Summary
Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.
Abstract
Los hepatocitos primarios se utilizan ampliamente en la investigación in vitro del hígado, especialmente en estudios de metabolismo de la glucosa. Se ha adaptado una técnica base en función de diferentes necesidades, como el tiempo, la mano de obra, el costo y el uso de hepatocitos primarios, lo que resulta en varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. Sin embargo, los numerosos pasos y las preparaciones de reactivos que consumen mucho tiempo en el aislamiento primario de hepatocitos son inconvenientes importantes para la eficiencia. Después de comparar diferentes protocolos por sus pros y sus contras, se combinaron las ventajas de cada uno, y se formuló un protocolo de aislamiento de hepatocitos primarios rápido y eficiente. En solo ~ 35 minutos, este protocolo podría producir tanto, si no más, hepatocitos primarios sanos como otros protocolos. Además, los experimentos de metabolismo de la glucosa realizados utilizando los hepatocitos primarios aislados validaron la utilidad de este protocolo en estudios in vitro de metabolismo hepático. También revisamos y analizamos ampliamente la importancia y el propósito de cada paso en este estudio para que los futuros investigadores puedan optimizar aún más este protocolo en función de las necesidades.
Introduction
El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fundamental para la producción y el almacenamiento de glucosa1. Los experimentos con hepatocitos primarios in vitro son imprescindibles para la mayoría de los estudios del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, durante años, varios grupos de investigación han desarrollado protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones.
El procedimiento general del aislamiento de hepatocitos de ratón es primero eliminar la sangre en el hígado con un líquido isosmótico como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y luego usar solución que contiene colagenasa para disociar los hepatocitos. Estos protocolos comparten un procedimiento general, pero difieren en reactivos y pasos en función de las diferentes necesidades. Sin embargo, la preparación de los reactivos necesarios y la realización de pasos de aislamiento llevan tiempo. En el desarrollo del presente protocolo, se estableció la eficiencia como una prioridad, con todos los reactivos listos para usar y disponibles en el mercado, y la menor cantidad de pasos posible. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método rápido y eficiente en el trabajo de parto para aislar los hepatocitos primarios del ratón, sin poner en peligro la pureza y viabilidad de los hepatocitos primarios aislados.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).
1. Preparación:
- Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.
- Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.
- Caliente 50 ml de H2O de doble destilación (ddH2O), 35 ml de medio de perfusión (por ejemplo, medio de perfusión hepática) (o 50 ml la primera vez que se utiliza este protocolo) y 25 ml de medio filtrado de colagenasa-dispasa en un baño de agua de 45 °C durante 30 min.
- Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, mezcle 2 ml de 10x HBSS y 18 mL de Percoll en un tubo de 50 mL para hacer 20 mL 1x Percoll-HBSS y mantener en hielo o 4 °C.
NOTA: 1x Percoll-HBSS se puede mantener a 4 °C durante al menos 6 meses. - Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, vierta 30 ml de medio de lavado (por ejemplo, hepatocyte Wash Medium) en una placa de Petri limpia y manténgalo en hielo.
- Sumerja el tubo de bombeo en el agua de un baño de agua a 45 °C. Los resultados son más fiables si la temperatura ambiente está a 25 °C.
- Preparar 2 ml de 1x anestésicos mezclando 225 μL de ketamina HCL, 93,75 μL de xilazina y 1681 μL de 1x PBS.
- Anestesiar un ratón utilizando un método aprobado. Aquí el ratón fue inyectado intraperitonealmente con 150 μL de 1x anestésicos. Realice las pruebas para detectar la pérdida de reflejos, como la reacción al pellizco del dedo del pie para garantizar una anestesia completa.
- Asegure el ratón en su espalda a la almohadilla de disección por cuatro extremidades, ya sea fijando o usando cinta impermeable u otros métodos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la institución (o equivalentes).
- Prepare pinzas y tijeras esterilizadas para la disección. Para evitar una posible contaminación, realice todos los pasos dentro de una campana estéril.
