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Biochemistry

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

Abstract

Estudos estruturais com complexo de sindtofano (TS) complexo de bienzyme (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium foram realizados para entender melhor seu mecanismo catalítico, comportamento alolítico e detalhes da transformação enzimática do substrato ao produto em enzimas dependentes de PLP. Neste trabalho, um novo sistema de expressão para produzir o isolado α e isolado β-subunidade permitiu a purificação de altas quantidades de subunidades puras e αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas dentro de 2 dias. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade seguida de decote da tag de afinidade, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para melhor compreender o papel dos resíduos-chave na enzima β-local, a mutagênese direta do local foi realizada em estudos estruturais anteriores. Outro protocolo foi criado para purificar o tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS. Um protocolo simples, rápido e eficiente usando fracionamento de sulfato de amônio e SEC permitiu a purificação de αcomplexo de 2β2StTS em um único dia. Ambos os protocolos de purificação descritos neste trabalho têm vantagens consideráveis quando comparados com protocolos anteriores para purificar o mesmo complexo usando PEG 8000 e espermaina para cristalizar o complexo α2β2StTS ao longo do protocolo de purificação. Cristalização do tipo selvagem e algumas formas mutantes ocorre em condições ligeiramente diferentes, prejudicando a purificação de alguns mutantes usando PEG 8000 e espermaina. Para preparar cristais adequados para estudos cristalográficos de raios-X foram feitos diversos esforços para otimizar a cristalização, a qualidade do cristal e a crioproteção. Os métodos aqui apresentados devem ser geralmente aplicáveis para a purificação de subunidades de synthase triptofano e tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS.

Introduction

O complexo de xodó-sintéria triptofano (TS) (α2β2) é uma enzima alusicana, catalisando os dois últimos passos na biossíntese do aminoácido L-Triptofano em bactérias, plantas e fungos1,2,3. A bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa uma grave infecção gastrointestinal em humanos e outros animais. Uma vez que os seres humanos e animais superiores não possuem TS (EC 4.2.1.20), a inibição de S. typhimurium αcomplexo 2β2 TS (α2β2StTS) tem sido explorado como um potencial alvo de drogas para o tratamento de criptosporidiose e tuberculose4, infecções genitais e oculares5, e para potencial utilização de herbicidas na agricultura6. O α-subunidade catalisa o decote aldolítico de indole-3-glicerol-fosfato (IGP) ao glicealdeído-3-fosfato (GAP) e indol, através da formação de um teima de ligação indolenina tautomer e, posteriormente, de ligação carbono-carbono para produzir GAP e indole3,6. O sítio β-catallítico contém uma molécula de cofato piridoxal de 5′-fosfato (PLP) ligada a β-Lys87 através de uma base de Schiff, que funciona como um dissipador de elétrons no curso das reações na enzima β-subunidade3,7. O β-local catalisa a substituição do hidroxyl de cadeia lateral L-Serine por indol para dar L-Triptofano e uma molécula de água em uma reação dependente de PLP. St. A TS serve como um modelo de longa data para a investigação de canalização de substratos e comunicação alotérica dentro de complexos multienzimáticos2,3. A comunicação alotérica bidirecional entre as subunidades α e β de TS é necessária para sincronizar as etapas catalíticas e evitar a liberação de indol durante a síntese L-Triptophan3. Para estender esse esforço, preparamos vários mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) por mutação de ponto único para ser usado em novas explorações da relação entre estrutura enzimática, mecanismo e função no local catalítico da subunidade stTS β.

Uma pesquisa detalhada sobre o mecanismo catalítico de α2β2StTS foi iniciada pelo grupo de pesquisa de Edith W. Miles. Estudos iniciais com o complexo escherichia coli nativo α2β2 TS têm focado na purificação e caracterização da subunidade isolada α8,9, isolada β-subunidade10,11 e a reconstituição do complexo α2β2 TS das subunidades isoladas12. A purificação foi realizada por precipitação de sulfato de amônio, diálise amostral, cromatografia DEAE-Sephadex, diálise e uma segunda rodada cromatográfica na coluna DEAE-Sephadex12. Em outro protocolo, a purificação do mesmo complexo foi melhorada carregando o lysato celular esclarecido em uma coluna DEAE-Sephadex seguida de um passo cromatográfico em uma coluna Sepharose 4B, precipitação de sulfato de amônio e diálise13. Ambos os protocolos de purificação duram de 4 a 5 dias. Escherichia coli α2β complexo2 TS cristalizado, mas os cristais não eram adequados para difração de raios-X na época.

Em um novo estudo, formas recombinantes e selvagens de S. typhimurium αcomplexo de 2β2 TS foram purificadas e cristalizadas14,15. O complexo de α2β2StTS foi superexpresso na cepa E. coli CB149 carregando o vetor de expressão pEBA-10. Foram relatados14a coleta e análise inicial de dados de cristalização e difração de raios-X do complexo de α2β2StTS . No entanto, agulhas longas e finas como α2β2Cristaisde St.TS prejudicaram estudos estruturais. Na tentativa de coletar melhores dados de difração de raios-X, outro protocolo de purificação foi descrito para purificar o tipo selvagem e as formas mutantes do α2β2Complexo StTS15. A purificação foi realizada com uma precipitação inicial usando esperteza e PEG 8.000 no lysato celular esclarecido e um grande precipitado volumoso foi removido por centrifugação. A fração supernante contendo altas quantidades de α2β complexoStTSfoiarmazenada por 16-48 h a 4 °C até que os cristais amarelos precipitados. Cristais foram lavados e extensivamente dialisados contra diferentes tampões. O complexo proteico foi recriminado em tampão contendo sulfato de amônio e dialisado15. Embora, a cristalização proteica dependa de concentrações de proteínas e precipitantes em solução, é difícil monitorar, prever e reproduzir a purificação para outras formas mutantes de α2β complexode StTS2em solução. Este protocolo tem a vantagem de não utilizar nenhum método cromatográfico; no entanto, as desvantagens são o longo tempo de purificação necessário para cristalizar, dialisar e recristallizar, normalmente exigindo de 5 a 7 dias. Para obter cristais adequados para coleta de dados de raios-X, mais de 600 condições de cristalização foram avaliadas utilizando-se uma combinação e variação de concentração proteica, temperatura, precipitantes (PEG 4.000, 6.000 e 8.000), e aditivos (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadáver, putrescina, espermióides ou espermióides)15. Os cristais tinham uma melhor forma cristalina e cresceram mais rápido em condições que continham 12% de PEG 8.000 e 2 mM de espermatozoides. A cristalização foi mais favorável a 25 °C em vez de 4, 30 ou 42 °C e cresceu para dimensões máximas em 3 dias15. Vários α2β2estruturas de cristalstSforam relatadas na época (1996-1999)16,17,18,19,20,21 e muitas outras estruturas foram publicadas até o momento.

