Summary
Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.
Abstract
Primer hepatositler karaciğer in vitro araştırmalarında , özellikle glukoz metabolizması çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman, işçilik, maliyet ve primer hepatosit kullanımı gibi farklı ihtiyaçlara göre bir baz tekniği uyarlanmış ve çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri sağlanmıştır. Bununla birlikte, primer hepatosit izolasyonundaki sayısız basamak ve zaman alıcı reaktif preparatları, verimlilik için önemli dezavantajlardır. Farklı protokolleri artıları ve eksileri için karşılaştırdıktan sonra, her birinin avantajları birleştirildi ve hızlı ve verimli bir primer hepatosit izolasyon protokolü formüle edildi. Sadece ~ 35 dakika içinde, bu protokol diğer protokoller kadar olmasa da, sağlıklı primer hepatositler üretebilir. Ayrıca, izole primer hepatositler kullanılarak yapılan glukoz metabolizması deneyleri, in vitro karaciğer metabolizması çalışmalarında bu protokolün yararlılığını doğrulamıştır. Ayrıca, gelecekteki araştırmacıların bu protokolü ihtiyaçlara göre daha da optimize edebilmeleri için bu çalışmadaki her adımın önemini ve amacını kapsamlı bir şekilde gözden geçirdik ve analiz ettik.
Introduction
Karaciğer, gıda sindirimi, kan dolaşımı ve detoksifikasyon gibi yaşamı destekleyen birçok fonksiyonda oynadığı hayati rol nedeniyle omurgalı vücudundaki en önemli organlardan biri olarak hizmet eder. Fare primer hepatosit in vitro kültürünün kullanımı, karbonhidrat metabolizması ve hepatik karsinom çalışmalarında giderek daha popüler hale gelmektedir. Bu nedenle, doğuştan gelen fizyolojik işlevini korurken fare primer hepatosit izolasyonu için uygun bir yöntem geliştirmek önemlidir. Glikoz metabolizmasının merkezi olarak işlevi nedeniyle, karaciğer aynı zamanda glikoz üretimi ve depolanması için de merkezidir1. Primer hepatositlerle yapılan deneyler in vitro olarak çoğu glukoz metabolizması çalışması için bir zorunluluktur. Bu nedenle, yıllarca, çeşitli araştırma grupları fare primer hepatosit izolasyonu için protokoller geliştirmiştir.
Fare hepatosit izolasyonunun genel prosedürü, önce karaciğerdeki kanı fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) gibi izosmotik bir sıvı ile temizlemek ve daha sonra hepatositleri ayırmak için kollajenaz içeren çözelti kullanmaktır. Bu protokoller genel bir prosedürü paylaşır, ancak farklı ihtiyaçlara göre reaktiflerde ve adımlarda farklılık gösterir. Ancak, gerekli reaktiflerin hazırlanması ve izolasyon adımlarının uygulanması zaman alır. Mevcut protokolün geliştirilmesinde verimlilik, kullanıma hazır ve piyasadan temin edilebilen tüm reaktifler ve mümkün olduğunca az adımla bir öncelik olarak belirlenmiştir. Bu protokolün genel amacı, izole edilmiş primer hepatosit saflığını ve canlılığını tehlikeye atmadan, primer hepatositleri fareden izole etmek için hızlı ve emek verimli bir yöntem sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57BL/6 dişi fareler (8 haftalık) kullanılmıştır.
1. Hazırlık:
- Kültür ortamını yapmak için William'ın E Medium'unu (GlutaMAX Takviyesi)% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile karıştırın.
- Partikül kalıntılarını gidermek için 25 mL kollajenaz-dispaz ortamını (örneğin, Karaciğer Sindirim Ortamı) 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden filtreleyin.
- Sıcak 50 mL çift damıtılmış H 2 O (ddH2O), 35mL perfüzyon Ortamı (örneğin, Karaciğer Perfüzyon Ortamı) (veya bu protokolü ilk kez kullanarak 50 mL) ve 30 dakika boyunca 45 ° C'lik bir su banyosunda 25 mL filtrelenmiş kollajenaz-dispase ortam.
- Steril bir doku kültürü davlumbazında, 20 mL 1x Percoll-HBSS yapmak ve buz veya 4 °C üzerinde tutmak için 50 mL'lik bir tüpte 2 mL 10x HBSS ve 18 mL Percoll karıştırın.
NOT: 1x Percoll-HBSS en az 6 ay boyunca 4 °C'de tutulabilir. - Steril bir doku kültürü davlumbazının içinde, temiz bir Petri kabına 30 mL yıkama ortamı (örneğin, Hepatosit Yıkama Ortamı) dökün ve buz üzerinde tutun.
- Pompalama borusunu 45 °C'lik bir su banyosunun suyuna batırın. Oda sıcaklığı 25 °C'de ise sonuçlar en güvenilirdir.
