhaltungsmedium gegeben (siehe Materialtabelle). Die genaue Menge an Viren sollte durch tatsächliche Titer oder die Titration bestimmt werden. Wir fügen typischerweise 5 μL jedes Virus pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte hinzu.
    4. An Tag 0 Doxycyclin (2 μg/ml, um die Ngn2-Expression zu aktivieren) in DMEM-F12-Medium mit N2-Ergänzung ohne Morphogene hinzufügen.
    5. An Tag 1 fügen Sie Puromycin in frischem Medium aus DMEM-F12 plus N2 und Doxycyclin auf die Endkonzentration von 1 μg / ml Medium hinzu. Wählen Sie die transduzierten Zellen in Puromycin für mindestens 24 h aus. Eine höhere Puromycin-Konzentration (bis zu 5 μg/ml) und ein längerer Selektionszeitraum (bis zu 48 h) können erforderlich sein, um die untertransduzierten Zellen angemessen zu entfernen, wenn der Virustiter niedrig ist.
    6. An Tag 2 trennen Sie differenzierende Neuronen mit Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) und beschichten Sie sie auf 24-Well-Platten (zwischen 80.000 und 200.000 Zellen / Well), die mit Matrixlösung beschichtet sind (siehe Tabelle der Materialien), und halten Sie sie in NBA / B27-Medium ohne Doxycyclin. Die Aussaatdichte ist entscheidend.
    7. In diesem Stadium können abgelöste Neuronen in einem speziellen kommerziellen Gefriermedium eingefroren werden (siehe Materialtabelle) und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Reine Neuronen können unter Berücksichtigung des typischen ~15%-20% Zelltods nach dem Auftauen plattiert, allein kultiviert oder mit anderen Gehirnzelltypen co-kultiviert werden (siehe Schritt 3.2.3. für Co-Kultivierung mit OPCs).
    8. Kultur reiner iNs auf den Platten, die mit extrazellulären Lösungen auf Matrixbasis beschichtet sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die charakteristische pyramidale Morphologie sollte bis Tag 4 (und Tag 6; Abbildung 1C). Die Synapsenbildung kann bereits am Tag 14 bis 16 nachgewiesen werden und ist am Tag 24 durch immunhistochemische Färbung mit Standard-prä- und postsynaptischen Markern prominent. (Abbildung 1D; beschriftet mit dem präsynaptischen Marker Synapsin 1 und dem dendritischen Marker Map2).

2. Induktion humaner Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus pluripotenten Stammzellen und Oligodendrozytenreifung