2. Procedimiento:
- Usando una bomba peristáltica, comience a bombear ddH2O calentado a una velocidad de 4 ml / min durante 5 minutos. Cambie el tubo de bombeo de agua a un medio de perfusión calentado.
- Desinfecte el abdomen del ratón anestesiado con 70% de EtOH y ártelo con una tijera para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
- Detenga la bomba peristáltica. Inserte un catéter de 24 G (por ejemplo, catéter IV cerrado, 24 G, 0,75 IN) en IVC. Comience a bombear y corte la vena porta abierta.
- Continúe bombeando hasta que el líquido eliminado esté claro (alrededor de 3-5 min). Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Tenga cuidado de no dejar que las burbujas de aire entren en el IVC.
NOTA: Este paso consiste en eliminar la mayor cantidad de sangre posible del hígado. - Cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio colagenasa-dispasa. Continúe bombeando hasta que los 25 ml del medio colagenasa-dispasa se agoten mientras realiza el paso 2.6.
- Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado.
NOTA: En esta etapa, la pérdida completa de sangre es fatal para el ratón. La muerte del ratón puede confirmarse por la falta de latidos del corazón después del experimento. Deseche el cadáver según las políticas de la instalación. - Aísle todo el hígado sin vesícula biliar al medio de lavado de 30 ml en la placa de Petri sobre hielo.
- Romperlo en pedazos con fórceps para liberar hepatocitos primarios en solución. Este paso convertiría el medio de lavado en una solución turbia llena de hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado.
- Filtre la solución turbia en el paso 2.8 a través de un colador celular de 70 μm en el Percoll-HBSS de 20 ml 1x en un tubo de 50 ml sobre hielo. Mezclar invirtiendo el tubo 20 veces.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Dentro de la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
- Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml del medio de cultivo (u otros volúmenes apropiados) dentro de la campana de cultivo de tejidos.
- Cuente el número de células y platee las células en las placas de cultivo deseadas de acuerdo con el diseño experimental.
NOTA: Los hepatocitos primarios correctamente aislados de un ratón de 8 semanas de edad suelen ser suficientes para ser chapados en cuatro placas de 6 pocillos o cuatro placas de 12 pocillos.
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Representative Results
Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos2, la sensibilidad a la insulina y la producción de glucosa. Por lo tanto, las actividades de los hepatocitos primarios aislados con este protocolo se probaron en los siguientes experimentos.
No se requirió recubrimiento para la fijación primaria de hepatocitos en el presente protocolo.
Los hepatocitos primarios aislados se enchaparon a 5 x 105 células/pozo en una placa de 6 pocillos. Después de 1 h, se observó una fijación firme, y los hepatocitos primarios se expandieron completamente 12 h después del recubrimiento (Figura 3). Esto indicó que 12 h después del recubrimiento, las células estaban listas para ser utilizadas en experimentos. Sobre la base de la morfología del núcleo de los hepatocitos de ratón dentro del hígado, los hepatocitos mononucleares se enriquecieron en los bordes, mientras que los hepatocitos binucleares / polinucleares, una firma de diferenciación terminal, estaban en el medio 3,4. Una cantidad significativa de células fotografiadas mostró la morfología típica de doble núcleo (diploide), lo que indica el éxito de aislar y purificar los hepatocitos primarios vivos. Esto también indica que el recubrimiento de colágeno no es un requisito para la unión primaria de hepatocitos con este protocolo.
La pureza se enriqueció en la población aislada de hepatocitos primarios
Se han utilizado varios marcadores genéticos específicos del tipo celular en protocolos anteriores para verificar la pureza de los hepatocitos primarios aislados (Tabla 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differentiation 95, también conocido como Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) y ASGR2 son marcadores de hepatocitos. Después del aislamiento, los niveles de ARNm de estos marcadores de hepatocitos aumentaron significativamente, en comparación con todo el hígado (Figura 4A-D, H).
