Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

Abstract

Salmonella tiphimurium'dan triptofan sintaz (TS) bienzim kompleksi (α2β2 TS) ile yapılan yapısal çalışmalar, katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve PLP'ye bağımlı enzimlerde substratın ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yalıtılmış α ve yalıtılmış β alt birliğini üretmek için yeni bir ifade sistemi, yüksek miktarda saf alt birim ve α2β2StTS kompleksinin izole alt birli dış birimlerden 2 gün içinde arındırılmasına izin etti. Saflaştırma, benzeşim kromatografisi ve ardından benzeşim etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltme ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-sitedeki anahtar kalıntılarının rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda bölgeye doğrudan mutajensis yapıldı. Vahşi tip ve mutant α2β2StTS kompleksini arındırmak için başka bir protokol oluşturuldu. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanılarak basit, hızlı ve verimli bir protokol, α2β2StTS kompleksinin tek bir günde arındırılmasına izin sağladı. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü, saflaştırma protokolü boyunca α2β2StTS kompleksini kristalize etmek için PEG 8000 ve spermin kullanarak aynı kompleksi arındırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Vahşi tip ve bazı mutant formlarının kristalleşmesi, peg 8000 ve spermin kullanarak bazı mutantların saflaşmasını bozan biraz farklı koşullar altında gerçekleşir. X-ışını kristalografik çalışmalarına uygun kristalleri hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyoproteksiyonu optimize etmek için çeşitli çabalar sarfedildi. Burada sunulan yöntemler genellikle triptofan sintaz alt biraları ve vahşi tip ve mutant α2β2StTS komplekslerinin saflaştırılması için uygulanmalıdır.

Introduction

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α2β2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik birenzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S'nin inhibisyonu. tifüs α2β2 TS kompleksi (α2β2StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır4, genital ve oküler enfeksiyonlar5ve tarımda potansiyel herbisit kullanımı için6. α-alt birimi, GAP ve indole3,6'yıüretmek için bir indolenine tautomer ara ve daha sonra karbon-karbon bağı bölünmesinin oluşumu yoluyla, gliseraldehit-3-fosfat (GAP) ve indole'ye kadar olan aldolitik bölünmeyi kataliz eder. β katalitik alan, β-Lys87'ye bir Schiff tabanı aracılığıyla bağlı bir piridoksial 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir, bu da enzim β-alt biradaki reaksiyonlar sırasında bir elektron lavabosu olarak işlev β3,7. β alanı, L-Serine yan zincir hidroksilinin L-Triptofan ve PLP'ye bağımlı reaksiyonda bir su molekülü vermek için hintkenede değiştirilmesini katalİze eder. St TS, çok enzimli kompleksler içinde substrat kanal ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir2,3. L-Triptofan sentezi sırasında katalitik adımları senkronize etmek ve indole salınımını önlemek için TS'nin α ve β alt biraları arasındaki çift yönlü allosterik iletişim3. Bu çabayı genişletmek için, StTS β-subunit'in katalitik bölgesinde enzim yapısı, mekanizması ve fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılmasında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonu ile birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık.

Edith W. Miles araştırma grubu tarafındanα 2β2StTS'nin katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma başlatılmıştır. Yerli Escherichia coli α2β2 TS kompleksi ile yapılan ilkçalışmalar,yalıtılmış α-alt bira 8 ,9, izole β-alt bira 10,11ve α 2 β 2TS kompleksinin yalıtılmış alt birelerden arındırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmıştır12. Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltme, örnek diyaliz, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve DEAE-Sephadex sütun12üzerinde ikinci bir kromatografik yuvarlak ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, netleştirilmiş hücre lisatının bir DEAE-Sephadex sütununa yüklenmesi ve ardından Sepharose 4B sütununa kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz13. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia coli α2β2 TS kompleksi kristalize edildi, ancak kristaller o zaman X-ışını kırınımı için uygun değildi.

Yeni bir çalışmada, S. typhimurium α 2 β2TS kompleksinin rekombinant ve vahşi tip formları saflaştırıldı ve kristalize edildi14,15. Rekombinant α2β2StTS kompleksi, pEBA-10 ifade vektörü taşıyan E. coli strain CB149'da aşırı ifade edildi. α2β 2StTS kompleksinin ilk kristalizasyonu veX-ışınıkırınım verisi toplanması ve analizi14bildirilmiştir. Bununla birlikte, α2β2StTS kristalleri gibi uzun ve ince iğne yapısal çalışmaları bozmuşlardır. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, α 2 β 2StTS kompleksi15'invahşi tipini ve mutant formlarını arındırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlanmıştır. Temizleme, netleştirilmiş hücre lisatına spermin ve PEG 8.000 kullanılarak ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük bir hacimli çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyon2β2StTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 4 °C'de 16-48 saat boyunca depolandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun bir şekilde çaprazlandı. Protein kompleksi amonyum sülfat içeren tamponda rekristalite edildi ve15. Protein kristalizasyonu çözeltideki protein ve çökelti konsantrasyonlarına bağlı olsa da, çözeltideki diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve çoğaltmak α2β2StTS kompleksinin çözeltisinde. Bu protokol, herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajına sahiptir; bununla birlikte, dezavantajları, tipik olarak 5-7 gün gerektiren kristalize etmek, dialyze etmek ve recrystallize etmek için gerekli olan uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplama için uygun kristaller elde etmek, 600'den fazla kristalizasyon koşulu protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökeltiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddeleri (CaCl 2 , MnCl2, ZnCl2, kadavra, putrescine, spermin veya spermidin) kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak değerlendirildi15. Kristaller daha iyi bir kristal formuna sahipti ve% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalizasyon 4, 30 veya 42 ° C yerine 25 ° C'de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara büyüdü15. O dönemde(1996-β1999) 16 , 17 , 18 , 19,20,21ve daha birçok yapının yayınlandıkları α bildirilmiştir.