- 225 μL Ketamin HCL, 93.75 μL Ksilazin ve 1681 μL 1x PBS karıştırarak 2 mL 1x anestezik hazırlayın.
- Onaylanmış bir yöntem kullanarak bir fareyi uyuşturun. Burada fareye intraperitoneal olarak 150 μL 1x anestezik enjekte edildi. Tam anesteziyi sağlamak için ayak parmağı sıkışmasına reaksiyon gibi refleks kaybı testlerini gerçekleştirin.
- Fareyi sırt üstü diseksiyon pedine dört uzuvla, iğneleyerek veya su geçirmez bant veya kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (veya eşdeğerleri) tarafından onaylanan diğer yöntemleri kullanarak sabitleyin.
- Diseksiyon için sterilize forseps ve makas hazırlayın. Olası kontaminasyonu önlemek için, tüm adımları steril bir başlık içinde uygulayın.
2. Prosedür:
- Peristaltik bir pompa kullanarak, ısıtılmış ddH2O'yu 5 dakika boyunca 4 mL/dak hızla pompalamaya başlayın. Pompalama tüpünü sudan ısıtılmış bir perfüzyon ortamına değiştirin.
- Anestezi uygulanan farenin karnını% 70 EtOH ile dezenfekte edin ve karaciğeri, portal veni ve inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarmak için bir makasla açın.
- Peristaltik pompayı durdurun. IVC'ye 24 G'lik bir kateter (örneğin, Kapalı IV Kateter, 24 G, 0,75 IN) yerleştirin. Pompalamaya başlayın ve portal damarı açın.
- Yıkanan sıvı temizlenene kadar pompalamaya devam edin (yaklaşık 3-5 dakika). Sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Hava kabarcıklarının IVC'ye girmesine izin vermemeye dikkat edin.
NOT: Bu adım, karaciğerden mümkün olduğunca fazla kan akıtmaktır. - Pompalama tüpünü perfüzyon ortamından kollajenaz-dispase ortamına değiştirin. Adım 2.6 yapılırken kollajenaz-dispase ortamın 25 mL'sinin tamamı tükenene kadar pompalamaya devam edin.
- Sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın.
NOT: Bu aşamada, tamamen kan kaybı fare için ölümcüldür. Farenin ölümü, deneyden sonra kalp atışı eksikliği ile doğrulanabilir. Karkası tesis politikalarına göre bertaraf edin. - Tüm karaciğeri safra kesesi olmadan buz üzerindeki Petri kabındaki 30 mL yıkama ortamına izole edin.
- Primer hepatositleri çözeltiye bırakmak için forseps ile parçalara ayırın. Bu adım, yıkama ortamını salınan birincil hepatositler ve küçük karaciğer parçaları ile dolu bulutlu bir çözeltiye dönüştürecektir.
- Bulutlu çözeltiyi adım 2,8'de 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerindeki 50 mL'lik bir tüpte 20 mL 1x Percoll-HBSS'ye filtreleyin. Tüpü 20 kez ters çevirerek karıştırın.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- Doku kültürü davlumbazının içinde, süpernatanı aspire edin. Peleti soğuk 30 mL yıkama ortamı ile yıkayın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 50 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve peleti, doku kültürü davlumbazındaki kültür ortamının (veya uygun diğer hacimlerin) 25 mL'sinde yeniden askıya alın.
- Hücre numarasını sayın ve istenen kültür plakalarındaki hücreleri deneysel tasarıma göre plakalayın.
NOT: 8 haftalık bir fareden uygun şekilde izole edilen birincil hepatositler genellikle dört adet 6 delikli plaka veya dört adet 12 delikli plaka üzerine kaplanmak için yeterlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etkinliği test etmek için, mevcut primer hepatosit izolasyon protokolü 8 haftalık dişi C57BL/6 farelerde uygulandı. İzole primer hepatositlerin ataşmanı ve saflığı test edildi. Primer hepatosit izolasyonu, hepatik ilaç etkileri ve glukoz metabolizması, farmasötik biyobelirteç aktivitesi2, insülin duyarlılığı ve glikoz üretimi gibi karaciğer fizyolojisi üzerine çok çeşitli deneyler için kullanılır. Bu nedenle, bu protokolle izole edilen primer hepatositlerin aktiviteleri aşağıdaki deneylerde test edilmiştir.