Este protocolo también redujo en gran medida la interferencia de otras células hepáticas. La presencia de células inmunes, células estrelladas y células endoteliales fue menor, mostrada por la fuerte disminución de los niveles de ARNm de CD45 (marcador de células inmunes), COL1A1 (colágeno, tipo I, alfa 1, marcador de células estrelladas) y TIE2 (túnica interna quinasa de células endoteliales, marcador de células endoteliales), en comparación con todo el hígado (Figura 4E-H ). Estos sugieren que este protocolo podría purificar la población primaria de hepatocitos de las células hepáticas y así reducir la posible interferencia de otros tipos de células en los experimentos.
Se preservó la actividad de los biomarcadores farmacéuticos
Los biomarcadores en los hepatocitos se han utilizado ampliamente para la orientación y administración de fármacos. Por lo tanto, la preservación de la actividad de los biomarcadores farmacéuticos es un punto clave en el aislamiento primario de hepatocitos y es un estándar para probar la utilidad del aislamiento primario de hepatocitos2. Los marcadores de hepatocitos ASGR1 y ASGR2 se utilizan de esta manera2. Primero probamos el nivel de expresión de curso de tiempo de estos dos marcadores antes y después del recubrimiento primario de hepatocitos. Después del emplatado, su nivel de ARNm disminuyó considerablemente con el tiempo, pero los niveles se mantuvieron considerables en comparación con todo el hígado hasta el punto de tiempo de 12 h después del recubrimiento, especialmente para ASGR1 (Figura 5A, B). La tendencia de expresión fue consistente con un informe anterior2 e indicó una salud de hepatocitos primarios comparable. Varios patógenos se dirigen a CD81, una proteína unida a la membrana de hepatocitos, para facilitar su entrada en las células y la infección, como el virus de la hepatitis5, Plasmodium falciparum y Plasmodium yoelii6. Otras proteínas localizadas en la membrana de los hepatocitos, como TLR4 (Toll-like receptor 4), también son el objetivo de los patógenos e importantes para la respuesta inmune de los hepatocitos7. Después del recubrimiento, el nivel de expresión de CD81 fue consistente hasta 48 h (Figura 5C). El nivel de expresión de TLR4 generalmente aumentó, pero no hasta después de 48 h, cuando alcanzó un nivel superior al in vivo (Figura 5D). Estos sugieren que los hepatocitos primarios aislados por este protocolo también se pueden usar para estudios CD81 y TLR4 dentro de al menos 48 h después del recubrimiento. En conjunto, estos resultados indican que los hepatocitos primarios aislados son válidos para su uso en estudios relacionados con biomarcadores farmacéuticos. Vale la pena señalar que los niveles de ARN y proteína pueden ser inconsistentes debido a las influencias de las actividades post-transcripcionales como la migración de ARN inducida por péptidos señal, la modificación posttraduccional y / o la degradación de proteínas. Por lo tanto, la verificación del nivel de proteína y la bioactividad de los biomarcadores farmacéuticos identificados por el ARNm puede ser necesaria si así lo requiere el paradigma experimental.
Los hepatocitos primarios aislados eran sensibles a la insulina
También se analizó el rendimiento primario de los hepatocitos en experimentos de metabolismo de la glucosa. La insulina, una hormona que desempeña un papel central en el metabolismo de la glucosa, disminuye el nivel de glucosa, promoviendo la absorción y el almacenamiento de glucosa hepática a través de la fosforilación AKT y FOXO1 (Forkhead box O1). Por lo tanto, se realizó un ensayo de sensibilidad a la insulina con hepatocitos primarios aislados. Después de 16 h, las células se quedaron hambrientas durante 3 h, con un medio libre de suero. En las últimas 0,5 h de inanición, se administró insulina de 100 nM al medio de cultivo. Como se muestra en la Figura 6A-C, la insulina promovió significativamente la fosforilación tanto de AKT en Ser473 como de FOXO1 en Ser256, lo que indica la sensibilidad de los hepatocitos primarios a la insulina. Esto sugiere que los hepatocitos primarios aislados del presente protocolo son útiles en estudios de metabolismo de insulina/glucosa.
