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Methodenartikel

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

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DOI:

10.3791/61855

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3. November 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Zusammenfassung

B-Zellen sind Lymphozyten, die aus hämatopoetischen Stammzellen gewonnen werden und ein wichtiger Bestandteil des humoralen Arms des adaptiven Immunsystems sind. Sie machen attraktive Kandidaten für zellbasierte Therapien wegen ihrer einfachen Isolation von peripherem Blut, ihrer Fähigkeit, sich in vitro auszudehnen, und ihrer Langlebigkeit in vivo. Darüber hinaus kann ihre normale biologische Funktion – zur Produktion großer Mengen von Antikörpern – genutzt werden, um sehr große Mengen eines therapeutischen Proteins auszudrücken, wie z. B. einen rekombinanten Antikörper zur Bekämpfung von Infektionen oder ein Enzym zur Behandlung von Enzymopathien. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Isolierung primärer menschlicher B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und zur Aktivierung/Erweiterung isolierter B-Zellen in vitro. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems für standortspezifische KO endogene Gene in B-Zellen. Diese Methode ermöglicht effizienteko verschiedener Gene, die verwendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen von Interesse zu studieren. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems zusammen mit einem rekombinanten, adeno-assoziierten, viralen (rAAV) Vektor für eine effiziente standortspezifische Integration einer transgenen Expressionskassette in B-Zellen. Zusammen bietet dieses Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Engineering-Plattform, die in primären menschlichen B-Zellen verwendet werden kann, um biologische Funktionen von Genen sowie für die Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zu untersuchen.

Einleitung

B-Zellen sind eine Untergruppe der Lymphozytenlinie, die aus hämatopoetischen Stammzellen abgeleitet wird. Sie spielen eine entscheidende Rolle im adaptiven humoralen Immunsystem, indem sie große Mengen an Antikörpern als Reaktion auf Immunherausforderungen produzieren1. B-Zellen sind auch Vorläufer von Gedächtnis-B-Zellen und den endlos differenzierten, langlebigen Plasmazellen und bieten so eine dauerhafte humorale Immunität2. Insbesondere Plasmazellen sind einzigartig unter Immunzellen in ihrer Fähigkeit, große Mengen eines bestimmten Antikörpers zu produzieren, während sie über Jahre oder Jahrzehnte überleben3. Darüber hinaus macht die einfache Isolierung von peripherem Blut die B-Zell-Linie zu einem ausgezeichneten Kandidaten für neuartige zellbasierte Therapien4.

Bisher wurden zufällige Integrationsmethoden, wie z. B. mit lentiviralen Vektoren oder einem Sleeping Beauty-Transposon, verwendet, um B-Zellen für die Transgenabgabe und Expression5,6,7,8zu entwickeln. Die Unspezifische Natur dieser Ansätze erschwert jedoch die Untersuchung der biologischen Funktionen eines bestimmten Gens in den B-Zellen und birgt ein inhärentes Risiko einer Insertionsmutagenese und einer variablen Transgenexpression und/oder Silencing in der therapeutischen Umgebung.

Das CRISPR/Cas9-System ist ein leistungsfähiges Genom-Engineering-Tool, mit dem Forscher das Genom verschiedener Zellen in zahlreichen Arten präzise bearbeiten können. Kürzlich haben zwei Gruppen, darunter unsere eigene, erfolgreich Methoden zur Ex-vivo-Expansion und gezielte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen9,10entwickelt. Wir werden den Prozess der Reinigung primärer menschlicher B-Zellen aus einer Leukaphoreseprobe beschreiben. Danach beschreiben wir unser aktualisiertes Protokoll zur B-Zell-Erweiterung und Aktivierung isolierter B-Zellen. Wir beschreiben dann ein Verfahren zum Ausklopfen des Differenzierungsclusters 19 (CD19), eines spezifischen B-Zell-Rezeptors und eines Kennzeichens von B-Zellen, durch Elektroporation, um CRISPR/Cas9 mRNA zusammen mit CD19 sgRNA in aktivierte B-Zellen einzuführen.

Cas9 mRNA wird übersetzt und bindet an die CD19 sgRNA zu einem CRISPR/Cas9-sgRNA Ribonukleoprotein-Komplex (RNP). Anschließend führt sgRNA im Komplex Cas9 zu Doppelstrangbruch (DSB) an der Zielsequenz auf Exon 2 des Gens. Die Zellen reparieren das DSB durch "nicht-homologe Endverbindung" durch Die Einführung oder Löschung von Nukleotiden, was zu Frameshift-Mutationen führt und dazu führt, dass das Gen ausgeschlagen wird. Wir messen dann den Verlust von CD19 durch Strömungszytometrie und analysieren die Indelbildung, indem wir Indels durch Zersetzungsanalyse (TIDE) verfolgen.