  1. Neuronale Vorläuferzelle (NPC) Generation: Monolayer-Protokoll (~7 Tage). Das Flussdiagramm ist in Abbildung 2A dargestellt.
    1. Kultur menschlicher H1-ES-Zellen wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 1.2.1.) und transdifferenzieren Sie sie in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) durch einen etablierten Ansatz namens duale SMADi mit niedermolekularen Inhibitoren für mehrere Signalwege. Hier verwenden wir ein weithin akzeptiertes kommerzielles Kit und folgen dem vom Hersteller bereitgestellten Monolayer-Protokoll (siehe Materialtabelle).
    2. An Tag -1, Platte 0,5–1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte, beschichtet mit einer wachstumsfaktorreduzierten Matrixlösung (siehe Tabelle der Materialien; ~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte) mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Tabelle der Materialien). Diese wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung wird verwendet, um alle Platten zu beschichten, die in den folgenden Schritten verwendet werden.
    3. Am Tag 0 behandeln Sie die Zellen für 24 Stunden mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle), ergänzt durch 2% DMSO.
    4. Wechseln Sie an Tag 1–6 das gesamte Medium mit einem warmen (37 °C) neuralen Induktionsmedium, das die SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit enthält (siehe Materialtabelle). Wenn sich Zellen vor Tag 7 teilen und den Zusammenfluss erreichen, gehen sie auf die Seeddichte von 0,5–1 x 106, wie weiter oben in Schritt 2.1.2 beschrieben.
    5. An Tag 7 werden NPCs mit Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) und Platte bei einer Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen/Vertiefung einer 24-Well-Platte durchgehen.
    6. Bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz durch immunhistochemische (IHC) Färbung auf Abwesenheit von Pluripotenzmarker, OCT4 zum Beispiel, und Vorhandensein von NPC-Markern wie PAX6, Nestin und Sox1.
    7. In diesem Stadium können abgelöste NPCs in den spezialisierten kommerziellen NPC-Gefriermedien eingefroren werden (siehe Materialtabelle) und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Nach dem Einfrieren und Auftauen für einmal behalten NPCs immer noch die Multipotenz, um Neuronen, Astrozyten und OPCs mit zuverlässigen Protokollen hervorzubringen.
  2. Bildung von Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPC) (~7 Tage). Das Flussdiagramm finden Sie in Abbildung 2A .
    1. An Tag 7 werden NPCs mit Zellablösungslösung durchgelassen (siehe Materialtabelle) und sie mit einer Seeding-Dichte von 1–2 x 105 Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte in warmem (37 °C) neuronalem Induktionsmedium plus SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) geblasen.
    2. An Tag 8 eine Lösung von 1% DMSO im OPC-Differenzierungsmedium vorbereiten und die plattierten NPCs 24 h lang behandeln. Das OPC-Differenzierungsmedium besteht aus: DMEM/F12-Medium, 1% N2-Ergänzung, 1% B27-Ergänzung, bFGF bei 20 ng/ml, SAG bei 1 μM, PDGF-AA bei 10 ng/ml (siehe Materialtabelle).
    3. Ersetzen Sie an Tag 9 die Medien durch ein frisches OPC-Differenzierungsmedium ohne DMSO. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis zum 15. Tag. Wenn die Zellen vor Tag 15 den Zusammenfluss erreichen, werden sie auf die Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen pro Vertiefung geleitet, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben.
    4. An Tag 14 werden OPCs in OPC-Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 1–2 x 105 Zellen/Vertiefung in einer 24-Well-Platte verkleidet.
    5. In diesem Stadium (Tag 15) Testzellen auf das Vorhandensein von OPC-spezifischen Markern durch IHC-Färbung oder qPCR (z. B. O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Abbildung 2B) und für das Fehlen von NPC-Markern (Pax6 oder Nestin; Abbildung 2D). Wir weisen typischerweise die O4-Immunreaktivität in mehr als 95% der Zellen am Tag 15 nach. Von besonderer Bedeutung für die Alzheimer-Krankheit ist die Expression von APP (Amyloid-Vorläuferprotein), BACE1 (die Verarbeitungsprotease β-Sekreatase 1) und Peptid-Amyloid-β (Aβ) in OPCs reichlich vorhanden (Abbildung 2F).
  3. Oligodendrozyten (OL) Reifung (~7–20 Tage)
    1. Ersetzen Sie an Tag 15 die Medien durch ein OL-Reifungsmedium: Neurobasal-A-Medium, 2% B27-Ergänzung, 1 μM cAMP, 200 ng/ml T3-Trijodthyronin und Clemastin von 1 μM (siehe Materialtabelle). Wechseln Sie das Medium bei Bedarf jeden zweiten Tag oder jeden Tag.
    2. Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 90% erreichen, teilen Sie sich im Verhältnis 1:3 bis zu 2 Passagen oder bis sich die Zellteilung erheblich verlangsamt. Wenn sich OPCs zu schnell teilen und in weniger als 3 Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Ara-C (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 2-5 μM für 1-3 Tage hinzu. Aktive Proliferation deutet auf eine verminderte Reifungseffizienz hin.
    3. Untersuchen Sie die Effizienz der oligodendroglialen Reifung durch Beurteilung der Expression von OL-Markern, z. B. CLDN11, PLP1, MBP durch qPCR, IHC-Färbung oder Immunoblotting. Die charakteristische Morphologie hochkomplexer Strukturen (Abbildung 2C) und die Expression von OL-Markern (Abbildung 2E) sollten bis Tag 28 leicht nachgewiesen werden.