Mevcut protokolde primer hepatosit bağlantısı için kaplama gerekli değildi
İzole edilen primer hepatositler 6 delikli bir plaka üzerine 5 x 105 hücre/kuyucuk şeklinde kaplandı. 1 saat sonra sıkı bir ataşman gözlendi ve primer hepatositler kaplamadan 12 saat sonra tamamen genişledi (Şekil 3). Bu, kaplamadan 12 saat sonra, hücrelerin deneyler için kullanılmaya hazır olduğunu gösterdi. Karaciğer içindeki fare hepatositlerinin çekirdek morfolojisine dayanarak, mononükleer hepatositler sınırlarda zenginleştirilirken, terminal farklılaşmanın bir imzası olan binüclear/polinükleer hepatositler ortada 3,4 idi. Görüntülenen önemli miktarda hücre, canlı primer hepatositlerin izole edilmesi ve saflaştırılmasının başarısını gösteren tipik çift çekirdekli (diploid) morfolojiyi sergiledi. Bu aynı zamanda kollajen kaplamanın bu protokolle primer hepatosit bağlantısı için bir gereklilik olmadığını da gösterir.
İzole primer hepatosit popülasyonunda saflık zenginleştirildi
İzole primer hepatosit saflığını kontrol etmek için önceki protokollerde çeşitli hücre tipine özgü gen belirteçleri kullanılmıştır (Tablo 1). TTR (Transtiretin), CD95 (Fas olarak da bilinen farklılaşma kümesi 95), ASGR1 (Asialoglycoprotein reseptörü 1) ve ASGR2 hepatositler için belirteçlerdir. İzolasyondan sonra, bu hepatosit belirteçlerinin mRNA düzeyleri tüm karaciğere kıyasla anlamlı olarak artmıştır (Şekil 4A-D, H).
Bu protokol aynı zamanda diğer hepatik hücrelerden gelen paraziti de büyük ölçüde azalttı. İmmün hücrelerin, yıldız hücrelerinin ve endotel hücrelerinin varlığı, CD45 (immün hücre belirteci), COL1A1 (Kollajen, tip I, alfa 1, yıldız hücre belirteci) ve TIE2'nin (Tunica interna endotel hücre kinaz, endotel hücre belirteci) mRNA seviyelerinin tüm karaciğere kıyasla keskin bir şekilde azalmasıyla gösterilmiştir (Şekil 4E-H ). Bunlar, bu protokolün primer hepatosit popülasyonunu hepatik hücrelerden arındırabileceğini ve böylece deneylerdeki diğer hücre tiplerinden olası paraziti azaltabileceğini düşündürmektedir.
Farmasötik biyobelirteçlerin aktivitesi korunmuştur
Hepatositler üzerindeki biyobelirteçler, ilaç hedefleme ve dağıtımı için yaygın olarak kullanılmaktadır. Farmasötik biyobelirteçlerin aktivitesinin korunması bu nedenle primer hepatosit izolasyonunda kilit bir noktadır ve primer hepatosit izolasyonu2'nin yararlılığını test etmek için bir standarttır. Hepatosit belirteçleri ASGR1 ve ASGR2 bu şekilde kullanılır2. İlk önce bu iki belirtecin zaman-kurs ekspresyon seviyesini primer hepatosit kaplamadan önce ve sonra test ettik. Kaplamadan sonra, mRNA seviyeleri zamanla önemli ölçüde azaldı, ancak seviyeler, özellikle ASGR1 için, kaplamadan sonraki 12 saatlik zaman noktasına kadar tüm karaciğere kıyasla önemli ölçüde kaldı (Şekil 5A, B). İfade eğilimi önceki bir rapor2 ile tutarlıydı ve karşılaştırılabilir primer hepatosit sağlığını gösterdi. Çeşitli patojenler, hepatit virüsü5, Plasmodium falciparum ve Plasmodium yoelii6 gibi hücrelere ve enfeksiyonlara girişlerini kolaylaştırmak için hepatosit zarına bağlı bir protein olan CD81'i hedefler. TLR4 (Toll benzeri reseptör 4) gibi diğer hepatosit membran bulunan proteinler de patojenler tarafından hedeflenir ve hepatosit immün yanıtı7 için önemlidir. Kaplamadan sonra, CD81'in ekspresyon seviyesi 48 saate kadar tutarlıydı (Şekil 5C). TLR4 ekspresyon seviyesi genellikle artmıştır, ancak 48 saat sonra, in vivo'dan daha yüksek bir seviyeye ulaşana kadar artmamıştır (Şekil 5D). Bunlar, bu protokol tarafından izole edilen primer hepatositlerin, kaplamadan sonra en az 48 saat içinde CD81 ve TLR4 çalışmaları için de kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu sonuçlar birlikte, izole edilen primer hepatositlerin farmasötik biyobelirteçlerle ilgili çalışmalarda kullanım için geçerli olduğunu göstermektedir. RNA ve protein seviyelerinin, sinyal peptidi kaynaklı RNA göçü, posttranslasyonel modifikasyon ve / veya protein yıkımı gibi transkripsiyon sonrası aktivitelerin etkileri nedeniyle tutarsız olabileceğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, deneysel paradigmanın gerektirdiği takdirde, mRNA ile tanımlanan farmasötik biyobelirteçlerin protein seviyesi ve biyoaktivite doğrulaması gerekli olabilir.