Los hepatocitos primarios aislados fueron capaces de producir glucosa
No solo son un centro de almacenamiento de glucosa, sino que los hepatocitos también son responsables de la producción de glucosa. Para probar si los hepatocitos primarios que aislamos son útiles en estudios de producción de glucosa, las células se quedaron hambrientas durante 10 h en presencia de glucagón para estimular la producción de glucosa. El medio de inanición se recolectó para el ensayo de glucosa, mientras que las células se recolectaron para western blot. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) es un componente esencial en la producción de glucosa hepática, controlando su tasa8. El nivel de proteína de PEPCK aumentó significativamente después del tratamiento con glucagón, lo que sugiere que la vía de producción de glucosa se activó (Figura 7A, B). Esta activación se confirmó aún más por un mayor nivel de producción de glucosa (Figura 7C). Este fenómeno también se confirmó con otros estimuladores de la producción de glucosa como la forskolina más IBMX (Figura 7A-C). Sin embargo, debido a la limitación de este experimento, no pudimos verificar si la producción de glucosa era exclusiva a través de la gluconeogénesis o si también hay un componente de la glucogenólisis.
Figura 1: Configuración del banco. (A) La configuración del banco para el aislamiento primario de hepatocitos. (B) La configuración del banco caricaturesco para el aislamiento primario de hepatocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección de ratones, perfusión y purificación primaria de hepatocitos. (A) El ratón diseccionado, con flechas apuntando al hígado, IVC y vena porta. (B) Inserción del catéter en IVC. (C) Presionar la vena porta causando agrandamiento y rigidez de los lópes hepáticos, lo que indica una perfusión exitosa. (D) Lópes hepáticos suavizados después de la perfusión, lo que indica el éxito de la digestión de la colagenasa. (E) La posición de la vesícula biliar en el hígado aislado (flecha que apunta a la vesícula biliar). (F) Extirpación de la vesícula biliar. (G) Hígado desgarrado en medio de lavado de hepatocitos. (H) Mezclar 1x Percoll-HBSS con hepatocito primario filtrado antes de la centrífuga. (I, J) pellet primario de hepatocitos después de la centrífuga. (K) Resuspensión primaria de hepatocitos dentro del medio de lavado de hepatocitos. (L, M) El pellet de hepatocitos primarios se formó dentro del medio de lavado de hepatocitos después de la centrífuga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hepatocitos primarios después del emplatado. Las imágenes se tomaron después de (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h y (H) 96 h de recubrimiento primario de hepatocitos. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mejora de la pureza de los hepatocitos primarios después del aislamiento. El ARN se aisló antes (de todo el hígado) y después (de hepatocitos primarios aislados) del aislamiento primario de hepatocitos, seguido de PCR de transcripción inversa, según un protocolo previo9. La pureza primaria de los hepatocitos se evaluó mediante PCR en tiempo real con cebadores para marcadores de hepatocitos (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 y (D) ASGR2, mientras que también con marcador de células inmunes (E) CD45, (F) marcador de células estrelladas COL1A1 y (G) marcador de células endoteliales TIE2. (H) Se generó un mapa de calor para los cambios de expresión de los marcadores de tipo celular antes y después del aislamiento primario de hepatocitos. GapDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) se utilizó como control interno. Los cebadores utilizados aquí fueron para genes (las secuencias de cebadores se encuentran en la Tabla 2. Las referencias de secuencia se citan aquí): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Los gráficos y el mapa de calor se generaron con GraphPad Prism 8. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t de dos colas no apareada (ya que las muestras primarias de hepatocitos e hígado entero no se aparearon porque este protocolo requiere hígado intacto para empezar) la significación de la prueba t se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N=7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión de biomarcadores farmacéuticos. El ARN se aisló de todo el hígado y el hepatocito primario después del recubrimiento, seguido de PCR de transcripción inversa. La expresión de biomarcadores farmacéuticos se evaluó mediante PCR en tiempo real con cebadores para (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 y (D) TLR4. GAPDH se utilizó como control interno. Los nuevos cebadores utilizados aquí fueron para genes (las secuencias de cebadores se encuentran en la Tabla 2. Las referencias de secuencia