3. Co-Kultivierung von humanen induzierten Neuronen (iNs) und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs)

  1. iOPC-Beschichtung (~3 Tage)
    1. Platten-iOPCs am Tag 14 mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (wie oben in Schritt 2.2.4 beschrieben) in OPC-Differenzierungsmedium (wie in Schritt 2.2.2 beschrieben).
  2. iN-iOPC Co-Kultur eingerichtet
    1. Am Tag 15 lösen Sie die induzierten menschlichen Neuronen im Schritt von Tag 2 nach der Puromycin-Selektion (wie in Schritt 1.2.6 beschrieben) mit Zellablösungslösung ab (siehe Materialtabelle).
    2. Fügen Sie Neuronen auf die kultivierten OPCs hinzu und plattieren Sie mit der Seeding-Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung in der 24-Well-Platte mit wachsenden OPCs (aus Schritt 3.1.1). Verwenden Sie das Kokulturmedium, das Neurobasal-A-Medium, 2% B27-Ergänzung und 100 ng / ml T3-Trijodthyronin enthält. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und danach jeden zweiten Tag. Wenn sich OPCs zu schnell vermehren und in weniger als 3 Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Ara-C in einer Konzentration von 2-5 μM hinzu. Ein repräsentatives Bild der iNs und iOPCs, die nach 7 Tagen in Kokultur gezüchtet wurden, ist in Abbildung 3A dargestellt.
    3. Verwenden Sie gefrorene Neuronen, die wie oben in Schritt 1.2.7 beschrieben für die Co-Kultivierung mit OPCs vorbereitet wurden. Plattengefrieren und Auftauen von Neuronen mit einer höheren Dichte von 3 x 105 Zellen pro Well.
    4. Nach Tag 14-16 in Kokulturen kann die Synapsenbildung in iNs durch IHC-Färbung von prä- und postsynaptischen Markern beobachtet werden, und bis Tag 21 sollte die synaptische Puncta reichlich vorhanden sein (Abbildung 3C) und neuronale Aktivitäten können zuverlässig aufgezeichnet werden.
    5. Ab Tag 21 Testzellen auf OL-spezifische Marker (z. B. MBP und PLP1). Am 28. Tag beobachten wir normalerweise das Phänomen der Umhüllung von iN-Axonen durch iOL-Prozesse, markiert durch IHC-Färbung für spezifische Marker (Abbildung 3B; Neurofilament-NF für iN-Axone und MBP für iOPC-Prozesse).

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Ergebnisse

Direkte Erzeugung von humaninduzierten Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen
Es ist sehr wichtig, dass die startenden humanen pluripotenten Stammzellen einen hohen Grad an Pluripotenz für die erfolgreiche Erzeugung von iNs oder iOPCs/iOLs aufweisen. Daher sollten Zellen auf bestimmte Marker wie Oct4 und SOX2 gefärbt werden, bevor eines der im vorliegenden Manuskript beschriebenen Induktionsprotokolle gestartet wird (Abbildung 1A). Menschliche H1-Zellen wurden ver...

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Diskussion

Neben der physikalischen und metabolischen Unterstützung zur Stabilisierung der Synapsenstrukturen und zur Erleichterung der salzatorischen Signalleitung durch Myelinisierung können Oligodendrozyten-Linienzellen neuronale Aktivitätsmuster durch schnelle und dynamische Cross-Talks mit Neuronen 5,6,7 formen. Während in der AD-Pathologie die oligodendroglialen Reaktionen zunächst lediglich als sekundär zu Entzündungen und oxidative...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health (R00 AG054616 an Y.A.H. und T32 GM136566 an K.C.), der Stanford University School of Medicine und eines Siebel Fellowship (vergeben an S.C.) unterstützt. Y.A.H. ist DaF Translational Professor am Center for Translational Neuroscience am Brown Institute for Translational Sciences.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccutaseSTEMCELL Technologies7920
B27 NahrungsergänzungsmittelThermoFisher17504044
bFGFThermoFisherPHG 0266
cAMPMilliporeSigmaA9501
ClemastinMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 MediumSTEMCELL Technologies36254
DMSOThermoFisherD12345
DoxycyclinMilliporeSigmaD3072
Fötales RinderserumScienCell10
H1 humane ES-ZellenWiCellWA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusSTEMCELL Technologies5825
N2 ErgänzungThermoFisher17502001
Neurobasal A MediumThermoFisher10888-022
Nicht essentielle AminosäurenThermoFisher11140-050
PDGF-AAR& D Systems221-AA-010
PEIVWR71002-812
pMDLg/pRREAddgene12251
PolybrenMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgene12253
PuromycinThermoFisherA1113803
ROCK Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72302
SAGTocris4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing MediaSTEMCELL Technologies5838
STEMdiff SMADi Neural Induction KitSTEMCELL Technologies8581
T3 TrijodthyroninMilliporeSigmaT6397
Tempo-iOlogo: Humane iPSC-abgeleitete OPCsTempo BioScienceSKU102
TetO-NG2-PuroAddgen52047
VSV-GAddgen12259

Referenzen

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

IN-OPC co-culture results; neurofilament staining, synaptic density diagram, marker expression graph.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Microscopy analysis, astrocyte markers, iOPC-neuron interaction, fluorescence labeling.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

Schlagwörter

Kokultursysteminduzierte NeuronenOligodendrozyten Vorl uferzellenOligodendrozyten ReifungSynapsenbildungModellierung der Alzheimer Krankheit

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