Wir beschreiben dann den Prozess der Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit einem rekombinanten AAV6-Vektor (rAAV6, eine Spendervorlage für homologiegesteuerte Reparatur (HDR)), um die standortspezifische Einfügung von verbessertem grünem Fluoreszenzprotein(EGFP) an der adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) zu vermitteln. Das AAVS1-Gen ist ein aktiver Ort ohne bekannte biologische Funktionen und eine AAV-Virusintegrationsstelle im menschlichen Genom; Daher gilt es als "sicherer Hafen" für die Genomtechnik. Hier berichten wir, dass die Erweiterung und Aktivierung von B-Zellen eine bis zu 44-fache Expansion in 7 Tagen Kultur ermöglichte (Abbildung 1). Die Elektroporation von B-Zellen zeigte eine leichte Reduktion der allgemeinen Zellgesundheit (Abbildung 2A) bei 24 h nach der Transfektion. Die Streudiagrammanalyse des CD19-Markers (Abbildung 2B) zeigte eine Reduktion der bearbeiteten Zellen um bis zu 83 % (Abbildung 2C).

Die TIDE-Analyse der Chromatographen (Abbildung 3A) ergab, dass die % indels dem % Proteinverlust durch Durchflusszytometrie ähnelten (Abbildung 3B). Die Durchflusszytometrie-Analyse des KI-Experiments zeigte, dass die Zellen, die den AAV-Vektor erhielten (Abbildung 4), zusammen mit RNP bis zu 64% EGFP-positive Zellen exprimierten (Abbildung 5A) und später eine erfolgreiche Integration durch Junction-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigten (Abbildung 5B). Die Anzahl der Zellen zeigte, dass sich alle Proben innerhalb von 3 Tagen nach dem Engineering schnell erholten (Abbildung 5C).

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Protokoll

Leukapherese-Proben von gesunden Spendern wurden von einer lokalen Blutbank erhalten. Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Review Board (IRB) für die Forschung freigestellt und vom Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Minnesota genehmigt.

HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der universellen Vorsichtsmaßnahme für blutübertragene Krankheitserreger, mit sterilen/aseptischen Techniken und ordnungsgemäßen Geräten der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.

1. Vorbereiten von Ergänzungen für B-Zell-Erweiterungsmedium

  1. CpG-Oligonukleotid auf eine Konzentration von 1 mg/ml rekonstituieren.
  2. CD40-Ligand (CD40L) auf eine Konzentration von 100 g/ml rekonstituieren.
  3. Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-10 (rhIL-10) auf eine Konzentration von 50 g/ml.
  4. Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-15 (rhIL-15) auf eine Konzentration von 10 g/ml.
    HINWEIS: Bewahren Sie jeden Zuschlag in kleinen Aliquots bei -20 °C bis -80 °C für bis zu 6 Monate auf.

2. Vorbereiten von Basalmedium

  1. Kombinieren Sie B-Zell-Basalmedium mit 5% (v/v) Medienergänzung für in vitro Immunzellexpansion (z. B. CTS Immune Cell SR) und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin.
  2. Filtern Sie das Basalmedium mit einem 0,22 m Filteradapter in eine sterilisierte Flasche.
  3. Halten Sie das Basalmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C.

3. Vorbereiten von B-Zell-Erweiterungsmedium

  1. Übertragen Sie die benötigte Menge des Basalmediums in einen sterilen Behälter, um die B-Zellen bei 5 × 105 Zellen/ml zu kultitoren.
  2. Ergänzen Sie das Basalmedium mit 1 g/ml CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 und 10 ng/mL rhIL-15.
  3. Filtern Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium mit einem 0,22-mm-Filter.
  4. Gleichgewichten Sie das B-Zell-Expansionsmedium im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 mit Feuchtigkeit für mindestens 30 min vor Gebrauch.
    HINWEIS: Bereiten Sie frischeS B-Zell-Erweiterungsmedium für einen Tag vor. Bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium nicht für mehrere Tage vor. Dieses Medienrezept fördert die Proliferation von Speicher-B-Zellen und aktivierten primären menschlichen B-Zellen.