Burada temel amaç triptofan sintazını arındırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, yalıtılmış β-alt birliğini (β St TS), 2 β 2StTS kompleksini yalıtılmış alt birelerden yeniden oluşturan αalt birliğini (α αStTS), α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarını arındırmak için önemli iyileştirmelergöstermektedir. Arınma süresi önemli ölçüde azaltıldığı ve kristalizasyon ve kriyoproteksiyon optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemli ölçüdedir. Bu çalışmada tasarlanan α2β2StTS kompleksinin mutant formları, vahşi tip formu için kullanılan durumun yakınında kristalleşmiştir. Bununla birlikte, atomik çözünürlüğe yakın yapı belirleme için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar Protein Veri Bankası'nda (PDB) bakteri, arkea ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıyı oluşturan 134 triptofan sintaz kristal yapısı bulunmaktadır. Güzel bir şekilde, 73 yapı S. enterica serovar typhimurium'a aittir ve α 2 β2StTS kompleksinin5kristal yapısı 1.50 Angstrom'dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5'te 4'ü hazırlandı (PDB IDs:5CGQ 1.18 Å'da, 4HT3 1.30 Å'da, 4HPJ 1.45 Å'da, 6DZ4 1.45 şçözünürlükte). α2β2StTS kompleksinin mutant formunun rafine kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde yer alan esansiyel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. α ve β alt birliğini ve yeniden birlenenα 2β2StTS kompleksini arındırmak için hızlı protokol

  1. pETSUMO ifade vektörüne DNA alt kavunu
    1. pEBA-10 ekspresyon vektörü22'deklonlanmış Salmonella enterica serovar typhimurium bakterisinden triptofan sintazının αkodlayan çevirisel kavrama genini (trpA ve trpB) ve β-alt biralarını elde edin. DNA şablonu olarak pEBA-10 vektörü kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, aşağıda listelenen astarlar Salmonella enterica serovar tiphimurium genomundan her iki geni de yükseltmek için kullanılabilir. Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi.
    2. StTS-FW-Bam veα astarlarla α-subunit 'in (αStTS) tamuzunlukta polinükleotid dizisini tek tek yükseltmek içinpolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın St TS-Rev-Eco veStTS-FW-Bam ve βStTS-Rev-Hind β astarları ile β -subunit (βStTS) tam uzunlukta dizilimi α. Yaklaşık 55 °C'lik bir erime sıcaklığı ve 2 dakikalık bir polimeraz uzatma süresi kullanın.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72 °C'de 300 saniye) kullanın.
        NOT: Italik diziler sırasıyla BamHI, EcoRI, BamHI ve HindIII kısıtlama sitelerine karşılık gelir. PCR parçalarının terminine yakın enzim bölünme verimliliği ekstra bazlar (küçük harf dizileri) eklenerek geliştirilmiştir.
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCCCTC-3′
    3. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın ve jel, üreticiden gelen talimatları izleyerek bir silika boncuk kiti kullanarak PCR parçasını arındırır.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin.
      2. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin.
      3. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE'ye% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel özü ve jel, sindirilen parçayı ticari bir kit kullanarak arındırın.
    4. Her parçayı ayrı ayrı E. coli ekspresyonuna altklam, daha önce uygun enzimler ve jel saflaştırılmış ile sindirilen vektör pET SUMO'su modifiye etti.
      NOT: Bu vektör ticari pET SUMO'nun değiştirilmiş bir sürümüdür. Bu vektör kısıtlama enzim klonlama için optimize edilmiştir. pET28b vektörün çoklu klonlama bölgesi (MCS)(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI ve XhoI) pET SUMO klonlama bölgesine eklenmiştir. Bu vektör, Small Ubiquitin benzeri Değiştirici proteini (SUMO) ve birden fazla klonlama bölgesi ile çerçevede bir N-terminal 6x-Histidin etiketi içerir.
    5. 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile 100 ng modifiye pET SUMO ve 50 ng PCR parçası ligate.
    6. İnşa edilen plazmidi E. coli strain DH10B α hücrelerinin yetkinhücrelerine dönüştürün. LB agar plakalarında 35 μg/mL kanamycin içeren plaka hücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    7. Her dönüşümden tek bir koloni seçin, ultra saf plazmid DNA hazırlayın ve αStTS veya βStTS'nin N-terminal His6-SUMO etiketiyle çerçeve halinde klonlandığını doğrulamak için DNA dizilemesi gerçekleştirin.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonu% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda çevirin) ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.
    8. Plazmid SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ekspresyonunu ayrı ayrı T7 promotör tabanlı bir sistemle E. coli expression strain Rosetta (DE3) pLysS'in yetkin hücrelerine dönüştürün. 35 μg/mL kanamycin ve kloramfenikol içeren Luria Bertani (LB) agar plakalarındaki rekombinant hücreleri plakalayın. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    9. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) ve her iki antibiyotikle 5 mL LB ortamına dağıtın. Kültür hücreleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya hemen rekombinant protein ekspresyoyu için kullanın.
  2. SUMO-αStTS ve SUMO-βStTS alt birliklerinin ifadesi
    1. SUMO- α St TS veya SUMO-βStTS'yi barındıran taze E. coli suşu Rosetta(DE3) pLysS hücrelerini aşılayın, donmuş gliserol stoğunun bir kısmını 35 μg/ mL kanamycin ve kloramfenikol içeren 50 mL LB kültürüne inşa eder veya kazır. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
    2. Ertesi sabah, %2 gliserol artı kanamycin ve kloramfenikol (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'de gece hücre kültürünün 5 mL'sini aşıla. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