Aqui, o objetivo principal é apresentar protocolos alternativos para purificar a sinthase triptofano e otimizar a cristalização proteica. O presente trabalho apresenta melhorias significativas para purificar o tipo selvagem isolado α-subunidade (αStTS), unidade isolada β-subunidade (βStTS), reconstituída αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas, e tipo selvagem e formas mutantes do complexo α2β2St.TS. As vantagens em relação aos protocolos passados são consideráveis, uma vez que o tempo de purificação foi reduzido significativamente e a cristalização e a crioproteção foram otimizadas. Formas mutantes de α2β complexostS2projetado neste trabalho cristalizaram perto da mesma condição usada para a forma tipo selvagem. No entanto, a otimização da cristalização fina foi necessária para obter grandes cristais únicos de qualidade suficiente para a determinação da estrutura em resolução quase atômica. Até o momento, existem 134 estruturas de cristal de sinthase triptofano depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB), contabilizando 101, 31 e 2 estruturas de cristais, respectivamente, para bactérias, arqueias e eucariotes. Bem, 73 estruturas pertencem ao s. enterica serovar typhimurium e 5 estruturas cristalinas do complexo α2β2StTS têm limites de resolução superiores a 1,50 Angstroms. Não surpreende que 4 em 5 foram preparados em nosso grupo de pesquisa (PDB IDs:5CGQ em 1,18 Å, 4HT3 às 1,30 Å, 4HPJ em 1.45 Å, 6DZ4 em resolução 1.45 Å). As estruturas cristalinas refinadas da forma mutante de α2βcomplexode StTS são esperadas para fornecer novas percepções sobre o mecanismo e os papéis desempenhados por resíduos essenciais de aminoácidos envolvidos na síntese L-Triptofano.