İzole primer hepatositler insüline duyarlıydı
Glukoz metabolizması deneylerinde primer hepatosit performansı da analiz edildi. Glikoz metabolizmasında merkezi bir rol oynayan bir hormon olan insülin, glikoz seviyesini düşürür, HEPATIK glikoz alımını ve fosforilasyon AKT ve FOXO1 (Forkhead kutusu O1) yoluyla depolanmasını teşvik eder. Bu nedenle, izole primer hepatositlerle insülin duyarlılığı testi yapıldı. 16 saat sonra, hücreler serumsuz bir ortamla 3 saat boyunca aç bırakıldı. Açlığın son 0.5 saatinde, kültür ortamına 100 nM insülin uygulandı. Şekil 6A-C'de gösterildiği gibi, insülin, Ser473'te hem AKT'nin hem de Ser256'da FOXO1'in fosforilasyonunu önemli ölçüde destekledi ve primer hepatositlerin insüline duyarlılığını gösterdi. Bu, mevcut protokolden izole edilen primer hepatositlerin insülin / glikoz metabolizması çalışmalarında yararlı olduğunu düşündürmektedir.
İzole primer hepatositler glukoz üretimi yapabiliyordu
Sadece glikoz depolama için bir merkez değil, aynı zamanda hepatositler de glikoz üretiminden sorumludur. İzole ettiğimiz primer hepatositlerin glikoz üretimi çalışmalarında yararlı olup olmadığını test etmek için, hücreler glikoz üretimini uyarmak için glukagon varlığında 10 saat boyunca aç bırakıldı. Açlık ortamı daha sonra glikoz testi için toplanırken, hücreler batı lekesi için toplandı. Fosfoenolpiruvat karboksikinaz (PEPCK), karaciğer glikoz üretiminde önemli bir bileşendir ve hızınıkontrol eder 8. Glukagon tedavisinden sonra PEPCK'nin protein düzeyi anlamlı olarak artmıştır, bu da glukoz üretim yolunun aktive olduğunu düşündürmektedir (Şekil 7A, B). Bu aktivasyon, artan glikoz üretim seviyesi ile daha da doğrulandı (Şekil 7C). Bu fenomen, forskolin artı IBMX gibi diğer glikoz üretim uyarıcıları ile de doğrulanmıştır (Şekil 7A-C). Bununla birlikte, bu deneyin sınırlaması nedeniyle, glikoz üretiminin glukoneogenez yoluyla münhasır olup olmadığını veya glikojenolizin bir bileşeni olup olmadığını doğrulayamadık.
Resim 1: Tezgah kurulumu. (A) Primer hepatosit izolasyonu için tezgah kurulumu. (B) Primer hepatosit izolasyonu için karikatürize edilmiş tezgah kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare diseksiyonu, perfüzyon ve primer hepatosit saflaştırması. (A) Okları karaciğere, IVC'ye ve portal damara işaret eden disseke edilmiş fare. (B) IVC'ye kateter takılması. (C) Portal venin basınçlandırılması, karaciğer loplarının genişlemesine ve sertliğine neden olarak başarılı perfüzyonu gösterir. (D) Perfüzyon sonrası yumuşatılmış karaciğer lopları, kollajenaz sindiriminin başarısını gösterir. (E) Safra kesesinin izole karaciğerdeki konumu (safra kesesine işaret eden ok). (F) Safra kesesi çıkarılması. (G) Hepatosit yıkama ortamında yırtılmış karaciğer. (H) Santrifüjden önce 1x Percoll-HBSS'nin filtrelenmiş primer hepatosit ile karıştırılması. (I, J) santrifüj sonrası primer hepatosit peleti. (K) Hepatosit yıkama ortamı içinde primer hepatosit resüspansiyonu. (L, M) Santrifüjden sonra hepatosit yıkama ortamında oluşan primer hepatosit peleti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kaplama sonrası primer hepatositler. Görüntüler (A)1 saat, (B, C) 12 saat, (D) 24 saat, (E) 36 saat, (F) 48 saat, (G) 72 saat ve (H) 96 saat primer hepatosit kaplamadan sonra çekildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İzolasyondan sonra artmış primer hepatosit saflığı. RNA, önceki bir protokol9'a göre, primer hepatosit izolasyonundan önce (tüm karaciğerden) ve sonra (izole primer hepatositlerden) izole edildi, ardından ters transkripsiyon PCR ile takip edildi. Primer hepatosit saflığı, hepatosit belirteçleri (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 ve (D) ASGR2 için primerler ile gerçek zamanlı PCR ile değerlendirilirken, aynı zamanda immün hücre belirteci (E) CD45, (F) Stellat hücre belirteci COL1A1 ve (G) endotel hücre belirteci TIE2 ile değerlendirildi. (H) Isı haritası, primer hepatosit izolasyonundan önce ve sonra hücre tipi belirteçlerinin ekspresyon değişiklikleri için oluşturulmuştur. İç kontrol olarak GAPDH (Gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz) kullanıldı. Burada kullanılan astarlar genler içindi (Astar dizileri Tablo 2'dedir. Dizi referansları burada belirtilmiştir): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Grafikler ve ısı haritası GraphPad Prism 8 ile oluşturuldu. Hata çubuğu Standart Sapmayı gösterir ve iki kuyruklu eşleşmemiş (birincil hepatosit ve tüm karaciğer örnekleri eşleştirilmediğinden, çünkü bu protokol başlangıçta bozulmamış karaciğer gerektirir) t-testi önemi yıldız işaretleri ile gösterilir (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N=7. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farmasötik biyobelirteçlerin ekspresyonu. RNA, kaplamadan sonra tüm karaciğerden ve primer hepatositten izole edildi, ardından ters transkripsiyon PCR izledi. Farmasötik biyobelirteçlerin ekspresyonu, (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 ve (D) TLR4 primerleri ile gerçek zamanlı PCR ile değerlendirildi. GAPDH bir iç kontrol olarak kullanıldı. Burada kullanılan yeni primerler genler içindi (Primer dizileri Tablo 2'dedir. Dizi referansları burada belirtilmiştir): CD8118; TLR419. Grafikler GraphPad Prism 8 ile oluşturuldu. N = 5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Primer hepatosit izolasyonundan sonra insülin duyarlılığı korunmuştur . (A) İnsülin tedavisinden sonra p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 ve GAPDH'nin batı lekesi. (B) Batı lekesinin dansitometrisinde p-AKT (S473)/AKT. (C) Batı lekesinin dansitometrisinde p-FOXO1 (S256)/FOXO1. İnsülin duyarlılık testi primer hepatosit kaplamasından 16 saat sonra yapıldı. Primer hepatositler, FBS olmadan William'ın E Medium'unda (GlutaMAX Supplement) 3 saat boyunca aç bırakıldı, ancak% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve son 30 dakikada 100 nM insülin tedavisi ile, 1x RIPA tamponu ile protein lizisi için hasat edilmeden önce. Grafikler GraphPad Prism 8 ile oluşturuldu. Hata çubuğu Standart Sapmayı gösterir ve iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi anlamlılığı yıldız işaretleri ile gösterilir (* p < 0.05; ** p < 0.01). N = 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Glikoz üretim testi. (A) 10 saat boyunca glukagon veya forskolin+IBMX tedavisinden sonra PEPCK ve GAPDH'nin batı lekesi. (B) 10 saat boyunca glukagon veya forskolin+IBMX tedavisinden sonra GAPDH ile karşılaştırıldığında PEPCK protein düzeyinin densitometrisi. (C) 10 saat boyunca glukagon veya forskolin+IBMX tedavisinden sonra protein düzeyine kıyasla glukoz düzeyi. Glukoz üretim testi, primer hepatosit kaplamasından 16 saat sonra yapıldı. Primer hepatositler, glikoz ve fenol kırmızısı içermeyen DMEM'de (2 mM L-Glutamin, 2 mM Sodyum Piruvat, 20 mM Sodyum L-Laktat,% 1 Kalem Strep ile eklenir), 50nM glukagon veya 20 μM forskolin ve 200 μM IBMX ile 10 saat boyunca aç bırakıldı. Ortam, Glikoz Tahlil Kiti ile glikoz konsantrasyonu ölçümü için hasat edilirken, protein batı lekesi için hasat edildi. Hata çubuğu Standart Sapmayı gösterir ve iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi anlamlılığı yıldız işaretleri ile gösterilir (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N = 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Santrifüj süreleri | Kaburga Kafesi Çıkarma | Perfüzyon Tamponları kendi kendini oluşturur | Cerrahi Düğüm | Lambalı Isıtma | Plaka Kaplama | İzole edilmiş hücre miktarı/fare | Degrade Santrifüjleme | Saflık İşaretleyici Genler | |
| Mevcut protokol | 2 | Hayır | Hayır | Hayır | Hayır | Hayır | 2,5–4 x 107 | Evet | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini ve ark.2. | 4 | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet | 1,8–2 x 107 | Hayır | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves ve ark.24. | 5 veya 6 | Hayır | Hayır | Hayır | Hayır | Evet | 1–3 x 106 | Evet | CD45, CD95 |
| Li ve ark.20. | 4 veya 5 | Hayır | Evet | Evet | Hayır | Bahsedilmedi | 1–4 x 107 | Hayır | YOK |
| Salem ve ark.21. | 3 | Hayır | Evet | Hayır | Hayır | Bahsedilmedi | 2 x 107 | Evet | YOK |
| Cabral ve ark.22. | 3 veya 6 (gradyan santrifüjleme ile) | Hayır | Evet | Evet | Hayır | Evet/Önerilen | YOK | Opsiyonel | N/A (Işık mikroskobu ile değerlendirilen saflık) |
| Korelova ve ark.23. | 3 | Hayır | Evet | Evet | Hayır | Evet | YOK | Evet | YOK |
Tablo 1: Primer hepatosit protokollerinin karşılaştırılması.