      NOT: LB suyunda SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ifadesi litre başına 125-150 mg etiketli protein verir. Belirli talepleri yerine getirmek için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
    3. OD600, 0.4 mM'lik son konsantrasyonda izopropil β-D-1 tiyogalactopyranoside (IPTG) ilavesiyle 0.6-0.8'e ulaştığında rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
    4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleme yaparak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, % 5 gliserol, 10 mM 2-mercaptoethanol ve 40 mM imidazol-Cl) içeren 60 mL'lik son hacme kadar yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun.
  3. Arınma α- ve triptofan sinthase β alt biraları
    NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler 4 °C'de yapılmalıdır. Saflaştırma süresini azaltmak için, protein saflaştırmadan önce veya rekombinant protein ekspresyonu sırasında ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunlarını ve boyut dışlama sütununu tamponda dengeler.
    1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
    2. Hücre lisatını 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Süpernatantı buz üzerinde 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve liziz tamponu 1'de önceden dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunundan geçirin.
      NOT: Her Ni-NTA agarose sütunu SUMO- αStTS veya SUMO-βStTS rekombinant proteini saflaştırmak için kullanılacaktır. Saflaştırma, hızlı proteinli sıvı kromatografi sistemine bağlı 2x 5 mL Ni-NiTA kolonunda yapılabilir. Her seferinde bir proteini arındırır.
    3. Ni-NTA agarose sütununu 100 mL lizis tamponu 1'de yıkayın.
    4. E1 tamponu (25 mM Tris-Cl tampon, pH 7.8, 200 mM NaCl, %5 gliserol ve 400 mM imidazol-Cl) içeren 80 mL tek adımlı bir elution ile devam edin.
      NOT: SUMO-proteaz 300 mM imidazol tolere eder ve santrifüj filtre cihazlarının zarı 100 mM imidazol tolere eder. Yüksek miktarda iimidazol çıkarmak ve saflaştırma süresini azaltmak için amonyum sülfat yağışı yapmanızı öneririz, bunun yerine protein örneğini seyreltin ve protein konsantrasyonu ile zaman kaybedin.
    5. Süpernatant kesirinin başlangıç hacmini değerlendirin. 25 °C'de %60 doygunluğa (39,48 g/ 100 mL) ulaşılana kadar bir seferde yavaşça az miktarda amonyum sülfat ekleyin. Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.
    6. Üst kısmı dikkatlice epire edin ve atın. Pelet fraksiyonunu 20 mL numune tamponunda (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl ve% 5 gliserol) yeniden biriktirin.
    7. SUMO-proteazlı His-SUMO etiketli dekolte için Saccharomyces cerevisiae'den Ubl'ye özgü proteaz 1'in rekombinant parçasını 1:1000 oranında ekleyin ve karışımı 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
    8. Numuneyi bir benzeşim kromatografi kolonundan yüklemeden önce protein agregalarını çıkarmak için sindirim ürününü 25 °C'de 10.000 x g'da santrifüjlayın.
    9. Daha önce lizis tamponu 1'de dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose sütununda 20 mL resüspended örneği geçiren His6-SUMO etiketinin izlerini kaldırın.
    10. Etiketlenmemişα St TS veya βStTS içeren geçiş örneğini toplayın.
    11. St TS veyaβ StTS etiketlenmemiş artıkları toplamak için Ni-NTA sütununu 20 mL tampon1'α yıkayın.
    12. 4 °C'de 3.000 x g'da dönerek her alt birimi 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile ayrı ayrı konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 1mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Önceden saflaştırılmış protein örnekleri -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için hemen kullanılabilir.
    13. Sec'den önceki agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 10.000 x g'da bir protein aliquot (20 mg) ve mikrosantrifüj alın.
    14. Örnek, daha önce SEC tamponunda (10 mM Tris-Cl, 10 mM Tris-Cl) daha önce dengelenmiş 0,5 mL min-1akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir boyut dışlama kromatografi sütununa (örneğin, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) yükleyin. pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat).
      NOT:StTS veya βStTS alt birliğini daha yüksek miktarlarda yalıtılmış α arındırmak ve SEC turlarının sayısını azaltmak için, 20-25 mg mL-1'de 5 mL'lik bir örneği 1,5 mL min-1akış hızında bir boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin.
    15. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin25.
    16. Proteini taze 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre üniteleri ile konsantre edin, protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 0,5mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flash-freeze yapın ve -80 ° C'de saklayın.
  4. α2β2StTS kompleksinin α ve β alt birilerden arındırılması
    NOT: SEC tamponunda (Sephadex S-200 HR veya Superdex 200 pg) boyut dışlama kromatografi sütununu (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat) dengele.
    1. Vahşi tip α2β2StTS kompleksini α ve β alt birilerden arındırmak için, α St TS ve βStTS altbiritelerinin konsantre örneklerini 4 °C'de çözün.
    2. Aliquots (1.2 αStTS: 1.0 βStTS molar oranı) ve 1 saat boyunca 4 °C'de inkübe edilmiş birleştirin.
      NOT: Β St TS'nin çoğunun α2β 2StTS kompleksine dahil edileceğini sağlamak içinαStTSfazlalığı gereklidir.
    3. Protein agregalarını mikrosantrifüjleme ile çıkarın (10.000 x g, 10 dk, 4 °C).
    4. Netleştirilmiş süpernatantı boyut dışlama sütununa yükleyin.
    5. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin25.
    6. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 15-20 mg mL -1'de 250-1000μLaliquots hazırlayın, sıvı nitrojende flaş dondurun ve -80 °C'de saklayın.

2. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması

  1. StTS'β mutant hazırlamak için mektağa yönelik mutajensis
    1. βzincirli TS polinükleotid dizisinde belirli nokta mutasyonlarını tanıtmak için iki adımlı polimeraz zincir reaksiyonu sırasında DNA şablonu olarak yapı pEBA-10 ekspresyon vektörü22'yi kullanın.
      NOT: Bu protokol, Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek nokta mutasyonu tanıtmak için kullanılabilir. Ek olarak, istenen mutasyonu içeren yeni oligonükleotid astarlar uygun şekilde tasarlanmalıdır. Bu çalışmada Q114A, βK167T, βS377A βmutasyonlar listelenmiştir.
    2. Sırasıyla A1, B1 ve C1 parçaları oluşturmak için TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev ve TS-FW-NcoI/S377A-Rev çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      NOT: Sırasıyla Oligonükleotid TS-NcoI-FW ve TS-SacI-Rev, pEBA-10 vektöründe klonlanmış αβ StTS polinükleotid dizisinin yukarı ve aşağı akışlarını tavlar.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72°C'de 300 saniye) kullanın.
        NOT: Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi. Küçük harf dizisi bir kısıtlama bölgesine karşılık gelirken, kalın ve italik bir dizi bir mutasyona karşılık gelir.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Sırasıyla A2, B2 ve C2 parçaları oluşturmak için TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF ve TS-Rev-SacI/S377A-FF çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Kısmi parçaları ayrı ayrı yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu kullanın. 55 °C erime sıcaklığı ve 2 dk polimeraz uzatma süresi kullanın.
    5. PCR reaksiyonlarının ikinci turunu gerçekleştirmek için, PCR ürününü 6 V / cm'de 1x TAE'ye% 0.8 agarose jel üzerine yükleyin ve jel özü ve jel ilgi parçalarını arındırır.
      1. A1/A2, B1/B2 ve C1/C2 parçalarını ayrı ayrı equimolar miktarlarda karıştırın, karışımı 96 °C'de 10 dakika ısı denatüresi ve 25 °C'de tavlama. Rekombinant iplikçikleri üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli bir polimeraz ve deoksiribonükleotidlerle genişletin.
    6. Tam uzunlukta mutant DNA parçasının yüksek kopya sayısını oluşturmak için, ikinci bir PCR gerçekleştirmek için Oligo primer TS-FW-NcoI ve TS-Rev-SacI ekleyin.
    7. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın, jel PCR parçasını arındırın ve üretici tarafından önerilen uygun tampon ve koşulları takiben 37 ° C'de 2 saat boyunca uygun kısıtlama sindirimine devam edin.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda %0,8 agarose üzerine yükleyin ve sindirilen PCR parçasını arındırın.
    8. Üreticinin tavsiyesine uyarak NcoI ve SacI kısıtlama enzimleri ile 200 ng pEBA-10 yapıyı sindirin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, bant muhabirini vektöre boşaltın ve jel sindirilen vektörü arındırın.
    9. 100 ng vektörü, daha önce sindirilmiş ve saflaştırılmış 50 ng PCR parçası ile 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile ligate edin. İnşa edilen plazmidi yetkin hücrelere dönüştürün E. coli strain DH10B hücreleri. LB agar plakalarında 50 μg/mL ampisilin içeren plakahücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    10. Her hücre dönüşümünden tek bir koloni (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) seçin ve ampisilin içeren 5 mL LB ortamına dağıtın. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün. Tasarlanan her yapıdan 10 μg ultra saf plazmid DNA hazırlayın. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonuna% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda dönün) ve -80 ° C'de uzun süreli depolayın.
    11. Triptofan sintazının α ve β alt birimlerini kodlayan tam uzunlukta sırayı doğrulamak için DNA dizilimini gerçekleştirin. Her bir tek mutasyonu onaylayın ve istenmeyen rastgele mutasyon içeren plazmid yapıyı atın. Bu çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler aşağıda listelenmiştir.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
      NOT: Oligonükleotid astarları TS-1F, TS-1R, TS-2F ve TS-3F tavla, β alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP051286.1). Astarlar TS-4F ve TS-5F tavla, α alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP053865.1).
    12. Trp operon 26'dan yoksun E. coli expression strain CB149'un yetkin hücrelerini dönüştürmek için her plazmid yapının 200 ng'sini (pEBA-10- β Q114A, pEBA-10- β K167T ve pEBA-10-βS377A) kullanın. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin ve hücreleri 50 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamında büyütün. Bir gecede 37 °C'de bakteri inkübatöründe kültür. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya rekombinant protein ekspresyoyu için hemen kullanın.
      NOT: Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek bir nokta mutasyonu enzim fonksiyonunu bozabilir veya E. coli strain CB149'da L-Triptofan sentezini azaltabilir. Bir SDS-PAGE jelinde 2 β 2StTS kompleksinde herhangi bir ifade veya daha düşük miktarda rekombinant tespit α E. coli strainBL21(DE)pLys-Sveya Rosetta (DE3)pLys-S kullanmayı düşünün.
  2. E. coli'deki α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formunun ekspresy ekspresyolası
    1. 50 μg/mL ampisilin içeren taze ve steril 50 mL LB ortamında istenen yapıyı barındıran E. coli ifade suşunu büyütün. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
    2. %2 gliserol artı ampisilin (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'ye 5 mL gece hücre kültürü ekleyin. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
    3. OD600 0.6-0.8'e ulaştığında, 0.4 mM'lik son konsantrasyonda IPTG'nin eklenmesiyle rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
    4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleyarak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF) içeren 50 mL tampon ile yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun. LB suyunda α2β2StTS kompleksinin mutant ve vahşi tip formunun ifadesi litre başına 125-150 mg protein verir. Belirli talepleri karşılamak için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
  3. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması
    NOT: Aşağıdaki protokol, etiketlenmemiş rekombinant vahşi tipini veya mutant formunu rekombinant α arındırmak için tasarlanmıştır.2β2StBeceri set ve çabalara bağlı olarak 1 gün içinde TS kompleksi. Saflaştırma süresini azaltmak için, tampon önceki protein saflaştırma/ekspresyonunda boyut dışlama sütununu dengeler. Vahşi tip veya mutant α arındırılması2β2StTS kompleksi, amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisinden oluşan iki aşamalı bir saflaştırma ile gerçekleştirilir. Bu protokol, 1 L LB ortamından 60-100 mg saf kompleks sağlar.
    1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
    2. Hücre lirfatını 25 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonu oda sıcaklığında 0,45 μm filtre ile filtreleyin.
    3. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonunun başlangıç hacmini değerlendirin. % 20 doygunluğa ulaşana kadar (11,51 g / 100 mL) bir seferde küçük miktarlarda amonyum sülfat ekleyin. 25 °C'de amonyum sülfat fraksiyonasyonunu gerçekleştirin. Çözeltiyi 10 dakika hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
    4. 25 °C'de 10 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj. % 20'lik süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 2 mM dithiothreitol içeren) %20 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 20 pelet fraksiyonunu atın.
    5. %20'lik süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 30 doygunluğa (5,94 g / 100 mL) amonyum sülfat ekleyin, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. % 30'luk süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de %30 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 30 pelet fraksiyonunu atın.
    6. %30'luk süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 40 doygunluğa (6.14 g / 100 mL) ulaşılır, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüj ekleyin. % 40'lık süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 10 mL numune tamponu 2'de %40 pelet fraksiyonunu hafifçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. %40'ından fazla olan kesirini atın.
      NOT: %12 SDS-PAGE jel25'te %30 ve %40'lık süpernatant ve pelet fraksiyonlarının örneklerini kullanarak αβStTS kompleksinin kalitesini değerlendirin. Başka bir mutant αβStTS kompleksinin% 40 süpernatant fraksiyonunda olduğunu doğrularsanız, % 60 amonyum sülfat doygunluğu ile devam edin (13.0 g / 100 mL). Önceden saflaştırılmış α2β2 StTS kompleksinin önceden saflaştırılmış protein aliquotları -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya hemen bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için kullanılabilir.
    7. Protein örneğini 10.000 x g,20 dk'da mikrosantrifüjleyin, 4 °C ve süpernatant fraksiyonu, daha önce SEC tamponunda dengelenmiş 0,5 mL min -1 akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir HiPrep16/60Sephacryl S-200 HR sütununa yükleyin (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0,1 mM piridoksial fosfat).
      NOT: Büyük miktarlarda kompleksi arındırmak için, 26/600 Superdex 200 pg'lik bir HiLoad sütununa 20-25 mgmL-1'de 5 mL'lik bir numuneyi 1,5 mL min-1akış hızında yükleyin.
    8. Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 SDS-PAGE jel üzerinde SEC sütunundan amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve tepe fraksiyonları boyunca toplanan örnekleri değerlendirin25.
    9. Vahşi tip veya mutant α2β 2StTS kompleksini4°C'de 3.000 x g'da dönerek 15 mL 100 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın.
    10. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 0,5mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.

3. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipi ve mutant formu için optimize edilmiş kristalizasyon

NOT: α2β2StTS kompleksi için ilk kristalizasyon durumu daha önce% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin22içeren koşullarda bildirilmiştir.

  1. Daha iyi bir kristalizasyon tekrarlanabilirliği elde etmek için kristalizasyon testlerinden önce stok çözümleri hazırlayın. TS ile yapısal çalışmalar yapmak için bienzim kompleksinin metal koordinasyon sahasında Na+ veya Cs+ iyon ile proteini kristalize edin.
    1. Suda 200 mM spermin 5 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 500 μL aliquots'u -20 °C'de tutun.
    2. Suda %30 (w/v) PEG 8000'lik 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 mL'lik tek kullanımlık santrifüj konik şişelerde 25 mL aliquots'u 25 °C'de tutun.
    3. Suda 1 M CsCl'lik 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
    4. Suda 1 M NaCl 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
    5. pH 7.6, 7.8 ve 8.0'da tamponlanmış çözeltiler elde etmek için CsOH veya NaOH ile 3x 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve CsOH veya NaOH ile titrat hazırlayın. 25 mL aliquots'ı 4 °C'de tutun.
  2. Bir buz banyosundaα 2β2StTS kompleksinin (20-25 mg mL-1)bir örneğini çözün.
  3. Protein agregalarını çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüj örneği.
  4. Temizlenmiş süpernatant fraksiyonu temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Tahmini protein konsantrasyonu24 ve seyreltilmiş protein aliquots (150-200 μL) 15 mg mL-1 ile 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, pH 7.8 içeren 50 mM CsCl veya NaCl. Protein örneğini 25 °C'de tutun.
  6. Steril 1,5 mL etiketli mikrosantrifüj tüplerde 3x 24 kuyulu oturma damla plakaları için 500 μL rezervuar çözümlerini hazırlayın. Rezervuar çözeltisi 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, 50 mM CsCl veya NaCl ve PEG 8000 içerir. Plaka kolonlarındaki PEG 8000 (%6-11) konsantrasyonuna ve plaka sıralarına spermin (2-8 mM) konsantrasyonuna göre değişir. Her küme için tampon pH'larını (pH 7.6, 7.8 ve 8.0) değiştirin.
  7. Tüpleri ve girdabı en az 10 saniye kuvvetli bir şekilde kapla. Kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjtüpleri. Etiketli her rezervuarda 500 μL tamponlu çözelti dağıtin.
  8. Bir P-10 mikropipette kullanın ve her oturma damlası başına 15 mg mL-1'de 5 μL protein çözeltisi dağıtın. Kabarcıklardan kaçının. Protein düşüşüne her bir muhabir rezervuar çözeltisinin 5 μL'sini ekleyin. Karıştırma sırasında kabarcıklardan kaçının ve karışımı homojenize etmek için yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
  9. Plakayı şeffaf yapışkan bir bantla bantlayın ve plakayı 25 °C'de saklayın. Kristaller 2-5 gün içinde ortaya çıkar ve iki hafta içinde tam boyutlarına büyür.

4. X-ışını kırınım veri toplama ve α2β2StTS karmaşık yapı çözümü

NOT: X-ışını kırınım verisi toplamadan önce, her kristal için önceden kriyoprotektan çözeltisi hazırlayın. Çözeltide (%10, 20 ve%30 v/v) ve spesifik ligand (lar) artan d imetil sülfit konsantrasyonları içeren 3 aliquots hazırlamak için özel rezervuar çözeltisini kullanın. Dimetil sülfooksitin gliserol, etilen glikol ve PEG 200-300'den daha iyi bir kriyoprotektant olduğu bulunmuştur.