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Protocol

1. Protocolo rápido para purificar a subunidade α e β e o complexo de α2β2StSrecombinado

  1. Subcloning de DNA no vetor de expressão pETSUMO
    1. Obtenha o gene de acoplamento traduções (trpA e trpB) codificando as α- e βsubunidades do sintetizador triptofano da bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium clonado no vetor de expressão pEBA-1022. Use o vetor pEBA-10 como modelo de DNA.
      NOTA: Alternativamente, os primers listados abaixo podem ser usados para amplificar ambos os genes do genoma de salmonella enterica serovar typhimurium. Todas as etapas de biologia molecular foram seguidas conforme descrito na Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório23.
    2. Use a reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar individualmente a sequência de polinucleotídeos de comprimento completo da subunidade α(αStTS) com primers αStTS-FW-Bam e αTS-Rev-Eco e a sequência completa de βsubunidade (βStTS) com primers βStTS-FW-Bam e βStTS-Rev-Hind. Use uma temperatura de fusão de aproximadamente 55 °C e um tempo de extensão de polimerase de 2 min.
      1. Use polimerase de DNA de alta fidelidade (por exemplo, Phusion) e o protocolo do fabricante para amplificar as sequências de DNA. Para uma reação PCR de 50 μL adicione 34 μL de água sem nuclease, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de primer dianteiro de 10 μM, 1 μL de 10 μM de primer reverso, 1 μL de DNA modelo (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de polimerase de DNA phusion.
      2. Para o programa PCR, use uma partida quente (180 segundos a 98 °C) seguida de 30 ciclos de amplificação (30 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C e 120 segundos a 72 °C) e uma extensão final (300 segundos a 72 °C).
        NOTA: As sequências itálicas correspondem aos locais de restrição BamHI, EcoRI, BamHI e HindIII, respectivamente. A eficiência do decote enzimante perto do termini dos fragmentos de PCR foi reforçada adicionando bases extras (sequências minúsculas).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Carregar o produto PCR em gel de 0,8% de agarose em 1x tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA) a 6 V/cm, extrair gel a faixa de DNA de interesse, e gel purificar o fragmento PCR usando um kit de contas de sílica seguindo as instruções do fabricante.
      1. Digerir pelo menos 200 ng de cada fragmento de DNA com enzimas e condições de restrição adequadas recomendadas pelo fabricante durante 2 horas a 37 °C.
      2. Para configurar uma reação de digestão de restrição de 50 μL adicione 34 μL de água sem nuclease, 10 μL de DNA (200 ng), 5 μL de tampão de reação de 10x, 0,5 μL de enzima de restrição 1 e 0,5 μL de enzima de restrição 2.
      3. Carregue o produto de digestão em gel de 0,8% de agarose em 1x TAE a 6 V/cm, extrato de gel e gel purificar o fragmento digerido usando um kit comercial.
    4. Subclone individualmente cada fragmento na expressão E. coli modificado vetor pET SUMO, previamente digerido com enzimas apropriadas e gel purificado.
      NOTA: Este vetor é uma versão modificada do pET SUMO comercial. Este vetor foi otimizado para a restrição da clonagem de enzimas. O site multi clonagem (MCS) do vetor pET28b(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI e XhoI) foi inserido no local de clonagem pET SUMO. Este vetor contém uma tag N-terminal 6x-Histidine em quadro com a proteína modificadora semelhante a ubiquitina (SUMO) e vários locais de clonagem.
    5. Ligate 100 ng de pET SUMO modificado e 50 ng de fragmento PCR com liga ligase de DNA T4 por 2 horas a 25 °C.
    6. Transforme o plasmídeo construído em células competentes da cepa E. coli DH10Bα células. Células de placas em placas de ágar LB contendo 35 μg/mL kanamycin. Incubar a placa invertida durante a noite a 37 °C.
    7. Selecione uma única colônia de cada transformação, prepare DNA plasmídeo ultra-puro e realize o sequenciamento de DNA para verificar sequenciamento de αStTS ou βStTS foram clonados em quadro com a tag N-terminal His6-SUMO.
      NOTA: Prepare os estoques de glicerol da cultura celular (vire suspensão celular em 16% de concentração final de glicerol estéril) e armazene-os a longo prazo a -80 °C.
    8. Transforme a expressão plasmid SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS individualmente em células competentes da tensão de expressão E. coli Rosetta (DE3) pLysS com um sistema baseado em promotores T7. Emplaque as células recombinantes em placas de ágar Luria Bertani (LB) contendo 35 μg/mL kanamycin e clororamfenicol. Incubar a placa invertida durante a noite a 37 °C.
    9. Após a formação bem sucedida da colônia, escolha uma única colônia (sem colônias de satélites) e disperse-a em 5 mL de meio LB com ambos os antibióticos. Células de cultura durante a noite com agitação a 200 rpm a 37 °C.
      NOTA: Prepare os estoques de glicerol da cultura celular, armazene a longo prazo a -80 °C ou use imediatamente para expressão de proteína recombinante.
  2. Expressão das subunidades SUMO-αStSe SUMO-βStTS
    1. Inoculada e. coli cepa Rosetta (DE3) pLysS células que abrigam SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS constrói ou raspa parte do estoque de glicerol congelado em uma cultura de 50 mL de LB contendo 35 μg/mL kanamycin e chloramphenicol. Cresça células durante a noite com tremor a 200 rpm a 37 °C.
    2. Na manhã seguinte, inocular 5 mL da cultura celular durante a noite em um frasco fresco e estéril de 2x 1000 mL de LB contendo 2% de glicerol mais kanamicina e clororamfenicol (frasco de 2,8 L Fernbach). Cresça a cultura celular com agitação a 200 rpm a 37 °C.
      NOTA: A expressão de SUMÔ-αStTS ou SUMO-βStTS no caldo LB rende 125-150 mg de proteína marcada por litro. Considere o protocolo de escala para cima ou para baixo para atender a demandas específicas.
    3. Induzir expressão de proteína recombinante quando o OD600 atingir 0,6-0,8 por adição de isopropílico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) em uma concentração final de 0,4 mM seguido de incubação a 30 °C durante a noite com tremor a 200 rpm.
    4. Colher as células por centrifugação a 4.000 x g a 4 °C por 20 min. Remova o supernascer e suspenda as pelotas celulares com tampão de lise fria 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, contendo 500 mM NaCl, 5% de glicerol, 10 mM 2-mercaptoethanol e 40 mM imidazol-cl) a um volume final de 60 mL.
      NOTA: As células podem ser armazenadas a longo prazo a -80 °C ou usadas imediatamente para purificação de proteínas. Para armazenar células, divida a suspensão celular em tubos cônicos descartáveis de 2 x 50 mL e mantenha as pelotas de célula a -80 °C até a etapa de purificação da proteína.
  3. Purificação do α- e β subunidades de sinthase triptofano
    NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados a 4 °C, salvo previsão em contrário. Para reduzir o tempo de purificação, equilibre as colunas de afinidade carregadas de níquel Ni-NTA e a coluna de exclusão de tamanho no buffer antes da purificação da proteína ou durante a expressão da proteína recombinante.
    1. Interrompa a pelota celular por sônica usando um sonificador digital com sonda horn de 1/2" (ou um equipamento semelhante). Realize 20 ciclos a 80% de amplitude no banho de água gelada usando pulso de 10 s e repouso de 20 s ou até a interrupção completa da célula.
    2. Centrifugar a célula lysate a 30.000 x g por 30 min. Aspirar supernante, garantindo que a pelota não se desaloja do tubo. Filtre o supernasciente com uma unidade de filtro de 0,45 μm no gelo e flua através de uma coluna de afinidade de níquel de 15 mL Ni-NTA pré-equilibrada no tampão de lise 1.
      NOTA: Cada coluna ni-nta agarose será usada para purificar sumo-αStTS ou SUMO-β proteína recombinanteStTS. A purificação pode ser realizada em uma coluna Ni-Ni-NiTA de 2x 5 mL anexada a um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida. Purificar uma proteína de cada vez.
    3. Lave a coluna Ni-NTA em 100 mL de tampão de lise 1.
    4. Proceda com uma elução de 80 mL de um passo com buffer E1 (tampão Tris-Cl de 25 mM, pH 7.8, contendo 200 mM NaCl, 5% glicerol e 400 mM imidazol-cl).
      NOTA: O SUM-protease tolera até 300 mM imidazol e a membrana de dispositivos filtro centrífugas tolera até 100 mM imidazol. Recomendamos a realização de uma precipitação de sulfato de amônio para remover altas quantidades de imidazol e diminuir o tempo de purificação, em vez disso, diluir a amostra de proteína e perder tempo com concentração de proteínas.
    5. Avalie o volume inicial da fração sobrenante. Adicione lentamente pequenas quantidades de sulfato de amônio de cada vez, até que uma saturação de 60% (39,48 g/ 100 mL) a 25 °C seja atingida. Mexa suavemente a solução por 30 minutos e evite bolhas. Centrifugar a 10.000 x g por 15 min.
    6. Aspire e descarte cuidadosamente a fração supernascida. Resuspenda a fração de pelotas em 20 mL de tampão amostral (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl e 5% glicerol).
    7. Para seu decote de marca SUM-SUMO com SUM-protease, adicione o fragmento recombinante de protease específica do Ubl 1 de Saccharomyces cerevisiae em uma proporção de 1:1000 e incubar a mistura por 2 horas a 4 °C.
    8. Centrifugar o produto de digestão a 10.000 x g em 25 °C por 20 minutos para remover agregados proteicos antes de carregar a amostra através de uma coluna de cromatografia de afinidade.
    9. Remova os traços da tag His6-SUMO passando a amostra resuspensada de 20 mL em uma coluna de 15 mL Ni-NTA, previamente equilibrada no tampão de lise 1.
    10. Colete a amostra de passagem contendo o αStSou βStTS.
    11. Lave a coluna Ni-NTA em 20 mL de buffer 1 para coletar sobras de αStTS ou βStTS.
    12. Concentre cada subunidade separadamente com uma unidade de filtro centrífugo de corte de 15 mL 10 kDa girando a 3.000 x g a 4 °C. Transfira a proteína concentrada para um tubo fresco de 2,0 mL e microcentrifuuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) para remover agregados. Determine a concentração proteica24, prepare 1 mL aliquots a 20-25 mg mL-1, rótulo, flash-freeze em nitrogênio líquido, e armazene-os a -80 °C.
      NOTA: Amostras de proteínas pré-purificadas podem ser armazenadas a longo prazo a -80 °C ou usadas imediatamente para purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).
    13. Tome uma alíquota de proteína (20 mg) e microcentrifuuge a 10.000 x g por 10 min para remover agregados anteriores da SEC.
    14. Amostra de carga em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) anexada a uma cromatografia líquida de proteína rápida a uma taxa de fluxo de 0,5 mL min-1, previamente equilibrada no buffer SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerol, 0,1 mM fosfato piridoxal).
      NOTA: Para purificar quantidades mais altas de αisolado StTS ou β subunidadeStTS e diminuir o número de rodadas SEC, carregue uma amostra de 5 mL a 20-25 mg mL-1 em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho a uma taxa de fluxo de 1,5 mL min-1.
    15. Avalie a qualidade de αStTS ou βStTS na fração máxima usando uma eletroforese de sulfato-gel de sódio de 15% ou 15% de sódio (SDS-PAGE), respectivamente, manchada com a mancha azul brilhante Coomassie25.
    16. Concentrar proteína com unidades frescas de filtro centrífugo de corte de 15 mL 10 kDa, determinar concentração de proteína24, preparar alíquotas de 0,5 mL a 20-25 mg mL-1, rótulo, flash-freeze em nitrogênio líquido, e armazená-los a -80 °C.
  4. Purificação do complexo α2β2StTS das subunidades α e β
    NOTA: Equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (Sephadex S-200 HR ou Superdex 200 pg) em tampão SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% glicerol, 0,1 mM fosfato piridoxal).
    1. Para purificar o complexo de α2β2StTS do α e β subunidades, descongele amostras concentradas de αstTS e β subunidadesStTS a 4 °C.
    2. Combine alíquotas (1,2 αStTS: 1,0 β relação molarStTS) e incubada a 4 °C por 1h.
      NOTA: O excesso de αStTS é necessário para garantir que a maior parte de βStTS seja incorporada ao complexo α2β2StTS.
    3. Remova os agregados proteicos por microcentrifugação (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Carregue o sobrenante esclarecido na coluna de exclusão de tamanho.
    5. Avalie a qualidade de αStTS ou βStTS na fração máxima usando uma eletroforese de sulfato-gel de sódio de 15% ou 15% de sódio (SDS-PAGE), respectivamente, manchada com a mancha azul brilhante Coomassie25.
    6. Determine a concentração proteica24, prepare 250-1000 μL alíquotas a 15-20 mg mL-1, flash-freeze em nitrogênio líquido, e armazene a -80 °C.