4. Menschliche B-Zell-Reinigung und -Erweiterung

HINWEIS: Fügen Sie 99–100 % Isopropylalkohol nach Anweisung des Herstellers in einen temperaturgeregelten Gefrierbehälter ein, und kühlen Sie den Gefrierbehälter bei 4 °C, bevor Sie Schritt 4.1 starten.

  1. ISolieren von PBMCs aus einer Leukaphoreseprobe
    1. Eine Leukaphoreseprobe (ca. 8–10 ml) in ein steriles 50 ml konisches Rohr übertragen.
    2. Erhöhen Sie das Volumen auf 35 ml mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
    3. Eine 35 ml Leukaphoreseprobe vorsichtig auf 15 ml Dichtegradientenmedium schichten.
    4. Zentrifuge bei 500 × g für 25 min ohne Bremse, entfernen Sie die Plasmaschicht, ohne die Buffy-Schicht (PBMC-Schicht) zu stören, sammeln Sie die PBMCs von der Schnittstelle und übertragen Sie auf ein neues steriles 50 ml konisches Rohr.
    5. Bringen Sie die PBMCs mit 1x PBS auf 50 ml hoch.
    6. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min ohne Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das PBMC-Pellet zu stören, das rot erscheinen kann.
    7. 7 ml Ammonium-Chlorid-Kalium-Lyse-Puffer hinzufügen, Pipette 3 Mal gut mischen und bei Raumtemperatur (RT) 3 min inkubieren.
    8. Erhöhen Sie das Volumen auf 50 ml mit 1x PBS.
    9. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min mit widerstandsarmer Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet sollte rosa oder weiß aussehen.
      HINWEIS: Um die frisch isolierten B-Zellen weiter zu kultivieren, bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium vor, bevor Sie mit der B-Zell-Isolierung beginnen (Schritt 4.2).
  2. B-Zell-Isolierung von PBMCs mit humanen primären B-Zell-Negativ-Isolationskit
    1. PBMCs im Isolationspuffer auf eine Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml aussetzen.
      HINWEIS: Wenn die Gesamtzahl der PBMCs kleiner als 5 × 107 Zellen ist, skalieren Sie das Volumen des Isolationspuffers, um 5 × 107 Zellen/ml beizubehalten. Das Mindest- bzw. Höchstvolumen der Zellsuspension beträgt 0,25 ml bzw. 8 ml.
    2. Bis zu 8 ml (5 × 107 Zellen/ml) in ein steriles, Polypropylen- und Rundbodenrohr mit Kappe geben.
    3. Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Cocktail Enhancer hinzu.
    4. Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Isolation Cocktail hinzu, verkappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2–3 Mal, um sie zu mischen.
    5. Inkubieren bei RT für 5 min; in der4. Minute der Inkubation, Wirbel magnetische Mikroperlen für mindestens 30 s.
    6. Übertragen Sie 50 l magnetische Mikroperlen pro 1 ml PBMCs, kappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2-3 Mal, um sie zu mischen.
    7. Auf- bis zu 10 ml mit Isolationspuffer auf- und sanft pipette auf und ab 2-3 mal auf- und abladen.
    8. Legen Sie das Rohr in eine Magnetstation und inkubieren Sie bei RT für 3 min.
    9. Halten Sie den Magneten und das Rohr zusammen und in einer Bewegung den Magneten und das Rohr zusammen, um die Zellsuspension in das neue Rohr zu gießen. Entsorgen Sie die alte Röhre.
    10. Wiederholen Sie Schritt 4.2.8 (reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2 min) und gießen Sie die B-Zellsuspension in ein sauberes konisches Rohr.
    11. Die angereicherten B-Zellen sind einsatzbereit. Wenn Zellen sofort verwendet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.3 (Menschliche B-Zell-Erweiterung) fort. Überprüfen Sie die Reinheit der isolierten B-Zellen durch Durchflusszytometrie (optional). Wenn Zellen vor der Verwendung eingefroren werden sollen, fahren Sie mit Schritt 4.2.12 fort.
    12. Um die B-Zellen einzufrieren, Zentrifuge bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
    13. Setzen Sie die Zellen im Gefriermedium bei 107 Zellen/ml und aliquot 1 ml/kryovial aus.
    14. Den Kryovial in den gekühlten Gefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C lagern; dann übertragen Sie die gefrorene kryovial in einen flüssigen Stickstofftank; gefroreneNZellen bis zu 1 Jahr aufbewahren.
      HINWEIS: Die erwartete Ausbeute isolierter B-Zellen beträgt 2 % –8 % der gesamten PBMCs mit einer Lebensfähigkeit von 95 % bis 99 %.
  3. Menschliche B-Zell-Erweiterung
    HINWEIS: Wenn Sie frisch isolierte B-Zellen verwenden, überspringen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.5. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles konisches Rohr und fahren Sie mit Schritt 4.3.6 fort.
    1. Vorwarmes fetales Rinderserum (FBS) in einem Wasserbad vor dem Auftauen der B-Zellen. 20 ml B-Zell-Expansionsmedium vorbereiten, vor Gebrauch mindestens 15 min in einen T25-Kolben übertragen und das Medium in einem Gewebekultur-Inkubator (bei 37 °C, 5%CO2, mit Feuchtigkeit) voraussetzen.
    2. B-Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Während des Wartens 2 ml vorgewärmter FBS in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen.
    3. Nachdem die B-Zellen vollständig aufgetaut sind, fügen Sie sofort 1 ml vorgewärmtes FBS tropfenweise in die Probe ein. Bei RT für 1 min inkubieren.
    4. Sanfte Pipette, um die Probe wieder auszusetzen und das gesamte Volumen tropfenweise in ein konisches Rohr mit 2 ml vorgewärmtem FBS zu übertragen.
    5. Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS, Kappe, und invertieren Sie das Rohr vorsichtig 2-3 mal.
    6. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.
    7. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, setzen Sie das Zellpellet mit 1 ml vorädlibriertem B-Zell-Expansionsmedium wieder auf und zählen Sie die Zellen. Die Gesamtzellenzahl sollte etwa 107 Zellen betragen.
    8. Übertragen Sie die Zellen in einen Kolben, der 20 ml des vorädlibierten B-Zell-Ausdehnungsmediums enthält. Die Endkonzentration der Zellen sollte etwa 5 x 105 Zellen/ml betragen.
    9. Inkubieren Sie den Kolben vertikal in einem Gewebekultur-Inkubator.
    10. Erfrischen Sie das Expansionsmedium alle 2 Tage vollständig, indem Sie das gesamte Volumen der B-Zellen in ein steriles Konusrohr übertragen und die Schritte 4.3.6–4.3.9 wiederholen.
      HINWEIS: T25-Kolben kann 10–20 ml Medium aufnehmen; Der T75-Kolben kann bis zu 20–60 ml Medium aufnehmen.

5. Primäres menschliches B-Zell-Engineering

  1. Engineer B-Zellen bei 48 ± 2 h nach Erweiterung/Aktivierung für optimale Ergebnisse. Bereiten Sie das B-Zell-Expansionsmedium, aliquot 1 ml des Mediums in eine 48-Well-Gewebekulturplatte vor und vor dem Einsetzen in einem Gewebekultur-Inkubator vor.
    HINWEIS: Führen Sie beim Entwerfen einer CRISPR/Cas9 sgRNA für ein Gen von Interesse die unten beschriebenen Schritte aus.
    - Entwerfen Sie sgRNAs mit einem Online-Tool11.
    - Design sgRNAs auf einem Exon, das allen Isoformen des Proteins gemeinsam ist.
    - Bestellen Sie chemisch modifizierte sgRNA von seriösen Unternehmen.
    - sgRNA kommt in der Regel in lyophilisierter Form; rekonstituieren sgRNA im sterilen DNase/RNase-freien Tris-EDTA (TE)-Puffer bis zu einer Konzentration von 1 g/l.
  2. Vorbereiten Sie das TRANSfizierungssubstrat CRISPR/Cas9, indem Sie 1 l (1 g/l) chemisch modifizierte sgRNA mit 1,5 l (1 g/l) chemisch modifizierten Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) Nuklease pro Transfektionsreaktion mischen. Verwenden Sie zur Steuerung 1 L TE-Puffer anstelle von sgRNA.
    HINWEIS: Wenn CD19 sgRNA für ein Gen-KO-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 2 für Ergebnisse. Wenn AAVS1 sgRNA für ein Gen-KI-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 5 für Ergebnisse.
    • Halten Sie alle Komponenten auf Eis.
  3. Sanft mischen und 2,5 l CRISPR/Cas9 Transfecting Substrat pro Reaktion in ein Rohr eines 0,2 ml 8-Rohr-Streifens übertragen; bei RT beiseite gelegt werden.
  4. Schalten Sie einen Nukleofektor (Elektroporator) ein und bereiten Sie Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1dargestellt vor.
    HINWEIS: Dies ist ein guter Schritt für eine Pause, falls erforderlich, indem alle Reagenzien auf Eis gelegt werden. Entfernen Sie alle Reagenzien vom Eis, wenn Sie bereit sind, das Experiment fortzusetzen. Bei der Verwendung von S.p. Cas9-Protein MUSS der Prüfer den vorkomplexen CRISPR/Cas9-sgRNA-Ribonucleoprotein durch Mischen von 1 g sgRNA mit 5 g S.p. Cas9-Protein, Vermeidung von Blasen und Inkubation der Mischung bei RT für mindestens 20 min vor dem Einsatz für optimale Ergebnisse.
  5. Zählen und übertragen Sie 106 B Zellen pro Transfektionsreaktion in ein steriles konisches Rohr.
  6. Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Während des Wartens das primäre Zelltransfektionsreagenz (Tabelle 2) vorbereiten und bei RT beiseite stellen.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
  8. Das Zellpellet mit 10 ml sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min wieder aufsetzen.
  9. Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Zellpellet zu stören.
  10. Übertragen Sie 0,5 g chemisch modifizierte GFP mRNA (als Transfektionsreporter) pro 106 B Zellen auf das Zellpellet (optional).
  11. Das Zellpellet mit einem Primärzelltransfektionsreagenz von 20 L pro 106 B-Zellen wieder aufsetzen; 5-6-mal sanft mischen. Übertragen Sie 20,5 l l pro Transfektionsreaktion in das 0,2 ml-Rohr des 8-Rohr-Streifens, der 2,5 l des CRISPR/Cas9-Transfektionssubstrats enthält.
  12. Einmal nach oben und unten pfeifen, um das gesamte Volumen (23 l) zu mischen und in eine Transfektionsküvette zu übertragen. Kappen und tippen Sie vorsichtig auf die Küvette auf der Bank, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den Boden der Küvette bedeckt.
  13. Verwenden Sie menschliches primäres B-Zell-Protokoll auf dem Nukleofektor für die Transfektion.
    HINWEIS: Der Nukleofektor (Elektroporator) kann platziert und außerhalb der Gewebekulturhaube verwendet werden. Kappen Sie die Küvette, um Sterilität zu gewährleisten.
  14. Die elektropolierten Zellen in der Küvette bei RT 15 min ruhen.
  15. Übertragen Sie 80 l des vorädierten B-Zell-Expansionsmediums von der Gewebekulturplatte in die Transfektionsreaktion in der Küvette. Die Küvette 30 min im Inkubator der Gewebekultur unterbringen.
  16. Ein paar Mal sanft Pipette mischen und das gesamte Volumen der Probe von der Küvette in einen geeigneten Brunnen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml des B-Zell-Expansionsmediums übertragen. Die Endkonzentration der Zellen sollte 106 Zellen/ml betragen.
  17. Wenn Sie ein Gen-KI-Experiment durchführen, übertragen Sie den rAAV6-Vektor bei 500.000 Infektionsvielfalt in den entsprechenden Brunnen, der elektroporated Zellen enthält (ca. 45 min nach der Elektroporation). Siehe Beispiel rAAV6 Vektorkonstrukt in Abbildung 4A.
    HINWEIS: Zum Beispiel: Ein Steuermuster wird ohne CRISPR/Cas9 oder den rAAV6-Vektor elektropoiert. Eine reine Vektorprobe wird ohne CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. Eine KI-Probe wird mit CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. rAAV6 muss Homologiearme nach oben und unterhalb des Ziel-DSB-Standorts für HDR enthalten.
  18. Legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 mit Feuchtigkeit.
  19. Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Lebensfähigkeit am tag 1 nach dem Engineering auf.
  20. Erfrischen Sie das B-Zell-Expansionsmedium alle 2 Tage, indem Sie die Zellen zählen und dann das gesamte Volumen der Zellen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen mit 100 l frischem B-Zell-Expansionsmedium aus und übertragen Sie sie auf einen Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Bringen Sie das mittlere Volumen auf, um eine endgültige Zellkonzentration bei 5 × 105 Zellen/ml zu erreichen.
    HINWEIS: Eine 48-Well-Platte kann bis zu 1 ml Medium/Well aufnehmen; eine 24-Well-Platte kann bis zu 2 ml Mittel/Gut aufnehmen; eine 12-Well-Platte kann bis zu 4 ml Mittel/Well aufnehmen, und eine 6-Well-Platte kann bis zu 8 ml Medium/Well aufnehmen.
  21. Erlauben Sie den entwickelten Zellen, sich für mindestens 5 Tage zu erweitern, bevor Sie nachgelagerte Analysen durchführen, z. B. für die Analyse der Durchflusszytometrie, die TIDE-Analyse und die Anschluss-PCR.

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Ergebnisse

Das aktualisierte Erweiterungs- und Aktivierungsprotokoll ermöglichte eine schnelle Expansion von B-Zellen bis zum 44-fachen in 7 Tagen(Abbildung 1; n =3 Spender). Im KO-Experiment zeigte die B-Zellzahl mit Trypan-Blaufärbung mehr als 80% lebensfähige Zellen mit einer leichten Reduktion der Zellrückgewinnung sowohl bei der Kontrolle als auch bei den CD19 KO-Proben bei 24 h Nachelektroporation(Abbildung 2A;p ≥ 0,05, n = 3 Spender). Dieses Ergebnis zeigt, dass die...

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Diskussion

Präzise Genom-Engineering in primären menschlichen B-Zellen war bis vor kurzem eine Herausforderung9,10. Wir hatten zuvor Protokolle veröffentlicht, die CRISPR/Cas9 verwenden, um primäre menschliche B-Zellen9zu entwickeln. Hier skizzieren wir verbesserte Protokolle für B-Zell-Isolation, -Erweiterung und -Engineering, um eine effiziente KO von CD19 oder einKnock-in EGFPzu ermöglichen.

Hier zeigen wir, da...

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Offenlegungen

Es wurde ein Patent über die Methoden der Herstellung und Verwendung genombearbeiteter B-Zellen mit M.J.J,K.L. und B.S.M als Erfinder eingereicht. B.S.M ist Berater für immusoft Inc. Immusoft Inc. Immusoft Inc. hat Forschung im Labor von B.S.M gesponsert.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Children es Cancer Research Fund (CCRF) und NIH R01 AI146009 an B.S.M finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Protein, 500 μgIDT1081059kleinere Größe ist ebenfalls erhältlich
Amaxa P3 Primärzelle 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)LonzaV4XP-3032
Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysing PufferQualität Biologisch118-156-101
CleanCap chemisch modifizierte Cas9 mRNATrilink BiotechnologieL-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mgInvivogenTLRL-2006-5verschiedene Größen verfügbar
Cryostor CS10, 100 mLSTEMCELL Technology7930
CTS Immunzelle SRThermo Fisher ScientificA2596101
EasySep humane B-Zellen IsolationskitSTEMCELL Technology17954
eBioscience fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFlour 780eBiosciences65-0865-14
Excellerate B-Zell-Medien, Xeno-freieR& D SystemsCCM031B-Zell-Basalmedium
Falcon 14 mL Polypropylen-RundbodenröhrchenCorning352059
fötales Rinderserum (FBS)R& D SystemsS11550Nur zum Auftauen von B-Zellen
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Streifen 0,2 mL PCR-Röhrchen mit individuell aufgesetzten DomkappenBioExpressT-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0,0067M PBS (kein Ca, kein Mg) oder 1x PBSGE lifesciencesSH30256.01
Lonza 4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unitLonzaAAF-1002X
Mega CD40 LigandEnzo Life SciencesALX-522-110-C010
Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EAZum Einfrieren
von Zellen Pen/Strep 100XSigma-AldrichTMS-AB2-C
PerCP Anti-Human-CD19-Klon HIB19Biolegend302228kleinere Baugröße ist auch
rAAV6 SA-GFP-Verpackung erhältlich ( mit unserer SA-GFP-Kassette siehe Abbildung 4).Vigene BiosciencesN/AGroßverpackung, 1e13 GC/ml, 500 mL
rekombinantes humanes IL-10-Protein 250 μgR& D Systems217-IL-250verschiedene Größen verfügbar
Rekombinantes humanes IL-15 Protein 25 ugR& D Systems247-ILB-025verschiedene Größen verfügbar
The Big Easy EasySep MagnetSTEMCELL Technology18001verschiedene Größen verfügbar
Tris-EDTA (TE) PufferFisherScientific BP2476100

Referenzen

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  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
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Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9
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