Experimentelle autoimmune Uveitis: Ein intraokulares entzündliches Mausmodell

Zusammenfassung

In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll vor, das es dem Prüfarzt ermöglicht, ein Mausmodell der intraokularen Uveitis zu erstellen. Dieses etablierte Modell, das gemeinhin als experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bezeichnet wird, erfasst viele Aspekte menschlicher Erkrankungen. Im Folgenden beschreiben wir, wie das Fortschreiten der Krankheit mit mehreren Ablesungen induziert und überwacht werden kann.

Zusammenfassung

Die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) wird von Immunzellen angetrieben, die auf Selbstantigene reagieren. Viele Merkmale dieses nicht-infektiösen, intraokularen Entzündungskrankheitsmodells rekapitulieren den klinischen Phänotyp der posterioren Uveitis, die den Menschen betrifft. EAU wurde zuverlässig eingesetzt, um die Wirksamkeit neuartiger Entzündungstherapeutika und ihre Wirkungsweise zu untersuchen und die Mechanismen weiter zu untersuchen, die das Fortschreiten der Erkrankung bei intraokularen Erkrankungen unterstützen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur EAU-Induktion in der C57BL/6J-Maus zur Verfügung - dem am weitesten verbreiteten Modellorganismus mit Anfälligkeit für diese Krankheit. Die klinische Beurteilung des Schweregrads und des Fortschreitens der Erkrankung wird mittels Fundoskopie, histologischer Untersuchung und Fluoreszenzangiographie nachgewiesen. Das Induktionsverfahren beinhaltet die subkutane Injektion einer Emulsion, die ein Peptid (IRBP_1-20) aus dem okulären Protein Interphotorezeptor-Retinoid-bindendes Protein (auch bekannt als Retinol-bindendes Protein 3), Complete Freund's Adjuvans (CFA) enthält und mit abgetötetem Mycobacterium tuberculosis ergänzt wird. Auf die Injektion dieser viskosen Emulsion in den Nacken folgt eine einmalige intraperitoneale Injektion von Bordetella pertussis-Toxin . Zu Beginn der Symptome (Tag 12-14) und unter Vollnarkose werden fundoskopische Bilder gemacht, um das Fortschreiten der Krankheit durch klinische Untersuchung zu beurteilen. Diese Daten können direkt mit denen zu späteren Zeitpunkten und dem Höhepunkt der Erkrankung (Tag 20-22) verglichen werden, wobei Unterschiede analysiert werden. Gleichzeitig ermöglicht dieses Protokoll dem Forscher, mögliche Unterschiede in der Gefäßpermeabilität und -schädigung mittels Fluoreszenzangiographie zu beurteilen. EAU kann in anderen Mausstämmen - sowohl Wildtyp- als auch in gentechnisch veränderten - induziert und mit neuartigen Therapien kombiniert werden, die Flexibilität für die Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten und/oder Krankheitsmechanismen bieten.

Einleitung

Dieses Protokoll wird zeigen, wie die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bei der C57BL/6J-Maus durch eine einzige subkutane Injektion eines retinalen Antigens in ein emulgiertes Adjuvans induziert werden kann. Methoden zur Überwachung und Beurteilung des Krankheitsverlaufs werden durch fundoskopische Bildgebung und histologische Untersuchung detailliert beschrieben, wobei die Messparameter darin beschrieben sind. Darüber hinaus wird die Fluoreszenzangiographie, eine Technik zur Untersuchung der Struktur und Permeabilität der retinalen Blutgefäße, diskutiert.