se citan aquí): CD8118; TLR419. Los gráficos se generaron con GraphPad Prism 8. N = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Sensibilidad a la insulina preservada después del aislamiento primario de hepatocitos. (A) Western blot de p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 y GAPDH después del tratamiento con insulina. (B) p-AKT (S473)/AKT en densitometría de western blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 en densitometría de western blot. El ensayo de sensibilidad a la insulina se llevó a cabo 16 h después del recubrimiento primario de hepatocitos. Los hepatocitos primarios se murieron de hambre durante 3 h en William's E Medium (GlutaMAX Supplement) sin FBS pero con solución antibiótica-antimicótica al 1% y con tratamiento con insulina de 100 nM en los últimos 30 min, antes de ser cosechados para la lisis proteica con 1x tampón RIPA. Los gráficos se generaron con GraphPad Prism 8. La imagen de Western blot se llevó a cabo con LI-COR Odyssey CLx. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t pareada de dos colas se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01). N = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Ensayo de producción de glucosa. (A) Western blot de PEPCK y GAPDH después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. (B) Densitometría del nivel de proteína PEPCK en comparación con GAPDH después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. (C) Nivel de glucosa en comparación con el nivel de proteína después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. El ensayo de producción de glucosa se llevó a cabo 16 h después del recubrimiento primario de hepatocitos. Los hepatocitos primarios se sintieron hambrientos durante 10 h en DMEM libre de rojo de glucosa y fenol (agregado con 2 mM L-Glutamina, 2 mM piruvato de sodio, 20 mM L-lactato de sodio, 1% Pen Strep), con glucagón de 50nM o 20 μM de forskolina y 200 μM de IBMX. El medio se cosechó para la medición de la concentración de glucosa con Glucose Assay Kit, mientras que la proteína se cosechó para Western Blot. La imagen de Western blot se llevó a cabo con LI-COR Odyssey CLx. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t pareada de dos colas se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tiempos de centrifugación | Extracción de la caja torácica | Tampones de perfusión de fabricación propia | Nudo quirúrgico | Calefacción de lámparas | Recubrimiento de placas | Cantidad de celdas aisladas/ratón | Centrifugación por gradiente | Genes marcadores de pureza | |
| Protocolo actual | 2 | No | No | No | No | No | 2,5–4 x 107 | Sí | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Sí | Sí | Sí | Sí | Sí | 1,8–2 x 107 | No | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 o 6 | No | No | No | No | Sí | 1–3 x 106 | Sí | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 o 5 | No | Sí | Sí | No | No mencionado | 1–4 x 107 | No | N/A |
| Salem et al.21. | 3 | No | Sí | No | No | No mencionado | 2 x 107 | Sí | N/A |
| Cabral et al.22. | 3 o 6 (con gradiente Centrifugación) | No | Sí | Sí | No | Sí/Recomendado | N/A | Opcional | N/A (Pureza evaluada por microscopía de luz) |
| Korelova et al.23. | 3 | No | Sí | Sí | No | Sí | N/A | Sí | N/A |
Tabla 1: Comparación de protocolos primarios de hepatocitos.
| Primer (Adelante) | Imprimación (reversa) | Referencia | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Inverso 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Adelante 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Reverso 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Adelante 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverso 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Adelante 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverso 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Adelante 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Reverso 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Adelante 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverso 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Adelante 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Reverso 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverso 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabla 2: Lista de cebadores: Cebadores utilizados para los genes TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 y TLR4
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Discussion
Se han desarrollado varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. También se han mantenido optimizados y adaptados en función de las diferentes necesidades (Tabla 1). Los protocolos de aislamiento generalmente se componen de dos partes: perfusión (incluida la digestión enzimática) y purificación.