2. Purificação do tipo selvagem ou forma mutante do complexo α2β2St.TS

  1. Mutagênese dirigida ao local para preparar mutante βSt.TS
    1. Use o vetor de expressão pEBA-1022 como modelo de DNA durante duas etapas da reação em cadeia de polimerase para introduzir mutações pontuais específicas na sequência de polinucleotídeos TS de cadeia β.
      NOTA: Este protocolo pode ser usado para introduzir uma mutação de ponto único em α ou β-subunidade de Salmonella typhimurium tryptophan synthase. Para adicional, novos primers de oligonucleotídeos contendo a mutação desejável devem ser adequadamente projetados. Neste trabalho, mutações βQ114A, βK167T, βS377A estão listadas.
    2. Execute reações pcr usando pares de primers nucleotídeos TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev e TS-FW-NcoI/S377A-Rev para gerar fragmentos A1, B1 e C1, respectivamente.
      NOTA: Oligonucleotídeo TS-NcoI-FW e TS-SacI-Rev, respectivamente, anneals rio acima e rio abaixo da sequência de polinucleotídeos αβ StTS clonadas no vetor pEBA-10.
      1. Use polimerase de DNA de alta fidelidade (por exemplo, Phusion) e o protocolo do fabricante para amplificar as sequências de DNA. Para uma reação pcr de 50 μL, adicione 34 μL de água sem nuclease, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de 10 μM primer para a frente, 1 μL de primer reverso de 10 μM, 1 μL de DNA de modelo (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de polímero de DNA.
      2. Para o programa PCR, use uma partida quente (180 segundos a 98 °C) seguida de 30 ciclos de amplificação (30 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C e 120 segundos a 72 °C) e uma extensão final (300 segundos a 72°C).
        NOTA: Todas as etapas de biologia molecular foram seguidas conforme descrito na Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório23. Enquanto uma sequência minúscula corresponde a um local de restrição, uma sequência ousada e itálica corresponde a uma mutação.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Execute reações pcr usando pares de primers nucleotídeos TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF e TS-Rev-SacI/S377A-FF para gerar fragmentos A2, B2 e C2, respectivamente.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCGG GGC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Use a reação em cadeia de polimerase para amplificar individualmente os fragmentos parciais. Use uma temperatura de fusão de 55 °C e um tempo de extensão de polimerase de 2 min.
    5. Para realizar a segunda rodada de reações pcr, carregue o produto PCR acima em gel de 0,8% de agarose em 1x TAE a 6 V/cm e extrato de gel e gel purificam os fragmentos de interesse.
      1. Misture fragmentos A1/A2, B1/B2 e C1/C2 separadamente em quantidades equimolares, aqueça a mistura por 10 min a 96 °C e a anneal a 25 °C. Estenda os fios recombinantes com polimerase de alta fidelidade e desoxiribonucleotídeos de acordo com o protocolo do fabricante.
    6. Para gerar um alto número de cópia do fragmento de DNA mutante de comprimento completo, adicione os primers Oligo TS-FW-NcoI e TS-Rev-SacI para executar um segundo PCR.
    7. Carregar o produto PCR em 0,8% agarose em 1x tampão TAE a 6 V/cm, extrair gel a faixa de DNA de interesse, gel purificar o fragmento PCR e proceder com a digestão de restrição adequada por 2 horas a 37 °C seguindo o buffer e as condições apropriadas recomendadas pelo fabricante.
      1. Digerir pelo menos 200 ng de cada fragmento de DNA com enzimas e condições de restrição adequadas recomendadas pelo fabricante durante 2 horas a 37 °C. Para configurar uma reação de digestão de restrição de 50 μL adicione 34 μL de água sem nuclease, 10 μL de DNA (200 ng), 5 μL de tampão de reação de 10x, 0,5 μL de enzima de restrição 1 e 0,5 μL de enzima de restrição 2. Carregar o produto de digestão em 0,8% agarose em 1x tampão TAE a 6 V/cm e purificar o fragmento pcr digerido.
    8. Digeste 200 ng de pEBA-10 construto com enzimas de restrição NcoI e SacI seguindo a recomendação do fabricante. Carregue o produto de digestão em gel de 0,8% de agarose em 1x tampão TAE a 6 V/cm, extirgue o correspondente da banda para o vetor e o gel purifica o vetor digerido.
    9. Ligate 100 ng de vetor com 50 ng de fragmento PCR, previamente digerido e purificado, com liga ligase de DNA T4 por 2 horas a 25 °C. Transforme o plasmídeo construído em células competentes E. coli strain DH10B cells. Células de placas em placas de ágar LB contendo 50 μg/mL ampicillin. Incubar a placa invertida durante a noite a 37 °C.
    10. Escolha uma única colônia (sem colônias de satélites) de cada transformação celular e disperse-a em 5 mL de meio LB contendo ampicilina. Cresça células durante a noite com tremor a 200 rpm a 37 °C. Prepare 10 μg de DNA plasmídeo ultra-puro de cada construção projetada. Prepare os estoques de glicerol da cultura celular (vire suspensão celular em 16% de concentração final de glicerol estéril) e armazene a longo prazo a -80 °C.
    11. Realize o sequenciamento de DNA para confirmar a sequência completa codificando as subunidades α e β de sintetizador triptofano. Confirme cada mutação individual e descarte qualquer construção plasmida contendo mutação aleatória indesejável. Os primers de oligonucleotídeos utilizados neste estudo estão listados abaixo.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
      NOTA: Os primers Oligonucleotídeos TS-1F, TS-1R, TS-2F e TS-3F anneal na sequência de polinucleotídeos da β-subunidade (código de adesão do GenBank: CP051286.1). Primers TS-4F e TS-5F anneal na sequência de polinucleotídeos da subunidade α (código de adesão do GenBank: CP053865.1).
    12. Use 200 ng de cada construção plasmóide (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T, e pEBA-10-βS377A) para transformar células competentes da cepa de expressão E. coli CB149, sem o operon trp 26. Após a formação bem sucedida da colônia, escolha uma única colônia e cresça as células em 5 mL de meio LB contendo 50 μg/mL ampicillin. Cultura na incubadora bacteriana a 37 °C durante a noite. Prepare os estoques de glicerol da cultura celular, armazene a longo prazo a -80 °C ou use imediatamente para expressão de proteína recombinante.