Dieses EAU-Modell rekapituliert zentrale Merkmale der nicht-infektiösen posterioren Uveitis beim Menschen in Bezug auf die klinisch-pathologischen Merkmale und die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen, die die Krankheit antreiben. EAU wird durch Th1- und/oder Th17-Untergruppen von selbstreaktiven CD4⁺T-Lymphozyten vermittelt, wie in adoptiven Transferexperimenten und bei IFNγ-depletierten Mäusen^{gezeigt wurde 1}. Ein Großteil unseres Verständnisses der möglichen Rolle dieser Zellen bei Uveitis stammt aus der Untersuchung von EAU², bei der sowohl Th1- als auch Th17-Zellen in den Netzhautgeweben nachgewiesen werden³. Häufig wird EAU als präklinisches Modell verwendet, um den Nutzen neuartiger Therapien bei der Abschwächung von Krankheiten zu bewerten. Therapeutische Ansätze, die die EAU-Krankheit erfolgreich moduliert haben, haben in der Klinik eine gewisse Wirksamkeit gezeigt und den von der FDA zugelassenen Status erreicht. Beispiele hierfür sind Gruppen von immunregulatorischen Medikamenten wie die T-Zell-Targeting-Therapien: Ciclosporin, FK-506 und Rapamycin ^4,5,6. In jüngster Zeit wurden in diesem Modell auch Interventionen untersucht, die auf neuartige Signalwege abzielen, um sowohl den Mechanismus als auch die Wirkung auf den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Dazu gehört die gezielte Transkriptionsregulation durch Chromatin-Reader, Bromodomain Extra-Terminal (BET)-Proteine und P-TEFb-Inhibitoren³. Darüber hinaus haben konventionellere Ansätze wie ein VLA-4-Inhibitor kürzlich eine Unterdrückung der EAU durch Modulation von Effektor-CD4⁺ T-Zellen gezeigt⁷. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das Targeting von Th17-Zellen mit TMP778, einem inversen RORγt-Agonisten, auch EAU⁸ signifikant unterdrückt. Darüber hinaus bietet dieses Modell die Möglichkeit, chronische Autoimmunentzündungen in der Netzhaut und die damit verbundenen zugrunde liegenden Mechanismen wie das Lymphozyten-Priming zu untersuchen.

Die primären Messwerte für präklinische EAU-Studien sind die klinische Beurteilung durch die Durchführung einer retinalen Fundoskopie und seltener durch die Beurteilung der Netzhautintegrität durch optische Kohärenztomographie (OCT). Die histopathologische Beurteilung der Netzhaut und die Immunphänotypisierung der Netzhautzellen durch Durchflusszytometrie erfolgen dann am Ende der Sitzung. Die Fundoskopie ist ein einfach zu bedienendes Live-Bildgebungssystem, das eine schnelle und reproduzierbare klinische Beurteilung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Für immunhistochemische Untersuchungen basieren die Techniken auf der Präparation von Netzhautschnitten, die es uns ermöglichen, die Gewebearchitektur auf den Grad der Entzündung und der strukturellen Schädigung zu untersuchen⁹. Die Bewertungskriterien und die herkömmlichen Bewertungssysteme für alle verwendeten Techniken werden in diesem Protokoll beschrieben. Das Ausmaß der Schädigung, die mittels fundoskopischer Bildgebung erfasst wird, korreliert oft eng mit histologischen Veränderungen. Dieser duale Ansatz zur Überwachung und Bewertung des Schweregrads der Erkrankung bietet eine höhere Sensitivität und zuverlässigere Messergebnisse.

EAU ist ein etabliertes, häufig verwendetes Modell für die präklinische Prüfung und Untersuchung von immunvermittelten Augenerkrankungen. Dieses Modell ist zuverlässig und reproduzierbar mit einer Inzidenz von >95% und generiert umfassende Daten, die verwendet werden können, um neue Therapien zur Behandlung von intraokularen entzündlichen Erkrankungen, die weltweit eine der Hauptursachen für Blindheit im erwerbsfähigen Alter darstellen, zu validieren oder abzulehnen¹⁰.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 und den Richtlinien des Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) durchgeführt.