| Astar (İleri) | Astar (Ters) | Referans | ||
| TTR İleri 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Ters 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 İleri 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Ters 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 İleri 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Ters 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 İleri 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGGGGGG | ASGR2 Ters 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 İleri 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Ters 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 İleri 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Ters 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 İleri 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Ters 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH İleri 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Ters 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 İleri 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Ters 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 İleri 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Ters 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tablo 2: Astarların listesi: TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 ve TLR4 genleri için kullanılan primerler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri geliştirilmiştir. Ayrıca farklı ihtiyaçlara göre optimize edilmiş ve uyarlanmıştır (Tablo 1). İzolasyon protokolleri genellikle iki bölümden oluşur: perfüzyon (enzim sindirimi dahil) ve saflaştırma.
Perfüzyon tüm karaciğer in vivo 2,20,21,22,23 veya disseke karaciğer lobları 24 ile yapılabilir. Diseke lobların perfüzyonu teknik kolaylık sağlamak için genellikle sol ve orta loblarla sınırlıydı. Teorik olarak, in vivo perfüzyon, tüm karaciğerin tüm loblarla birlikte kullanımı nedeniyle daha fazla primer hepatosit vermelidir. Perfüzyon sırasında karaciğeri yerinde tutmak, hücre ölümünü de azaltabilir, çünkü hepatositler in vivo, bu adım sırasında her zaman kan veya perfüzyon tamponları gibi sıvıyla yıkanabilir.
Steril koşulların korunması da bu adımda önemli bir rol oynar. Durum izin veriyorsa, temiz bir davlumbazda perfüzyon yapmak daha iyidir. Dokulara doğrudan temas eden tüm aletler, otoklav ile elde edilebilecek steril olmalıdır. Bakteri ve mantarlardan kaynaklanan herhangi bir kontaminasyonu önlemek için, kültür ortamına bir antibiyotik-antimikotik çözelti eklenmiştir.
IVC ve portal ven, karaciğeri diğer organlara bağlayan iki ana damardır. Çoğu protokol, perfüzyon için iğneler yerleştirmek için bu damarlardan birini kullanır: IVC 2,20,21,23, portal ven 22. Portal damarın konumu eğri bir açıdadır, bu da yerleştirilen iğnenin konumlandırılmasında ve stabilize edilmesinde zorluğa yol açar. Bu nedenle, iğneyi cerrahi bir düğümle yerine bağlamak için genellikle bir dikişe ihtiyaç vardır, bu da damar hasara eğilimli olduğu için çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Genel olarak, portal venin çapı da IVC'den daha küçüktür ve iğne yerleştirmeyi zorlaştırır. Bunu göz önünde bulundurarak, IVC kullanımı daha uygun olabilir, ancak bazı protokollerde iğne cerrahi olarak IVC20'ye düğümlenir. IVC yerleştirilmesi ile perfüzyonun portal ven25'e göre daha az uygulanabilir primer hepatositlerle sonuçlandığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, mevcut protokolde, IVC yerleştirmeyi başarıyla kullandık ve izole birincil hepatosit canlılığı (optimize edilmiş koşullarda% >96, üreticinin protokolüne göre Tripan Mavisi boyama ile ölçülür), diğer protokoller kadar olmasa da, diğer protokoller kadar yüksekti (protokollere ve koşullara göre% 80 ila% 96 arasında değişir2,22,23,24).