La perfusión se puede realizar con todo el hígado in vivo 2,20,21,22,23 o con lóbulos hepáticos disecados 24. La perfusión de lóbulos disecados generalmente se restringió a los lóbulos izquierdo y medio para facilitar técnicamente. Teóricamente, la perfusión in vivo debería producir más hepatocitos primarios debido al uso de todo el hígado con todos los lóbulos. Mantener el hígado en su lugar durante la perfusión también puede reducir la muerte celular, ya que los hepatocitos in vivo se pueden bañar en líquido, ya sea sangre o tampones de perfusión, en todo momento durante este paso.
El mantenimiento de condiciones estériles también juega un papel importante en este paso. Si la condición lo permite, es mejor realizar la perfusión en una campana limpia. Todas las herramientas con contacto directo a los tejidos deben ser estériles, lo que se puede lograr mediante autoclave. Para evitar cualquier contaminación por bacterias y hongos, se agregó una solución antibiótica-antimicótica al medio de cultivo.
La CIV y la vena porta son dos vasos principales que conectan el hígado con otros órganos. La mayoría de los protocolos utilizan cualquiera de estas venas para insertar agujas para la perfusión: IVC 2,20,21,23, vena porta 22. La posición de la vena porta está en un ángulo sesgado, lo que conduce a dificultades para posicionar y estabilizar la aguja insertada. Por lo tanto, generalmente se necesita una sutura para atar la aguja en su lugar con un nudo quirúrgico, que debe hacerse con mucho cuidado ya que la vena es propensa a dañarse. En general, el diámetro de la vena porta también es más pequeño que el IVC, lo que complica la inserción de la aguja. Teniendo en cuenta esto, el uso de IVC puede ser más conveniente, aunque en algunos protocolos, la aguja también se anuda quirúrgicamente al IVC20. Se ha reportado que la perfusión con inserción de IVC resultó en hepatocitos primarios menos viables que la venaporta 25. Sin embargo, en el presente protocolo, utilizamos con éxito la inserción de IVC, y la viabilidad de hepatocitos primarios aislados (>96% en condiciones optimizadas, medida con tinción trypan Blue según el protocolo del fabricante) fue tan alta, si no más, como otros protocolos (varía entre el 80% y el 96% según los protocolos y condiciones 2,22,23,24).
Hay dos objetivos para el paso de perfusión: eliminar la sangre de los lóbulos hepáticos y digerir el hígado para liberar hepatocitos primarios. Para lograr estos objetivos, se deben utilizar al menos dos tampones, uno para el flujo sanguíneo (Flux Buffer) y otro para la digestión (Digestion Buffer). La mayoría de los protocolos preparan Flux Buffer basado en HBSS y agregan colagenasa dentro para que sea capaz de digerir, como Digestion Buffer. La preparación de estos tampones requiere mucho tiempo, y los tampones podrían variar ligeramente en algunas propiedades delicadas, como el pH, de un lote a otro, introduciendo así variables no invitadas. Teniendo en cuenta esto, la utilización de búferes disponibles comercialmente ahorra mano de obra y tiempo valiosos al tiempo que minimiza estas variables. Gibco desarrolló un protocolo para el aislamiento primario de hepatocitos de ratas adultas26, basado en el uso de medio de perfusión hepática disponible comercialmente (como tampón de flujo) y medio de digestión hepática (como tampón de digestión). El ratón y la rata, como roedores, comparten altas similitudes en las propiedades corporales; uno puede integrar estos dos tampones optimizados para ratas en el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón. De hecho, Gonçalves et al. 24, llevó a cabo con éxito la perfusión de lóbulos hepáticos disecados con estos tampones, elevando la promesa de su uso en perfusión hepática in vivo. Aquí probamos con éxito el medio de perfusión hepática y el medio de digestión hepática en el protocolo actual de hepatocitos primarios de ratón, que produjeron hepatocitos primarios viables de alta calidad (Figura 3 y Figura 4).