1. Gehäuse C57BL/6J Mäuse

1. Hausmäuse in einer spezifischen, erregerfreien Umgebung, in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Nahrung und Wasser ad libitum verfügbar.
2. Führen Sie alle Experimente an erwachsenen weiblichen C57BL/6J durch (Frauen werden bevorzugt ausgewählt, da die Inzidenz von Frauen zu Männern bei Uveitis-Patienten 1,4 zu 1 beträgt). Randomisieren Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 6-8 Wochen nach Gewicht und Alter. Halten Sie die Mäuse in einzeln belüfteten Käfigen (IVC) in Gruppen von 5-6 Mäusen pro Käfig.

2. Immunisierung von C57BL/6-Mäusen

1. IRBP_1-20 - CFA-Emulsionsvorbereitung
   ANMERKUNG: Die Emulsionsherstellung ist für die Reproduzierbarkeit und Häufigkeit von Krankheiten unerlässlich. Daher müssen alle Anstrengungen unternommen werden, um die Konsistenz während des gesamten Vorbereitungsprozesses und zwischen den Experimenten zu wahren. Bei der Herstellung der Emulsion sollte der Verlust in den Berechnungen aller Reagenzien im Voraus berücksichtigt werden. Dieser Verlust kann etwa das 1,5-fache (oder 50% des vorbereiteten Volumens) betragen, basierend auf der Anzahl der Mäuse, die für die Immunisierung vorgesehen sind. Bitte sehen Sie sich das folgende Beispiel unten an. Um 10 Mäuse zu immunisieren, bereiten Sie 15 Mäuse vor und verwenden Sie 400 μg (Peptid pro 20 g Maus) x 15 Mäuse = 6 mg. Jede Maus sollte 200 μl zur Immunisierung erhalten (3 ml insgesamt). Das endgültige Volumen umfasst ein Verhältnis von 1:1 von Peptidlösung und CFA, also 1,5 ml Peptidlösung und 1,5 ml CFA.
   1. Bereiten Sie alle sterilen Lösungen in einer Laminar-Flow-Werkbank unter aseptischen Bedingungen vor.
   2. Die gewünschte Menge (400 μg pro 20 g Maus) des lyophilisierten Peptids IRBP_1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) wird abgewogen. Peptid in 100% DMSO auflösen. Lagerware in lyophilisierter Form bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig aufgelöst ist, muss jede Flocke zuerst mit dem DMSO in Kontakt kommen und keine Anzeichen von Restfeststoffen aufweisen. Fügen Sie PBS in kleinen Portionen hinzu, um das endgültige Volumen zu erreichen. Mischen Sie nicht mit einem Wirbel, sondern verwenden Sie sanftes Rühren mit einer Pipette. Die Endkonzentration von DMSO sollte 1% des Gesamtvolumens der Peptidzubereitung nicht überschreiten. Die Herstellung der Emulsion in einem 20-ml-Kunststoffröhrchen mit einem konischen Boden sollte eine bessere Zugänglichkeit von DMSO zum lyophilisierten Pulver ermöglichen.
   3. Fügen Sie DMSO-PBS-Peptidlösung im Verhältnis 1:1 v/v zu CFA hinzu, die bereits mit 1,5 mg/ml abgetötetem Mycobacterium tuberculosis ergänzt wurde, um eine Endkonzentration von 2,5 mg/ml zu erhalten. Tropfenweise zugeben und sanft und häufig pipettieren, um eine viskose und gleichmäßig verteilte Emulsion zu bilden.