      NOTA: Uma única mutação de um único ponto em α ou β-subunidade de Salmonella typhimurium tryptophan synthase pode prejudicar a função enzimática ou menor síntese de L-Triptophan em E. coli tensão CB149. Por favor, considere usar a cepa E. coli BL21(DE)pLys-S ou Rosetta (DE3)pLys-S se nenhuma expressão ou quantidades inferiores de α2β2O complexoStSé detectado em um gel SDS-PAGE.
  2. Expressão de tipo selvagem e forma mutante de α2β2Complexo de StTS em E. coli
    1. Cresça a tensão de expressão E. coli abrigando a construção desejável em um fresco e estéril 50 mL de meio LB contendo 50 μg/mL ampicillin. Cresça células durante a noite com tremor a 200 rpm a 37 °C.
    2. Adicione 5 mL da cultura celular durante a noite em um frasco fresco e estéril de 2x 1000 mL de LB contendo 2% de glicerol mais ampicillina (frasco de 2,8 L Fernbach). Cresça a cultura celular com agitação a 200 rpm a 37 °C.
    3. Induzir expressão proteica recombinante quando o OD600 atinge 0,6-0,8 por adição de IPTG em uma concentração final de 0,4 mM seguido de incubação a 30 °C durante a noite com agitação a 200 rpm.
    4. Colher as células por centrifugação a 4.000 x g em 4 °C por 20 min. Remova o supernasciente e suspenda as pelotas celulares com tampão de lise fria 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contendo 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF) para um volume final de 50 mL tampão.
      NOTA: As células podem ser armazenadas a longo prazo a -80 °C ou usadas imediatamente para purificação de proteínas. Para armazenar células, divida a suspensão celular em tubos cônicos descartáveis de 2 x 50 mL e mantenha as pelotas de célula a -80 °C até a etapa de purificação da proteína. A expressão da forma mutante e selvagem de α2β complexostTSemcaldo LB produz 125-150 mg de proteína por litro. Considere escalar o protocolo para cima ou para baixo para atender a demandas específicas.
  3. Purificação de tipo selvagem ou forma mutante de α2β2Complexo de St.TS
    NOTA: O protocolo a seguir destina-se a purificar o tipo selvagem recombinante não marcado ou a forma mutante do recombinante α2β2StComplexo TS dentro de 1 dia, dependendo de conjunto de habilidades e esforços. Para reduzir o tempo de purificação, equilibre a coluna de exclusão de tamanho no buffer de purificação/expressão de proteínas anteriores. Purificação de tipo selvagem ou α mutante2β2StO complexo TS é realizado por uma purificação em duas etapas que compreende fracionamento de sulfato de amônio e uma cromatografia de exclusão de tamanho. Este protocolo rende 60-100 mg de complexo puro a partir de 1 L de meio LB.
    1. Interrompa a pelota celular por sônica usando um sonificador digital com sonda horn de 1/2" (ou um equipamento semelhante). Realize 20 ciclos a 80% de amplitude no banho de água gelada usando pulso de 10 s e repouso de 20 s ou até a interrupção completa da célula.
    2. Centrifugar a célula lysate a 30.000 x g para 30 min a 25 °C. Aspirar supernante, garantindo que a pelota não se desaloja do tubo. Filtre a fração sobrenante clarificada com um filtro de 0,45 μm à temperatura ambiente.
    3. Avalie o volume inicial da fração sobrenante clarificada. Adicione lentamente pequenas quantidades de sulfato de amônio por vez, até que se alcance uma saturação de 20% (11,51 g / 100 mL). Realize fracionamento de sulfato de amônio a 25 °C. Mexa suavemente a solução por 10 minutos e evite bolhas.
    4. Centrifugar a 30.000 x g por 10 min a 25 °C. Transfira a fração de 20% sobrenante em um frasco limpo. Ressuspenque suavemente 20% fração de pelota em 20 mL de tampão amostral 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, contendo 100 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2 mM dithiothreitol) e prepare uma amostra para executar o gel SDS-PAGE. Descarte a fração de 20% de pelotas.
    5. Avalie o volume inicial da fração sobrenante de 20%. Adicionar sulfato de amônio a 30% de saturação é atingido (5,94 g / 100 mL), solução de agitação, evitar bolhas e centrífuga como antes. Transfira a fração de 30% sobrenante em um frasco limpo. Ressuspenque suavemente 30% fração de pelota em 20 mL de tampão de amostra 2 e prepare uma amostra para executar o gel SDS-PAGE. Descarte a fração de 30% de pelotas.
    6. Avalie o volume inicial da fração de 30% sobrenante. Adicione sulfato de amônio a uma saturação de 40% (6,14 g / 100 mL), solução de agitação, evite bolhas e centrífuga como antes. Transfira a fração de 40% sobrenante em um frasco limpo. Resuspense suavemente 40% fração de pelota em 10 mL de tampão de amostra 2 e prepare uma amostra para executar o gel SDS-PAGE. Descarte a fração de 40% sobrenatante.
      NOTA: Avalie a qualidade do complexo αβStTS utilizando amostras das frações de 30% e 40% de supernanato e pelotas em um gel de 12% SDS-PAGE25. Se você verificar se qualquer outro complexo mutante αβStTS está na fração de 40% sobrenante, proceda com uma saturação de 60% de sulfato de amônio (13,0 g / 100 mL). Alíquotas de proteína pré-purificadas do complexo de α2β2 StSpré-purificados podem ser armazenadas a longo prazo a -80 °C ou usadas imediatamente para purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).
    7. Microcentrifuugar a amostra de proteína a 10.000 x g,20 min, 4 °C e carregue a fração supernaca em uma coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR anexada a uma cromatografia líquida de proteína rápida a uma taxa de fluxo de 0,5 mL min-1, previamente equilibrada no buffer SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5 gcerlyol, Fosfato piridoxal de 0,1 mM).
      NOTA: Para purificar grandes quantidades de complexo, carregue uma amostra de 5 mL a 20-25 mgml-1 em uma coluna HiLoad 26/600 Superdex 200 pg a uma taxa de fluxo de 1,5 mL min-1.
    8. Avalie amostras coletadas ao longo do fracionamento de sulfato de amônio e frações de pico da coluna SEC em um gel SDS-PAGE de 12% manchado com a mancha azul brilhante Coomassie25.
    9. Concentre o tipo selvagem ou mutante α2βcomplexoStTS com uma unidade de filtro centrífugo de corte de 15 mL 100 kDa girando a 3.000 x g a 4 °C. Transfira a proteína concentrada para um tubo fresco de 2,0 mL e microcentrifuuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) para remover agregados.
    10. Determine a concentração proteica24, prepare 0,5 mL aliquots a 20-25 mg mL-1, rótulo, flash-freeze em nitrogênio líquido, e armazene-os a -80 °C.