La temperatura del tampón de perfusión determina qué tan bien sobreviven los hepatocitos primarios al aislamiento. Si la temperatura es demasiado alta, la colagenasa dentro de Digestion Buffer puede tener una actividad reducida; si es demasiado bajo, los hepatocitos primarios pueden sufrir un choque frío, causando un posible rendimiento de aislamiento comprometido. El tiempo que tarda el tampón en fluir a través de los tubos de perfusión también determina la temperatura del tampón cuando llega al hígado. En protocolos anteriores, se utilizabaun baño de agua de 40 °C2 o 42 °C 21 . Esta temperatura puede estar sujeta a cambios según las condiciones del laboratorio, como la temperatura ambiente, la longitud del tubo de perfusión y el tipo de bomba peristáltica. En el protocolo actual, después de varias veces de prueba, optimizamos la temperatura del baño de agua a 45 ° C para calentar los tampones.
La pureza de los hepatocitos primarios aislados juega un papel importante en los experimentos posteriores, ya que cuanto mayor es la relación de pureza, menor es la interferencia posible. Aunque el hígado está compuesto principalmente de hepatocitos, que representan entre el 60% y el 80% en masa27, también están presentes varios tipos de otras células, como las células inmunes, las células estrelladas y las células endoteliales, que son importantes para las actividades inmunológicas hepáticas. Cada una de estas células podría registrar una interferencia potencial en experimentos posteriores28. Por ejemplo, las células estrelladas en el hígado también responden a las invasiones de patógenos y lesiones hepáticas, lo que implica la formación de cicatrices29. En números, el 5%-8% de la población total de células hepáticas es aportada por células estrelladas30. Normalmente, las células estrelladas están en reposo, pero este estado puede romperse cuando hay tensiones presentes. Por lo tanto, las actividades de las células estrelladas pueden desencadenarse por tensiones introducidas durante el aislamiento o el tratamiento posterior si algunas de estas células permanecen en el grupo final de hepatocitos primarios aislados. Otros tipos de células también contribuyen a una parte considerable de la población de células hepáticas, como las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC), que representan el 20% de la población total de células hepáticas31. Cómo eliminar la presencia de estas células ha sido una parte desconcertante en el proceso de aislamiento primario de hepatocitos. Por lo tanto, la purificación es una parte clave en el aislamiento primario de hepatocitos, que generalmente aprovecha las diferencias de peso y tamaño entre los diferentes tipos de células. Al optimizar la velocidad de la centrífuga y / o el tampón de purificación, los hepatocitos primarios se pueden peletizar hasta el fondo del tubo.
La separación de las células vivas de las células muertas también es fundamental para obtener hepatocitos primarios sanos y un recuento preciso de las células. Por lo general, contar el número de células es una necesidad después de la purificación, ya que los resultados de numerosos experimentos varían a medida que cambia la confluencia celular. Los reactivos de centrífugas de gradiente se pueden usar en este paso para cumplir esta misión, como Percoll. 36% -40% de Percoll en gránulos de centrífuga baja las células vivas y mantiene las células muertas en sobrenadante. Optimizamos con éxito la velocidad y el tiempo de centrifugación para reducir la población de células de hepatocitos no primarias en el presente protocolo. Se utilizaron marcadores específicos del tipo de célula para probar la pureza de los hepatocitos primarios aislados aquí, al igual que otros protocolos. Los marcadores de hepatocitos utilizados aquí fueron TTR2, CD9524,32, ASGR133 y ASGR234. Los marcadores para otros tipos de células incluyen CD45 (marcador de células inmunes), COL1A1 (marcador de células estrelladas), TIE2 (marcador de células endoteliales)2,35. Con estos marcadores, los hepatocitos primarios aislados con el presente protocolo mostraron un alto nivel de pureza (Figura 4), comparable a los protocolos anteriores 2,24.
Durante la perfusión, la colagenasa en Digestion Buffer afloja la unión entre las células al descomponer el colágeno dentro de la matriz extracelular. Esto conduce a la dificultad en el logro celular durante el recubrimiento. La mayoría de los protocolos anteriores requieren/recomiendan el recubrimiento previo de placas con colágeno 2,22 o gelatina24 para una mejor fijación de los hepatocitos primarios. Hasta donde sabemos, mientras que Salem et al. 21 y Li et al. 20 no discutieron este paso, otros protocolos evaluados en este estudio establecieron / recomendaron claramente el uso de placas pre-recubiertas 2,22,23,24. En el presente protocolo, encontramos que el recubrimiento de la placa no era necesario para las placas de ciertos tipos. Si bien no estamos seguros de si esto se debió a que los diferentes tipos de placas, especialmente si son de diferentes fabricantes, tienen una suavidad superficial diferente, y si esta suavidad variada, si alguna vez existe, juega un papel importante en la fijación primaria de hepatocitos, es beneficioso tener en cuenta que se pueda omitir otro paso (recubrimiento de placas) para la eficacia. También es importante tener en cuenta que este protocolo genera una proporción significativa de hepatocitos diploides diferenciados terminalmente, por ejemplo, junto con hepatocitos mononucleares, similares a los sinusoides hepáticos in vivo.
En este estudio, se combinaron las ventajas de los protocolos previos de aislamiento de hepatocitos primarios, y el proceso se simplificó tanto como fue posible, utilizando reactivos disponibles comercialmente y eliminando pasos innecesarios. Los pasos de centrifugación se redujeron con éxito a dos, lo que es, hasta donde sabemos, el menor número en los protocolos publicados. Para confirmar la pureza y la bioactividad de los hepatocitos primarios aislados, se evaluó el nivel de varios marcadores de células hepáticas, confirmando que el protocolo actual podría mejorar en gran medida la pureza de los hepatocitos primarios y reducir otras poblaciones de células hepáticas, como las células inmunes, las células estrelladas y las células endoteliales. La actividad de biomarcadores farmacéuticos como ASGR1, ASGR2, CD81 y TLR4 se conservó bien en hepatocitos primarios aislados con el protocolo actual, que también habían confirmado la sensibilidad a la insulina y la actividad de producción de glucosa. La principal limitación de este protocolo es el gasto ya que todos los reactivos fueron comprados comercialmente por eficiencia. No se verificó específicamente que la glucogenosis estuviera intacta en los hepatocitos primarios aislados mediante el protocolo actual, y esto puede necesitar más investigación para los estudios relacionados. Este protocolo tiene pasos de perfusión similares a los anteriores, como Salem et al.21, Severgnini et al.2 y Li et al.20, y Korelova et al.23, utilizando la inserción IVC. Sus tampones de perfusión y digestión, que pueden requerir mano de obra adicional para prepararse, también pueden funcionar con el protocolo actual con poca modificación del tiempo de digestión de las enzimas. Por lo tanto, la combinación de reactivos de protocolos anteriores con pasos del presente protocolo también puede ser beneficiosa, tanto en tiempo como en economía.
En resumen, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y trabajo de parto eficiente para el aislamiento primario de hepatocitos del hígado de ratón. Este protocolo utiliza reactivos disponibles comercialmente en su totalidad y se puede completar en ~ 35 minutos, desde la disección del ratón hasta el recubrimiento de hepatocitos primarios, proporcionando así una técnica útil para los estudios primarios relacionados con los hepatocitos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvención 5R01HD095512-02 a S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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