   4. Belüften Sie die Peptidlösung und CFA mit einer 1000-μl-Pipette (auf 700 μl eingestellt, um weiteren Verlust zu verhindern) und einer Pipette, um eine cremige, dicke Konsistenz zu erzeugen. Bei dieser Technik wird die Pipette wiederholt auf und ab abgesaugt, bis die gewünschte Dicke erreicht ist. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass die Antigenlösung und das Adjuvans vor der Injektion gründlich gemischt werden.
2. Intraperitoneale Injektion von Pertussis-Toxin
   1. Suspendieren Sie 1,5 μg Bordetella pertussis-Toxin in 100 μl RPMI 1640-Medien, ergänzt mit 1% Mausserum¹¹.
   2. Führen Sie die i.p. Injektion mit einer sterilen Spritze und einer 23G-Nadel durch.
      HINWEIS: Um Störungen an der Injektionsstelle zu vermeiden, muss das Pertussis-Toxin vor der Injektion des Antigens verabreicht werden.
   3. Jede Maus wird vorübergehend in einen separaten Käfig gebracht, um eine einzelne 100-μl-Injektion von Bordetella pertussis-Toxin zu erhalten.
3. Subkutane Injektion von IRBP-Emulsion
   1. Als nächstes injizieren Sie die IRBP-Emulsion subkutan. Dieser Prozess erfordert zwei Tierpfleger, die entsprechend gekleidet sind und gemäß den Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften geschützt sind.
   2. Lassen Sie eine geübte Person die Maus leicht auf dem Käfig in einer schmutzigen Position festhalten, wobei der Bauch nach unten zeigt, während die andere geschulte Person die Haut einklemmt, um eine zeltartige Struktur im Nacken zu bilden, wo die Nadel eingeführt werden kann, um zwischen Finger und Daumen zu schlitzen.
      VORSICHT: Es besteht die Gefahr von Nadelstichverletzungen.
   3. Sobald die Nadel positioniert ist, injizieren Sie 200 μL der IRBP-Emulsion. Wenn Sie die Nadel entfernen, drehen Sie den Nadelkopf, um die Haut vor dem Herausziehen zu schließen, und üben Sie anschließend Druck auf die Injektionsstelle aus, um einen Rückfluss der Emulsion zu verhindern.
      VORSICHT: Die Emulsion darf nicht mit der Haut oder dem Fell der Maus in Berührung kommen, da dies zu Reizungen und in schwereren Fällen zu einer Läsion führen kann. In diesem Fall muss der Bereich sofort und gründlich mit 70% igem Ethanol abgewischt und anschließend getrocknet werden.
      HINWEIS: Wenn die drainierenden Lymphknoten am Ende der Studie zur Untersuchung benötigt werden, ist die Injektionsstelle anders. In diesem Fall injizieren Sie 100 μL subkutan auf beide Seiten der Flanke. Dies führt zu einer stärkeren Reaktion an den entwässernden Leistenlymphknoten, die zum Zeitpunkt der Ernte herausgeschnitten werden können. Wenn das beabsichtigte Ergebnis jedoch ausschließlich darin besteht, eine EAU zu entwickeln, ist eine einzige Injektion von 200 μl in den Nacken vorzuziehen, um Beschwerden durch mehrere Injektionsstellen zu vermeiden.