3. Cristalização otimizada para tipo selvagem e forma mutante do complexo de α2β2St.TS

NOTA: A condição inicial de cristalização para o complexo de α2β2StTS foi previamente relatada em condições que contenham 12% de PEG 8.000 e 2 mM de espermatozoide22.

  1. Prepare soluções de estoque antes dos ensaios de cristalização para obter uma melhor reprodutibilidade de cristalização. Para realizar estudos estruturais com TS, cristalize proteína com Na+ ou Cs+ íon no local de coordenação metálica do complexo bienzyme.
    1. Prepare a solução de estoque de 5 mL de 200 mM de espermatozoide na água e mantenha 500 alíquotas de μL a -20 °C.
    2. Prepare 50 mL solução de estoque de 30% (w/v) PEG 8000 em água e mantenha 25 mL aliquots em uma centrífuga descartável de 50 mL frascos cônicos a 25 °C.
    3. Prepare uma solução de estoque de 25 mL de 1 M CsCl na água e mantenha a 25 °C.
    4. Prepare a solução de estoque de 25 mL de 1 M NaCl na água e mantenha a 25 °C.
    5. Prepare a solução de estoque de 3x 50 mL de 1 M bicine e titulação com CsOH ou NaOH para obter soluções tamponadas em pH 7.6, 7.8 e 8.0. Mantenha 25 mL aliquots a 4 °C.
  2. Descongele uma amostra de α2β complexode StTS2(20-25 mg mL-1) em um banho de gelo.
  3. Amostra de microcentrifusagem a 10.000 x g por 10 min a 25 °C para remover agregados proteicos.
  4. Transfira a fração de supernascer limpo em um tubo de microcentrifuuge limpo.
  5. Concentração proteica estimada24 e alíquotas de proteína diluída (150-200 μL) a 15 mg mL-1 com 50 mM bicine-CsOH ou -NaOH, pH 7.8 contendo 50 mM CsCl ou NaCl. Mantenha a amostra de proteína a 25 °C.
  6. Prepare as soluções de reservatório de 500 μL para placas de gota 3x 24-well em tubos de microcentrifuse estéreis de 1,5 mL rotulados. A solução do reservatório contém 50 mM bicine-CsOH ou -NaOH, 50 mM CsCl ou NaCl, e PEG 8000. Varie a concentração de PEG 8000 (6-11%) nas colunas da placa e a concentração de espermatozoides (2-8 mM) nas fileiras da placa. Alterar pH tampão (pH 7.6, 7.8 e 8.0) para cada conjunto.
  7. Tampe os tubos e o vórtice vigorosamente pelo menos 10 segundos. Tubos de centrífugas a 10.000 x g por 10 min a 25 °C para remover bolhas. Dispense 500 μL de solução tamponada em cada reservatório rotulado.
  8. Use um micropipette P-10 e dispense 5 μL de solução proteica a 15 mg mL-1 por cada gota sentada bem. Evite bolhas. Adicione 5 μL de cada solução de reservatório correspondente à queda de proteína. Evite bolhas durante a mistura e não encobrindo para cima e para baixo para homogeneizar a mistura.
  9. Coloque a placa com uma fita adesiva transparente e armazene a placa a 25 °C. Cristais aparecem em 2-5 dias e crescem em suas dimensões completas dentro de duas semanas.

4. Coleta de dados de difração de raios-X e α2β solução de estrutura complexaStS2

NOTA: Antes da coleta de dados de difração de raios-X, prepare a solução crioprotetora para cada cristal com antecedência. Utilize a solução específica do reservatório para preparar 3 alíquotas contendo concentrações crescentes desulfóxido de imetil d na solução (10, 20 e 30% v/v) e ligante específico (s). O sulfóxido de dimetila foi encontrado como um crioprotetor melhor do que o glicerol, o etileno glicol e o PEG 200-300.

  1. Colher um grande cristal único usando um crioloop sob o microscópio estereoscópico.
  2. Pipeta 2 μL de cada solução crioprotetora contendo a solução de precipitação mais concentrações mais altas desulfóxido de imetil d e ligante (s) em um novo slide de cobertura.
  3. Sequencialmente, mergulhe crystal em cada gota e deixe o cristal equilibrar para 30 s na solução crioprotetora.
  4. Resfriamento flash do cristal crioprotegido usando um fluxo de nitrogênio gasoso a -173 °C (100 K) ou imerso em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo em discos.
    NOTA: Encha uma espuma Dewar com nitrogênio líquido, pré-esfrie um disco de cristal, armazene cristais no armazenamento criogênico Dewar e envie cristais para o síncrotron usando um carregador seco.
  5. Proceda com a coleta de dados de difração de raios-X a -173 °C. Registo de difração de raios-X usando um tempo de exposição de 0,5-4,0 e oscilações de 0,5°. Gire o cristal 180-360°.
  6. Processe as imagens de difração de raios-X com o iMosflm27 para gerar arquivo de reflexão no grupo espacial apropriado. Geralmente, α2β2CristaisstSpertencem ao grupo espacial C 121 (C2).
  7. Dimensione em conjunto múltiplas observações de reflexões com o Scala28,implementado no pacote CCP429.
  8. Resolva a estrutura do complexo de α2β2StTS de alta resolução por substituição molecular usando MolRep30 e um modelo de busca apropriado. Inspecione o modelo e o mapa de densidade de elétrons em Coot31 após uma solução de estrutura bem sucedida.
    NOTA: Existem muitas estruturas de cristais TS depositadas no Banco de Dados de Proteínas com diferentes ligantes (s). Para uma melhor etapa de substituição molecular e menor tempo de adaptação da nova estrutura de cristal, use o melhor modelo de busca contendo ligante (s) de interesse. Proceda com refinamento de estrutura cristalina em CCP429,30 ou Phenix31.
  9. Faça ajustes manuais no modelo usando Coot32, seguido de refinamento automático com Refmac29,33 ou phenix.refine31,34. Construa e refine o modelo final executando rodadas iterativas de construção de modelos em Coot32 e refinamento automatizado.
  10. Proceda com a deposição de fatores de coordenação e estrutura no site do Protein Data Bank.

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Representative Results

Purificação da α-e βsubunidades do sindtofano synthase
A α-subunidade(αStTS) e a β-subunidade (βStTS) do triofetase de typhimurium Salmonella foram subcloradas no vetor pET SUMO modificado. A Figura 1A mostra resultados representativos da SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão His6-SUMO-αStTS (pista αON) e His6-SUMO-βStTS (lane βON). O protocolo de purificação descrito neste trabalho permitiu a purificação de ambas as subunidades individualmente dentro de 2 dias. O primeiro dia foi usado para purificar cada proteína por cromatografia de afinidade Ni-NTA, precipitação de sulfato de amônio seguido por seu-SUMO-tag cleavage, remoção de traços de sua tag DE SUM-tag e concentração de proteínas. As figuras 1B e 1C mostram os resultados representativos do SDS-PAGE da subunidade α e da purificação de β-subunidade, respectivamente. No segundo dia, o concentrado α-subunidade, β-subunidade, e o complexo α2β2StTS do α e subunidades de β foram carregados em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. A Figura 1D mostra um perfil típico de elução de αStTS, βStTS e α2β2complexosStTS em uma coluna de exclusão de tamanho S-200 HR. A Figura 1E mostra um resultado representativo do SDS-PAGE das frações de pico coletadas. As frações de pico mais puras foram agrupadas, concentradas, e o complexo α2β2StTS foi utilizado para estudos de cristalização de proteínas.

Purificação do tipo selvagem e mutante α2β2Complexo deSt.TS
Outro protocolo rápido e eficiente para purificar o tipo selvagem e a forma mutante do α2β complexo de sinthase detifioso de 2S. typhimurium é descrito neste trabalho. A Figura 2 mostra uma representação do construto pEBA-10 contendo o tipo selvagem de acoplamento (trpA e trpB) codificação para a codificação α- e β-subunidades22. O protocolo de mutagenese PCR de duas etapas para gerar formas mutantes do complexo α2β2StTS é retratado na Figura 3.

As regiões de codificação do complexo mutante α2β2StTS em pEBA10 foram confirmadas pelo sequenciamento de DNA e usadas para transformar a cepa E. coli CB149 células26. O tipo selvagem e a forma mutante do complexo α2β2StTS foram superexpressos e as proteínas recombinantes foram purificadas com sucesso dentro de 1-2 dias. Fracionamento de sulfato de amônio à temperatura ambiente facilmente removeu a maioria das proteínas contaminantes do sistema de expressão heteróloga(Figura 4A, faixas 20P, 30P e 40S). Um perfil de eluição representativo com posição de eluição relativa de α2β2StTS (143,06 kDa) complexo em um HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR faixa de exclusão de tamanho cromatografia é mostrado na Figura 4B. A pureza das frações de pico excluídas foi analisada por SDS-PAGE antes do agrupamento (Figura 4C).

Otimização do tipo selvagem e mutante α2βcristalização do complexo de sintetizador triptofano 2
Alíquotas de tipo selvagem e mutantes α2β2StTScomplex a 15 mg ml-1 foram usados para configurar 24 placas de gota sentadas. Normalmente, as gotículas constituídas por uma solução proteica de 5 μL e o volume equivalente de solução de reservatório foram equilibradas contra 500 μL de solução de reservatório(Figura 5). A espermaina é necessária para cristalizar o tipo selvagem e mutante α2β2StTS complexo22. Enquanto a concentração final de espermatozoides para cristalizar o tipo selvagem é de 2 mM, a concentração de espermatozoides para cristalizar o complexo mutante neste trabalho mostrou-se ligeiramente maior (4-8 mM).

Grandes cristais individuais foram obtidos através de uma otimização de cristalização fina, variando PEG 8000 (6-11%) e pH tampão bicine. Cristais com diferentes morfologias apareceram em 2-5 dias e os cristais cresceram em tamanho real em duas semanas(Figura 6). Antes da coleta de dados de difração de raios-X, os cristais eram embebidos em solução crioprotetora (tampão de reservatório contendo até 30% de sulfoxida de dimetil). O processo otimizado resultou em cristais de qualidade adequados para medições de difração de raios-X em resolução quase atômica.

Análise de dados de difração de raios-X
Uma estrutura cristalina do tipo selvagem αcomplexo 2β2StTS foi preparada com métodos descritos neste artigo e os dados de difração de raios-X foram coletados em resolução quase atômica. O cristal foi encharcado em solução crioprotetora contendo inibidor F9 (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Phenyl]Sulfonyl}Amino)Ethyl Dihydrogen Phosphate) e L-Tryptophan.

Um conjunto completo de dados de difração de raios-X foi coletado na linha de feixe síncrotron SIBYLS 12.3.1 na Fonte avançada de luz (Berkeley-CA) girando o cristal 360° em incrementos de 0,5°. As intensidades de difração de raios-X foram processadas e as estatísticas de coleta de dados são resumidas na Tabela 1. A análise de simetria indica que o cristal pertencia ao monoclínico grupo espacial C2. Os parâmetros unit-cell são a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. O valor calculado do coeficiente matthews (Vm = 2,57 Å3 Da-1) sugere a presença de uma molécula heterodimer TS (αβ StTS) na unidade assimétrica do cristal com teor de solvente de 52,08%35,36. Todos os dados de raios-X foram coletados a baixas temperaturas (100 K) para melhorar a qualidade da difração e diminuir a decadência da radiação. A estrutura cristalina α2β2StTS em complexo foi resolvida pelo método de substituição molecular utilizando o modelo wild tipo αβ StTS em complexo com o inibidor F9 no α-local e íon césio no local de coordenação metálica (código de ID PDB: 4HT3). O arquivo de coordenadas final e os fatores de estrutura foram depositados no PDB com código de adesão 5CGQ (Figura 7A). A estrutura cristalina do tipo selvagem α2β2Complexo de StTS com inibidor F9 na enzima α-local(Figura 7B),íon de césio no local de coordenação metálica(Figura 7C),o cofactor piridoxal 5'-fosfato covalentemente ligado a βLys87(Figura 7D), e o produto L-triptofano na enzima β-local (Figura 7E) foi resolvido em 1,18 resolução de Angstrom. O modelo 5CGQ é a mais alta resolução α2β estrutura de cristalStS2depositada no PDB até o momento.