  1. Stereoskopik mikroskop altında bir kriyoloop kullanarak büyük bir tek kristal hasat edin.
  2. Pipet 2 μL her kriyoprotektant çözeltisi içeren çökeltme çözeltisi artı dimetil sülfit ve ligand (lar) daha yüksek konsantrasyonlarda yeni bir kapak kaydırağı üzerine.
  3. Sırayla, crystal'ı her damlaya batırın ve kristalin kriyoprotektant çözeltisinde 30 sn boyunca dengede bekletin.
  4. Kriyoprotekslenmiş kristali -173 °C'de (100 K) gazlı bir azot akışı kullanarak flaş soğutma veya paklarda uzun süreli depolama için sıvı nitrojene daldırma.
    NOT: Bir köpüğü Sıvı nitrojenle doldurun, bir kristal pakı önceden soğutun, kristalleri kriyojenik depolama Dewar'da saklayın ve kristalleri kuru bir gönderici kullanarak senkrotrona sevk edin.
  5. -173 °C'de X-ışını kırınım verisi toplama işlemine devamedin. 0,5-4,0 s pozlama süresi ve 0,5° salınımlar kullanarak X-ışını kırınım verilerini kaydedin. Kristali 180-360° döndürün.
  6. Uygun alan grubunda yansıma dosyası oluşturmak için X-ışını kırınım görüntülerini iMosflm27 ile işleyin. Genellikle, α2β2StTS kristalleri C 121 (C2) uzay grubuna aittir.
  7. CCP4 paketi29'dauygulanan Scala28ile yansımaların birden fazla gözlemini birlikte ölçeklendirin.
  8. MolRep30 ve uygunbir arama modeli kullanarak moleküler değiştirme ile yüksek çözünürlüklü α 2 β2StTS kompleksinin yapısını çözün. Başarılı bir yapı çözümünden sonra Coot31'deki modeli ve elektron yoğunluk haritasını inceleyin.
    NOT: Protein Veri Bankası'nda farklı ligand (lar) ile yatırılan birçok TS kristal yapısı vardır. Daha iyi bir moleküler değiştirme adımı ve daha yeni kristal yapıya sığan zamanın azalması için, ilgi çekici ligand (lar) içeren en iyi arama modelini kullanın. CCP429, 30veya Phenix31'dekristal yapı iyileştirmesi ile devam edin.
  9. Coot32kullanarak modelde manuel ayarlamalar yapın, ardından Refmac29,33 veya phenix.refine 31,34ile otomatik olarak iyileştirme yapın. Coot32'de model oluşturma ve otomatik iyileştirmenin yinelemeli turlarını çalıştırarak son modeli oluşturun ve iyileştirin.
  10. Protein Veri Bankası web sitesinde koordinat ve yapı faktörleri biriktirmeye devam edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Triptofan sintazının αve β-alt birliğinin arındırılması
Modifiye pET SUMO vektörüne Salmonella tiphimurium triptofan sintazının α -altbölümü(αStTS) ve β-alt bölümü(β StTS) alt kavunludur. Şekil 1A, His6-SUMO-αStTS (lane αON) ve His6-SUMO-βStTS (lane βON) füzyon proteinine karşılık gelen iki güçlü bandın temsili SDS-PAGE sonuçlarını göstermektedir. Bu çalışmada açıklanan arınma protokolü, her iki alt birinin de 2 gün içinde tek tek arındırılmasına izin sağladı. İlk gün her proteini Ni-NTA benzeşim kromatografisi, amonyum sülfat çökeltme ve ardından His-SUMO etiket bölünmesi, His-SUMO etiket izlerinin uzaklaştırılması ve protein konsantrasyonu ile arındırmak için kullanıldı. Şekil 1B ve 1C, sırasıyla α-alt birliğinin ve β-alt birliğinin temsili SDS-PAGE sonuçlarını gösterir. İkinci gün, konsantre α-alt birliği, β-alt birliği ve α α2β2StTS kompleksi ve β alt biraları bir boyut dışlama kromatografi sütununa yüklendi. Şekil 1D, S-200 HR boyutu hariç tutma sütununda αStTS, βStTS ve α2β2StTS kompleksinin tipik bir elution profilini gösterir. Şekil 1E, toplanan tepe kesirlerinin temsili bir SDS-PAGE sonucunu gösterir. Protein kristalizasyon çalışmaları için en saf tepe fraksiyonları birikmiş, konsantre edilmiş veα 2β2StTS kompleksi kullanılmıştır.

Vahşi tip ve mutantın saflaştırılması 2 β2StTS kompleksi α
α 2 β2S. typhimurium triptofan sinthaz kompleksinin vahşi tipini ve mutant formunu arındırmak için bir başka hızlı ve verimli protokol bu çalışmada açıklanmıştır. Şekil 2, αiçin vahşi tip çevirisel kavrama geni (trpA ve trpB) kodlamasını içeren pEBA-10 yapının bir temsilini göstermektedir - ve β-alt biralar22. α 2 β2StTS kompleksinin mutant formlarını oluşturmak içiniki adımlı PCR mutajensis protokolü Şekil 3'tetasvir edilir.

pEBA10'dakimutantα2β 2StTS kompleksinin kodlama bölgeleri DNA dizilimi ile doğrulandı ve E. coli strain CB149 hücrelerini dönüştürmek için kullanıldı26. α2β2StTS kompleksinin yabani tipi ve mutant formu aşırı ifade edildi ve rekombinant proteinler 1-2 gün içinde başarıyla saflaştırılmıştır. Oda sıcaklığındaki amonyum sülfat fraksiyonasyonu, kirletici proteinlerin çoğunu heterolog ekspresyon sistemindenkolayca çıkardı (Şekil 4A, şeritler 20P, 30P ve 40S). Şekil 4B'deHiPrep16/60Sephacryl S-200 HR boyutu dışlama kromatografi sütununda α2β 2StTS (143,06 kDa) kompleksinin bağıl elüasyon pozisyonuna sahip temsili bir elüasyon profili gösterilmiştir. Dışlanan tepe kesirlerinin saflığı, havuza almadan önce analiz edilen SDS-PAGE idi (Şekil 4C).

Vahşi tip ve mutant α optimizasyonu2β2triptofan synthase kompleks kristalizasyon
2 β2StTScomplex at 15 mg ml-1'deyabani tipte aliquots ve mutant α 24 kuyulu oturma damla plakaları kurmak için kullanıldı. Tipik olarak, 5 μL protein çözeltisi ve eşdeğer rezervuar çözeltisi hacminden oluşan damlacıklar 500 μL rezervuar çözeltisi ile dengelenmiştir (Şekil 5). Spermin vahşi tip ve mutant kristalize etmek için gereklidir α2β2StTS kompleksi22. Vahşi tipi kristalize etmek için spermin son konsantrasyonu 2 mM iken, bu çalışmada mutant kompleksini kristalize etmek için spermin konsantrasyonunun biraz daha yüksek olduğunu göstermiştir (4-8 mM).

Peg 8000 (%6-11) ve bicine tampon pH'ı değişen ince bir kristalizasyon optimizasyonu ile büyük tek kristaller elde edildi. Farklı morfolojilere sahip kristaller 2-5 gün içinde ortaya çıktı ve kristaller iki hafta içinde tam boyuta büyüdü(Şekil 6). X-ışını kırınım verisi toplanması öncesinde kristaller kriyoprotektan çözeltiye (%30'a kadar dimetil sülfit içeren rezervuar tamponu) batırılmıştır. Optimize edilmiş proses, neredeyse atomik çözünürlükte X-ışını kırınım ölçümleri için uygun kaliteli kristallerle sonuçlandı.

X-ışını kırınım veri analizi
Bu makalede açıklanan yöntemlerle2β2StTS kompleksi α vahşi tipte bir kristal yapı hazırlanmış ve X-ışını kırınım verileri atom çözünürlüğüne yakın bir hızda toplanmıştır. Kristal, F9 inhibitörü (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Fenil]Sülfonyl}Amino)Etil Dihidrojen Fosfat) ve L-Triptofan içeren kriyoprotektif çözeltiye batırılmıştır.