Perfüzyon adımının iki amacı vardır: kanı karaciğer loblarından temizlemek ve primer hepatositleri serbest bırakmak için karaciğeri sindirmek. Bu hedeflere ulaşmak için, biri kan akısı (Akı Tamponu) ve diğeri sindirim (Sindirim Tamponu) için olmak üzere en az iki tampon kullanılmalıdır. Protokollerin çoğu HBSS tabanlı Akı Tamponu hazırlar ve Sindirim Tamponu olarak sindirim yeteneğine sahip olması için içine kollajenaz ekler. Bu tamponların hazırlanması zaman alıcıdır ve tamponlar, pH gibi bazı hassas özelliklerde, partiden partiye biraz değişebilir, bu nedenle istenmeyen değişkenler ortaya çıkabilir. Bunu göz önünde bulundurarak, ticari olarak temin edilebilen tamponların kullanılması, bu değişkenleri en aza indirirken değerli işgücü ve zamandan tasarruf sağlar. Gibco, ticari olarak temin edilebilen Karaciğer Perfüzyon Ortamı (Akı Tamponu olarak) ve Karaciğer Sindirim Ortamı (Sindirim Tamponu olarak) kullanımına dayanarak, yetişkin sıçanlardan birincil hepatosit izolasyonu için bir protokol geliştirdi26. Fare ve sıçan, kemirgenler olarak, vücut özelliklerinde yüksek benzerlikler paylaşır; sıçan için optimize edilmiş bu iki tampon, fare primer hepatosit izolasyonuna entegre edilebilir. Gerçekten de, Gonçalves ve ark. 24, disseke karaciğer loblarının bu tamponlarla perfüzyonunu başarıyla gerçekleştirdi ve karaciğer perfüzyonunda in vivo kullanımlarının vaadini yükseltti. Burada, Karaciğer Perfüzyon Ortamı ve Karaciğer Sindirim Ortamı, yüksek kaliteli canlı primer hepatositler veren mevcut fare primer hepatosit protokolünde başarıyla test edildi (Şekil 3 ve Şekil 4).
Perfüzyon tamponunun sıcaklığı, primer hepatositlerin izolasyonda ne kadar iyi hayatta kalacağını belirler. Sıcaklık çok yüksekse, Sindirim Tamponu içindeki kollajenaz aktiviteyi azaltmış olabilir; Çok düşükse, birincil hepatositler soğuk şokuna maruz kalabilir ve bu da olası tehlikeye giren izolasyon verimine neden olabilir. Tamponun perfüzyon borusundan akması için gereken süre, karaciğere ulaştığında tamponun sıcaklığını da belirler. Önceki protokollerde 40 °C2 veya 42 °C21 su banyosu kullanılmıştır. Bu sıcaklık, ortam sıcaklığı, perfüzyon tüpünün uzunluğu ve Peristaltik Pompa tipi gibi laboratuvar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Mevcut protokolde, birçok kez test edildikten sonra, tamponları ısıtmak için su banyosu sıcaklığını 45 ° C olacak şekilde optimize ettik.
İzole edilmiş primer hepatositlerin saflığı, sonraki deneylerde önemli bir rol oynar, çünkü saflık oranı ne kadar yüksek olursa, o kadar az olası girişim olur. Karaciğer esas olarak hepatositlerden oluşmasına rağmen, kitle27 tarafından% 60-80'i oluştururken, hepatik immünolojik aktiviteler için önemli olan bağışıklık hücreleri, yıldız hücreleri ve endotel hücreleri gibi çeşitli diğer hücre tipleri de mevcuttur. Bu hücrelerin her biri, daha sonraki deneylerde potansiyel bir girişim yayınlayabilir28. Örneğin, karaciğerdeki yıldız hücreleri, skar oluşumu29'u içeren patojen istilalarına ve karaciğer yaralanmalarına da yanıt verir. Sayılarla, toplam hepatik hücre popülasyonunun% 5-8'ine yıldız hücreleri katkıda bulunur30. Normalde, yıldız hücreleri sessizlik içindedir, ancak stresler mevcut olduğunda bu durum kırılabilir. Bu nedenle, yıldız hücresi aktiviteleri, bu hücrelerin bir kısmı son izole primer hepatosit havuzunda kalırsa, izolasyon veya sonraki tedavi sırasında ortaya çıkan stresler tarafından tetiklenebilir. Diğer hücre tipleri de, karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) gibi hepatik hücre popülasyonunun önemli bir kısmına katkıda bulunur ve toplam hepatik hücre popülasyonunun% 20'sini oluşturur31. Bu hücrelerin varlığının nasıl ortadan kaldırılacağı, primer hepatosit izolasyon sürecinde şaşırtıcı bir rol oynamıştır. Bu nedenle, saflaştırma, genellikle farklı hücre tipleri arasındaki ağırlık ve boyut farklılıklarından yararlanan birincil hepatosit izolasyonunda önemli bir parçadır. Santrifüj hızını ve / veya saflaştırma tamponunu optimize ederek, birincil hepatositler tüpün dibine kadar pelet edilebilir.
Canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırmak, sağlıklı primer hepatositlerin elde edilmesinde ve doğru hücre sayımında da kritik öneme sahiptir. Genellikle, saflaştırmadan sonra hücre sayısını saymak bir zorunluluktur, çünkü çok sayıda deneyin sonuçları hücre birleşmesi değiştikçe değişir. Degrade santrifüj reaktifleri, Percoll gibi bu görevi yerine getirmek için bu adımda kullanılabilir. Santrifüjdeki Percoll'un% 36-40'ı canlı hücreleri toplar ve ölü hücreleri süpernatant içinde tutar. Mevcut protokolde primer olmayan hepatosit hücre popülasyonunu azaltmak için santrifüjleme hızını ve süresini başarıyla optimize ettik. Diğer protokoller gibi, burada izole primer hepatositlerin saflığını test etmek için hücre tipine özgü belirteçler kullanılmıştır. Burada kullanılan hepatosit belirteçleri TTR2, CD95 24,32, ASGR133 ve ASGR2 34 idi. Diğer hücre tipleri için belirteçler CD45 (immün hücre belirteci), COL1A1 (Yıldız hücre belirteci), TIE2 (Endotel hücre belirteci)2,35'tir. Bu belirteçlerle, mevcut protokolle izole edilen primer hepatositler, önceki protokoller 2,24 ile karşılaştırılabilir yüksek düzeyde saflık göstermiştir (Şekil 4).
Perfüzyon sırasında, Sindirim Tamponundaki kollajenaz, hücre dışı matris içindeki kollajeni parçalayarak hücreler arasındaki bağlantıyı gevşetir. Bu, kaplama sırasında hücre elde edilmesinde zorluğa yol açar. Önceki protokollerin çoğu, primer hepatositlerin daha iyi bağlanması için plakaların kollajen 2,22 veya jelatin24 ile önceden kaplanmasını gerektirir / önerir. Bildiğimiz kadarıyla, Salem ve ark. 21 ve Li ve ark. 20 kişi bu adımı tartışmamış, bu çalışmada değerlendirilen diğer protokoller 2,22,23,24 ön kaplamalı plakaların kullanımını açıkça belirtmiş / önermiştir. Mevcut protokolde, plaka kaplamasının belirli tipteki plakalar için gerekli olmadığını bulduk. Bunun nedeninin, özellikle farklı üreticilerden geliyorlarsa, farklı plaka tiplerinin farklı yüzey pürüzsüzlüğüne sahip olup olmadığından emin olmasak da, bu çeşitli pürüzsüzlüğün, eğer varsa, birincil hepatosit ataşmanında önemli bir rol oynayıp oynamadığından emin olmasak da, etkinlik için başka bir adımın (plaka kaplama) atlanabileceğini belirtmek faydalı olacaktır. Bu protokolün, in vivo hepatik sinüzoide benzer şekilde, mononükleer hepatositlerle birlikte, örneğin diploid hepatositlerin önemli bir bölümünü oluşturduğuna dikkat etmek de önemlidir.
Bu çalışmada, önceki primer hepatosit izolasyon protokollerinin avantajları birleştirildi ve ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak ve gereksiz adımlar ortadan kaldırılarak süreç mümkün olduğunca basitleştirildi. Santrifüjleme adımları başarılı bir şekilde ikiye düşürüldü, bu da bildiğimiz kadarıyla yayınlanmış protokollerde en az olanı. İzole primer hepatositlerin saflığını ve biyoaktivitesini doğrulamak için, çeşitli hepatik hücre belirteçlerinin seviyesi değerlendirildi ve mevcut protokolün primer hepatosit saflığını büyük ölçüde artırabileceğini ve bağışıklık hücreleri, yıldız hücreleri ve endotel hücreleri gibi diğer hepatik hücre popülasyonlarını azaltabileceğini doğruladı. ASGR1, ASGR2, CD81 ve TLR4 gibi farmasötik biyobelirteçlerin aktivitesi, insülin duyarlılığını ve glikoz üretim aktivitesini de doğrulayan mevcut protokolle izole edilen primer hepatositlerde iyi korunmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması, tüm reaktifler verimlilik için ticari olarak satın alındığından masraftır. Mevcut protokol kullanılarak izole edilen primer hepatositlerde glikojenozun sağlam olduğunu spesifik olarak doğrulamadık ve bunun ilgili çalışmalar için daha fazla araştırmaya ihtiyacı olabilir. Bu protokol, IVC yerleştirmeyi kullanarak Salem ve ark.21, Severgnini ve ark.2 ve Li ve ark.20 ve Korelova ve ark.23 gibi öncekilere benzer perfüzyon adımlarına sahiptir. Hazırlanmak için ekstra emek gerektirebilecek perfüzyon ve sindirim tamponları, enzim sindirim süresinin çok az modifikasyonu ile mevcut protokolle de çalışabilir. Bu nedenle, önceki protokollerin reaktiflerini mevcut protokolün adımlarıyla birleştirmek, hem zaman hem de ekonomik açıdan yararlı olabilir.
Özetle, fare karaciğerinden primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen reaktifleri tamamen kullanır ve farenin diseksiyonundan primer hepatositlerin kaplanmasına kadar ~ 35 dakika içinde tamamlanabilir, böylece primer hepatosit ile ilgili çalışmalara yararlı bir teknik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