Figure 1
Figura 1: Purificação das subunidades α e β e docomplexo α2β2StS. (A) Expressão proteica recombinante. 12% gel SDS-PAGE do perfil de expressão durante a noite de SUMO-αStTS (αON) e SUMO-βStTS (βON) após indução iPTG a 30 °C (indução α de IPTG/β0 anterior). (B, C) Cromatografia de afinidade ni-NTA seguida de precipitação de sulfato de amônio (60% de saturação), (S) extrato bruto esclarecido (FT1) Coluna Ni-NTA passa pela amostra de lavagem de coluna (W) amostra de lavagem de coluna (E) eluia (60S) e (60P) sobrenasções e frações precipitadas após centrifugação de alta velocidade, respectivamente (D) Produto de digestão SUMO-protease (FT2) A coluna Ni-NTA passa por amostra contendo a α subunidadeStS stSou βStTS. (D) perfil de eluição de α subunidadeStTS (28,67 kDa), subunidade de βStTS (42,86 kDa) e α2βcomplexostTS (143,06 kDa) com uma coluna de exclusão HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. Cada corrida foi realizada separadamente. (E) Géis SDS-PAGE das frações de pico excluídas de cada cromatografia individual. Enquanto 15% dos géis SDS-PAGE estavam preparados para analisar α2βcomplexo stS 2e α subunidadeStTS, um gel SDS-PAGE de 12% foi preparado para analisar a subunidade βStTS. Lane MW, marcadores de peso molecular em kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Representação da construção pEBA-10. (A) Representação do tipo selvagem do tipo translacionário (trpA e trpB) codificando o α- e βsubunidades do triofetase do triptofano da bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) O vetor contém um gene de resistência à ampicilina (ampicillin), uma origem de replicação (ori), um genelacI q para melhor desligar um promotor de lac na ausência do indutor IPTG, e o promotor reprimido LacI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Representação geral do protocolo de mutagenese PCR de duas etapas. O vetor pEBA-10 foi usado como modelo de DNA. A primeira rodada de PCR foi preparada com os primers TS-FW-NcoI e MUT-REV (um primer reverso contendo uma mutação) para gerar o primeiro fragmento e primers TS-Rev-SacI e MUT-FW (um primer dianteiro contendo uma mutação) para gerar o segundo fragmento). Fragmentos foram purificados em gel e equimolarly combinados, calor desnaturado e revirado. Os fios recombinantes foram estendidos com polimerase e desoxiribonucleotídeos. A segunda rodada de PCR foi preparada com os primers TS-FW-NcoI e TS-Rev-SacI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Purificação do tipo selvagem e forma mutante de α2β2Complexo deSt.TS. (A) 12% gel de SDS-PAGE de amostras coletadas ao longo da precipitação de sulfato de amônio usando 20, 30, 40 e 50% de saturação de sulfato de amônio à temperatura ambiente: (CE) extrato bruto (S) e (P) sobrenasce e precipitar frações após centrifugação de alta velocidade. (B) Perfil de eluição de α2β2StTS (143,06 kDa) complexo com uma coluna de cromatografia de tamanho HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. (C) 12% imagem em gel SDS-PAGE das frações de pico excluídas. Lane MW, marcadores de peso molecular em kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Otimização de cristalização para tipo selvagem e forma mutante de α2β2Complexo stS. Os cristais foram cultivados em 50 mM Bicine-CsOH tampão contendo 50 mM CsCl2. A concentração de polietileno glicol 8000 (6-11%) e espermaina (2-8 mM) foram variadas para obter formas de cristais grandes para realizar estudos estruturais por cristalografia proteica de raios-X. (A)Bicine-CsOH, pH 7.6. (B) Bicine-CsOH, pH 7.8. (C) Bicine-CsOH, pH 8.0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Fotomicrograph de cristais de tipo selvagem e forma mutante de α2β2StTS complexo. Os cristais diferem na morfologia, mas pertencem ao grupo espacial C2. Os cristais cresceram em suas dimensões completas nas condições finais após duas semanas. Cristais de aproximadamente 0,20 x 0,15 x 0,10 mm de tamanho. (A-D) Holocristas PLP em complexo com íon de césio no local de coordenação metálica da forma tipo selvagem (coluna A), forma mutante α2β2 βQ114A (coluna B), α2β2 βK167T (coluna C) e α2β2 βS377A (coluna D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Visualização global da estrutura cristalina e validação de mapas de densidade eletrônica obtidos após o refinamento da estrutura cristalina. (A) estrutura cristalina do tipo selvagem α2β2Complexo de StTS com inibidor F9 na enzima α-local (cor amarela), íon de césio no local de coordenação metálica (cor azul), o piridoxal do cofator 5'-fosfato covalente ligado a βLys87 (cor verde), e o produto L-triptofano na enzima β-local (cor ciano) a 1,18 resolução Angstrom. Enquanto a subunidade α é colorida em azul claro, a subunidade β é colorida em salmão. (B-E) Mapas de densidade eletrônica contornados a 1,0 r.m.s. ao redor(B) inibidor F9(C) íon de césio(D) piridoxal-5′-fosfato, e(E)L-Triptofano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coleta e processamento de dados
Fonte de raio-X / Linha de feixe Als Beamline 12.3.1
Comprimento de onda (Å) 10,000
Resolução (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Número total de reflexões 2151280 (252941)
Total de reflexões únicas do número 231646 (32187)
Grupo espacial para indexação, dimensionamento e fusão C 12 1
Dimensões celulares
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mosaico 0.61
Volume matthews VM (Å3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Completude (%) 98.6 (94.2)
Multiplicidade 9.3 (7.9)
Estatísticas de refinamento
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
Comprimento do título RMSD (Å) 0.0120
Ângulo de ligação RMSD (°) 14,059
Ramachandran favorecido 515 (96.44%)
Ramachandran permitido 16 (3.00%)
Ramachandran proibido 3 (0.56%)

Tabela 1: Coleta e processamento de dados. Valores entre parênteses são para a camada externa.

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Discussion

Nós projetamos com sucesso a forma mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, e α2β2 complexos βS377A StTS para estudos de correlação estrutura-função. Inicialmente, tentamos purificar os mutantes usando um protocolo de purificação anterior22, que requer α2β cristalização do complexoStTS2com PEG 8000 e espermatozoide durante a purificação. Embora a taxa de cristalização dependa da forma mutante e da concentração do complexo em solução, sendo difícil prever quando cristais aparecem em um grande volume de solução. A cristalização poderia ser alcançada após longos períodos (48-96 h) ou sendo necessária a adição de quantidades extras de PEG 8000 após o início da cristalização15.

Infelizmente, as formas mutantes de α2β complexode StTS apresentado neste trabalho não foram purificadas com sucesso usando este protocolo, uma vez que falharam em cristalizar durante as etapas iniciais do protocolo, prejudicando estudos cristalográficos. Por isso, criamos um protocolo de purificação simples e eficiente que compreende o fracionamento de sulfato de amônio e a cromatografia de exclusão de tamanho, que dão altos rendimentos de tipo selvagem e forma mutante de α2β complexo de2StTS. Este protocolo é mais rápido (1-2 dias) e reprodutível quando comparado com o protocolo anterior (5-7 dias)15,22, uma vez que não há requisitos de cristalização e solução de problemas de protocolo ao longo da purificação. Além disso, criamos novas construções de expressão e protocolo para purificar altas quantidades do complexo α-subunidade, β-subunidade e o reconstituto α2β complexode StS2dos isolados.

A aplicação futura inclui a recombinação de subsimentos de tipo selvagem e mutantes para realizar estudos funcionais e estruturais. Mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, e α2βcomplexo 2 βS377A cristalizado em condições que contêm maiores concentrações de espermatozoides (4-8 mM) quando comparado com a forma tipo selvagem (2 mM). Portanto, vale a pena gastar tempo para melhorar a qualidade dos cristais proteicos variando a concentração de precipitantes e pH tampão. As formas de cristal grandes únicas cresceram aleatoriamente na solução tamponada bicina (pH 7.6-8.0) contendo 6-11% PEG 8.000. Os métodos descritos neste trabalho serão utilizados para preparar estruturas cristalinas do tipo selvagem e formas mutantes do complexo α2β2 com diferentes ligantes dentro dos sítios α e β ativos, imitando diferentes intermediários e estados de transição envolvidos na conversão de indol e serino ao triptofano. As estruturas cristalinas desses mutantes são esperadas para fornecer novas percepções sobre o mecanismo e os papéis desempenhados por resíduos-chave na síntese L-Triptofano.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar e não declaram interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (GM097569).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

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