Gelişmiş Işık Kaynağı'ndaki (Berkeley-CA) SIBYLS senkrotron ışın hattı 12.3.1'de kristal 360° 0.5° artışla döndürülerek eksiksiz bir X-ışını kırınım veri seti toplandı. X-ışını kırınım yoğunlukları işlenmiş ve veri toplama istatistikleri Tablo 1'deözetlenmiştir. Simetri analizi, kristalin monoklinik uzay grubu C2'ye ait olduğunu gösterir. Birim hücre parametreleri a = 182.55, b = 59.30, c = 67.37Å, α = 90.00, β = 94.82, γ = 90.00° 'dir. Matthews katsayısının hesaplanan değeri (Vm = 2.57ş3 Da-1),kristalin asimetrik ünitesinde% 52.0835,36çözücü içeriğine sahip bir TS heterodimer molekülünün (αβ StTS) varlığını göstermektedir. Tüm X-ışını verileri kırınım kalitesini artırmak ve radyasyon çürümesini azaltmak için düşük sıcaklıklarda (100 K) toplanmıştır. Kompleksteki α2β2StTS kristal yapısı, α yerindeki F9 inhibitörü ve metal koordinasyon sahasındaki sezyum iyonu ile kompleks olarak vahşi tip αβ StTS modeli kullanılarak moleküler replasman yöntemi ile çözüldü (PDB ID kodu: 4HT3). Son koordinat dosyası ve yapı faktörleri, katılım kodu 5CGQ (Şekil 7A) ile PDB'ye yatırıldı. Vahşi türün kristal yapısı, α-site enziminde F9 inhibitörü ile 2β2StTS kompleksi α (Şekil 7B),metal koordinasyon yerinde sezyum iyonu ( Şekil7C), kofaktör piridoksial 1. βLys87'ye (Şekil 7D)kurcalanarak bağlanmış 5'-fosfat ve enzim β-sitedeki L-triptofan ürünü (Şekil 7E) 1.18 Angstrom çözünürlükte çözüldü. Model 5CGQ, PDB α de bugüne kadar biriktirilen2β2StTS kristal yapısından en yüksek çözünürlüktür.

Figure 1
Şekil 1: α ve β alt birliğinin ve α2β2StTS kompleksinin saflaştırılması. (A) Rekombinant protein ekspresyant. 30 °C'de IPTG indüksiyonu (α/β0 öncesi IPTG indüksiyonu) sonrası SUMO-α St TS (αON) ve SUMO-βStTS (βON) gecelik ekspresyon profilinin %12 SDS-PAGE jeli. (B, C) Ni-NTA benzeşim kromatografisi ve ardından amonyum sülfat çökeltme (%60 doygunluk), (S) arıtılmış ham ekstrakt (FT1) Ni-NTA sütun geçişi örnek (W) sütun yıkama numunesi (E) elüat örneği (60S) ve (60P) yüksek hızlı santrifüjlemeden sonra süpernatant ve çökeltme fraksiyonları, sırasıyla (D) SUMO-proteaz sindirim ürünü (FT2) Ni-NTAsütunu, Etiketsizα St TS veya βStTS alt birliğini içeren numuneden geçer. (D)α StTS alt birliğini (28,67 kDa), βStTS alt birliğini (42,86 kDa) ve HiPrep16/60Sephacryl S-200 HR boyutu dışlama kromatografi sütununa sahip α2β 2StTS kompleksinin (143,06 kDa) elüasyon profili. Her çalıştırma ayrı ayrı gerçekleştirildi. (E) Her bir kromatografiden dışlanan tepe fraksiyonlarının SDS-PAGE jelleri. %15 SDS-PAGE jelleri2β2StTS kompleksi ve αStTS alt birimi α analiz etmek için hazırlanırken,stTS alt birimi β analiz etmek için %12 SDS-PAGE jel hazırlandı. Lane MW, kDa'daki moleküler ağırlık işaretleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yapı pEBA-10'un gösterimi. (A) Salmonella enterica serovar typhimurium bakterisinden triptofan sintazının αve β-alt birliğini kodlayan vahşi tip çevirisel kavrama geninin (trpA ve trpB) temsili (Yang, Ahmed vd. 1996). (B) Vektör bir ampisilin direnci (amp) geni, bir replikasyon orijini (ori), IPTG indükleyicisi yokluğunda bir lac promotörü daha iyi kapatmak için bir lacIq geni ve LacI baskılı promotöriçerir.