3. Klinische Bewertung - Augenhintergrunduntersuchung

HINWEIS: Die klinische Erkrankung wird mittels Fundusuntersuchung, Hellfeld-Live-Bildgebung mit einem Fundoskop und der Discover-Software zur Visualisierung bewertet.

1. Bei Ausbruch der Erkrankung (Tag 12-14) sedieren Mäuse unter Vollnarkose mit einer Kombination aus Ketamin (50 mg/ml) und Domitor (Medetomidin; 1 mg/ml). Verdünnen Sie 1-teiliges Domitor; 1,5 Teile Ketamin und 2,5 Teile steriles injizierbares Wasser, dann 100 μL pro 30 g intraperitoneal injizieren. Verwenden Sie 1 ml sterile Spritzen und 23G-Nadeln für die oben genannte Anästhesiekombination.
2. Überwachen Sie anschließend die Maus, um sicherzustellen, dass alle Reflexe verloren gehen und sie nicht auf Reize reagiert.
3. Unmittelbar nach Erhalt der IP-Injektion und während die Maus noch in einem Schrubb gehalten wird, tragen Sie 1% Tropicamid und 2,5% Phenylephrin topisch auf jedes Auge auf, um die Pupille zu erweitern. Ziel ist es, die Hornhaut mit beiden erweiternden Lösungen vollständig zu bedecken. Es kann einige Minuten dauern, bis die Pupille vollständig erweitert ist.
4. Danach großzügig auf die Viscotears-Salbe des Auges auftragen und während des gesamten Bildgebungsprozesses beibehalten, um das Auge vollständig geschmiert und hydratisiert zu halten.
5. Öffnen Sie in der Zwischenzeit die Software (z. B. Discover) und stellen Sie das Fundoskop (z. B. Micron) so ein, dass Bilder unter Hellfeld aufgenommen werden. Weisen Sie jeder einzelnen Maus einen Ordner zu und beschriften Sie die Bilder mit R oder L entsprechend jedem fotografierten Auge.
6. Befestigen Sie die Maus auf einem speziell angefertigten Tisch für die Live-Visualisierung und positionieren Sie das Mikroskop so, dass Sie vollen Zugriff auf die Netzhaut haben.
7. Um eine genaue Darstellung der Krankheit zu erhalten, machen Sie Bilder des gesamten Netzhautbereichs, die neben der Sehscheibe auch alle Ecken der Peripherie abdecken. Um dies zu erreichen, stellen Sie das Okular durchgehend ein. Es ist wichtig, dass das Auge während des gesamten Bildgebungsprozesses jederzeit vollständig geschmiert bleibt. Stellen Sie dies sicher, indem Sie die Augensalbe mit einer konstanten Rate auffüllen.
8. Zur Durchführung einer Fluoreszenzangiographie ist in diesem Stadium Abschnitt 4 (unten) zu lesen.
9. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, verdünnen Sie die Anti-Sedierungs-Anti-Sedierung (5 mg/ml Antisedan) in injizierbarem Wasser und verabreichen Sie sie in einer Dosis von 0,1 mg/kg i.p. Bringen Sie die Maus in einen Käfig zurück und legen Sie sie auf eine vorgewärmte Matte mit Zugang zu einem nassgetränkten Futter, bis sie sich erholt hat. Die vollständige Genesung ist gekennzeichnet durch Ganzkörperbewegungen und das Gehen um den Käfig mit gleichmäßigem Gang, der in der Regel einige Stunden dauert.
10. Wiederholen Sie am festgelegten experimentellen Endpunkt (z. B. Tag 21-23) die Schritte 4.1-4.5 und fotografieren Sie erneut den gesamten Netzhautbereich, der die Sehscheibe und alle Ecken der Peripherie abdeckt, um eine genaue Darstellung der Krankheit zu erfassen.

4. Fluoreszenzangiographie

1. Um die Gefäßleckage bei diesen Tieren zu messen, geben Sie jeder Maus während der Narkose eine Injektion von 2% Fluorescein subkutan in den Nacken und positionieren Sie sie so, dass die Netzhaut in der Mitte des Livebildes zentriert ist.
2. Stellen Sie das Fundoskop auf einen Blaulichtanregungsfilter bei 465-490 nm ein. Das von angeregtem Fluorescein eingefangene Licht liegt zwischen 520-530 nm.
3. Machen Sie nach 1,5 Minuten nach der Fluoreszenzinjektion ein Foto von jeder Netzhaut und wiederholen Sie den Vorgang nach 7 Minuten.
   HINWEIS: Das Timing ist für diese Ereignisse entscheidend, wenn nicht beide Ereignisse erfasst werden können, dann bilde nur ein Auge.

5. Klinisches Krankheits-Scoring

1. Stützen Sie die klinische Beurteilung auf den Schweregrad der folgenden Kriterien: Bandscheibenentzündung, retinale Gefäßmanschette, Netzhautgewebeinfiltrat und strukturelle Schäden.
2. Vergeben Sie für jeden dieser Parameter eine Punktzahl auf einer Skala von 0 bis 5, und die Gesamtsumme ist repräsentativ für die klinische Erkrankung für das gesamte Auge, wobei eine maximale Punktzahl von 20 pro Auge erreicht werden kann. Tabelle 1 kann als Leitfaden für die Bewertungskriterien verwendet werden.

6. Histologie und histologisches Scoring

1. Nach der Einschläferung der Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation enukleieren Sie die Augen, indem Sie die Augenlider auseinander ziehen, um einen einfachen Zugang zum gesamten Auge zu ermöglichen.
2. Als nächstes platzieren Sie eine gekrümmte Pinzette hinter der Kugel mit der Absicht, das orbitale Bindegewebe und den Sehnerv zu greifen. Achten Sie darauf, dass Sie den Globus nicht zusammendrücken.
3. Zur Fixierung legen Sie das Auge für mindestens 15 Minuten in 4% Glutaraldehyd, um die Netzhautablösung zu minimieren, und übertragen Sie es dann für mindestens 24 Stunden auf 10% Formaldehyd. 1-2 ml Fixiermittel würden genug Volumen geben, um zwei Augen zu bedecken.
4. Führen Sie die Einbettung in Paraffin, das Schneiden auf einem Mikrotom und die Färbung gemäß den Standardprotokollen durch. Für jede Art von Färbung wird eine Querschnittsdicke von 3-4 μm empfohlen.
5. Führen Sie eine histologische Untersuchung der Augen unter Verwendung von Standardprotokollen für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) durch.
6. Vergeben Sie Scores auf einer Skala von 0-4 gemäß den Kriterien für das EAU-Scoring, basierend auf dem Ausmaß der Immunzellinfiltration in der Netzhaut und Aderhaut, der Störung der Netzhautschichten, dem Grad der Granulombildung und dem Ausmaß der Netzhautablösung, was auf eine Netzhautschädigung hinweist, wie zuvor beschrieben (Agarwal 2013) und in Tabelle 2¹¹ zusammengefasst.

Ergebnisse

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Induktion eines Modells der experimentellen autoimmunen Uveitis (EAU) durch Immunisierung von Mäusen mit einem uveitogenen retinalen Peptid, das von IRBP abgeleitet ist. Die Beurteilung von Krankheiten unter Verwendung weit verbreiteter und leicht zugänglicher Ansätze wird abgedeckt, obwohl diese nicht exklusiv sind und durch andere bildgebende Verfahren ergänzt oder teilweise ersetzt werden können. Die ersten Anzeichen von EAU bei C57BL/6J-Mäusen k...

Diskussion

Experimentelle Tiermodelle sind notwendige Werkzeuge für die Untersuchung der Krankheitspathogenese und die präklinische Erprobung neuer therapeutischer Paradigmen. Im aktuellen Protokoll haben wir eine Methodik zur Induktion, Überwachung und Bewertung der EAU, eines experimentellen Modells der intraokularen inflammatorischen Uveitis, diskutiert. Dieses EAU-Modell hat eine Inzidenz von mehr als 95%, wenn alle Verfahren gemäß dem hier beschriebenen Protokoll durchgeführt werden, und führt zur Entwicklung einer chronischen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
antisedan	ZOETIS, USA		zum Aufwecken
von Complete Freund' s Adjuvans; CFA	Sigma, UK	F5881	für die Immunisierung
Domitor	Orion Pharma, Finnland		für die Anästhesie
Flourescein	Sigma, UK	F2456	für die Angiographie
IRBP1-20	Chamberidge Peptid, UK		Peptid; Antigen
Ketamin	Orion Pharma, Finnland		für die Anästhesie
Micron III	Phoenix Research, USA		für die Fundoskopie
Mausserum	Sigma, UK	M5905	für die Immunisierung
Mycobacterium terberculosis	Sigma, UK	344289	zur Immunisierung
Pertussis Toxin	Sigma, UK	P2980	zur Immunisierung
Phenylephrinhydrochlorid 2,5%	Bausch & Lomb Großbritannien	PHEN25	zur Dilatation
Tropicamid 1%	SANDOZ		zur Dilatation
Viscotears	WELDRICKS Pharmacy, UK	2082642	zur Augenschmierung