Figure 3
Şekil 3: İki aşamalı PCR mutajensis protokolünün genel gösterimi. pEBA-10 vektörü DNA şablonu olarak kullanıldı. PCR'nin ilk turu, ikinci parçayı oluşturmak için ilk parçayı ve Astarları TS-Rev-SacI ve MUT-FW'yi (mutasyon içeren bir ileri astar) oluşturmak için TS-FW-NcoI ve MUT-REV (mutasyon içeren bir ters astar) astarları ile hazırlandı. Parçalar jel saflaştırılmış ve eşitlikçi bir şekilde birleştirilmiş, ısı denatüre edilmiş ve tavlanmış. Rekombinant iplikçikler polimeraz ve deoksiribonükleotidlerle uzatıldı. PCR'ın ikinci turu TS-FW-NcoI ve TS-Rev-SacI astarları ile hazırlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: α2β2StTS kompleksinin vahşi tipve mutant formunun saflaştırılması. (A) Oda sıcaklığında% 20, 30, 40 ve% 50 amonyum sülfat doygunluğu kullanılarak amonyum sülfat yağışı boyunca toplanan örneklerin% 12 SDS-PAGE jeli: (CE) ham özü (S) ve (P) yüksek hızlı santrifüjlemeden sonra fraksiyonları hızlandırır. (B) HiPrep16/60SephacrylS-200HR boyutu dışlama kromatografi sütunu ile α 2 β 2StTS (143.06 kDa) kompleksinin elution profili. (C) Hariç tutulan tepe fraksiyonlarının%12 SDS-PAGE jel resmi . Lane MW, kDa'daki moleküler ağırlık belirteçleri (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: α 2 β2StTS kompleksinin vahşi tipi ve mutant formu için kristalizasyon optimizasyonu. Kristaller 50 mM CsCl2içeren 50 mM Bicine-CsOH tamponunda yetiştirildi. Polietilen glikol 8000 (%6-11) ve spermin (2-8 mM) konsantrasyonu, X-ışını protein kristalografisi ile yapısal çalışmalar yapmak için tek büyük kristal formları elde etmek için çeşitlidir. (A) Bicine-CsOH, pH 7.6. (B) Bicine-CsOH, pH 7.8. (C) Bicine-CsOH, pH 8.0. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: vahşi tip ve mutant formundaki kristallerin fotomikrografı α2β2StTS kompleksi. Kristaller morfolojide farklılık gösterir, ancak C2 uzay grubuna aittir. Kristaller iki hafta sonra son koşullarda tam boyutlarına büyüdü. Yaklaşık 0,20 x 0,15 x 0,10 mm boyutlarında kristaller. (A-D) PLP holo-kristaller, vahşi tip formunun metal koordinasyon yerinde sezyum iyon ile karmaşıktır (sütun A), mutant form α2β2 βQ114A (sütun B), α2β2 βK167T (sütun C) ve α2β2 βS377A (sütun D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Kristal yapının genel görselleştirilmesi ve kristal yapı iyileştirmesi sonrasında elde edilen elektron yoğunluk haritalarının doğrulanması. (A) vahşi tipte kristal yapısı α2β2StTS kompleksi inhibitör F9 enzim α-site (sarı renkli), metal koordinasyon yerinde sezyum iyon (mavi renkli), kofaktör pyridox βLys87'ye (yeşil renkli) bağlı 5'-fosfat kovalan ve enzimdeki L-triptofan ürünü 1.18 Angstrom çözünürlükte β-site (siyan renkli). α-alt biri açık mavi renkte, β alt birliği somon rengindedir. (B-E) Elektron yoğunluk haritaları 1.0 r.m.s. seviyesinde konturlanmıştır (B) inhibitör F9 (C) sezyum iyon (D) piridoksial-5′-fosfat ve (E) L-Triptofan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Veri toplama ve işleme
X-ray kaynağı / Işın hattı ALS Kiriş Hattı 12.3.1
Dalga Boyu (Å) 10,000
Çözünürlük (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Toplam yansıma sayısı 2151280 (252941)
Toplam sayı benzersiz yansımaları 231646 (32187)
Dizin oluşturma, ölçeklendirme ve birleştirme için alan grubu C 1 2 1
Hücre boyutları
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mozaiklik 0.61
Matthews birim VM (ş3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
<Σ(I)> 14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Tamlık (%) 98.6 (94.2)
Multiplicity 9.3 (7.9)
İyileştirme istatistikleri
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
RMSD tahvil uzunluğu (Å) 0.0120
RMSD bağ açısı (°) 14,059
Ramachandran tercih edildi 515 (96.44%)
Ramachandran izin 16 (3.00%)
Ramachandran'a izin verilmedi 3 (0.56%)

Tablo 1: Veri toplama ve işleme. Parantez içindeki değerler dış kabuk içindir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yapı fonksiyonu korelasyon çalışmaları için2β 2 βQ114A,2 β2 βK167Tα ve2 α β2βS377A StTS kompleksleri α mutant formunu başarıyla tasarladık. Başlangıçta, mutantları daha önceki bir saflaştırma protokolü22kullanarak arındırmaya çalıştık , bu da α2β2StTS karmaşık kristalizasyonu PEG 8000 ve spermin ile saflaştırma sırasında gerektirir. Kristalleşme hızı mutant formuna ve çözeltideki kompleksin konsantrasyonuna bağlı olsa da, kristallerin büyük bir çözelti hacminde ne zaman ortaya çıktığını tahmin etmek zor. Kristalizasyon uzun sürelerden sonra (48-96 h) veya kristalizasyon başlatma15'densonra ekstra miktarda PEG 8000 eklenmesi gerekli olabilir.

Ne yazık ki, bu çalışmada sunulan α2β2StTS kompleksinin mutant formları, protokolün ilk adımları sırasında kristalleşmeyi başaramadıkları ve kristalografik çalışmaları bozduğu için bu protokol kullanılarak başarıyla saflaştırılmamıştır. Bu nedenle, α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formunun yüksek verimini veren amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisinden oluşan basit ve verimli bir saflaştırma protokolü oluşturduk. Bu protokol daha hızlıdır (1-2 gün) ve önceki protokolle karşılaştırıldığında tekrarlanabilir (5-7 gün)15,22, çünkü saflaştırma sırasında kristalizasyon gereksinimleri ve protokol sorun giderme yoktur. Buna ek olarak, α-alt birim, β-alt birim ve yeniden oluşturma α2β2StTS kompleksinin yüksek miktarlarını yalıtıcılardan arındırmak için yeni ifade yapıları ve protokolleri oluşturduk.

Gelecekteki uygulama, fonksiyonel ve yapısal çalışmalar yapmak için vahşi tip ve mutant alt ünitelerinin rekombinasyonunu içerir. Mutantα 2β2 βQ114A, α2β2 βK167T ve α2β2 βS377A kompleksi, vahşi tip formuyla (2 mM) karşılaştırıldığında daha yüksek spermin konsantrasyonları (4-8 mM) içeren koşullarda kristalize edildi. Bu nedenle, çökeltilerin ve tampon pH konsantrasyonunun değişkenliğini değiştirerek protein kristallerinin kalitesini artırmaya zaman ayırmaya değer. Tek büyük kristal formlar rastgele bicine tamponlu çözeltide (pH 7.6-8.0) %6-11 PEG 8.000 içeren büyüdü. Bu çalışmada açıklanan yöntemler, α ve β aktif sahalar içinde farklı ligandlara sahip α2β2 kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarındaki kristal yapıları hazırlamak, indole ve serinin triptofana dönüştürülmesinde rol oynayan farklı ara ve geçiş durumlarını taklit etmek için kullanılacaktır. Bu mutantların kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde anahtar kalıntıların oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak ve beyan edecek hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM097569) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Tags

Biyokimya Sayı 163 Triptofan sintaz rekombinant protein mutant protein protein ekspresyonu protein saflaştırma amonyum sülfat çökeltme boyut dışlama kromatografisi protein kristalizasyonu
PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L.… More

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L. J., Dunn, M. F. PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase. J. Vis. Exp. (163), e61839, doi:10.3791/61839 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter