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Herzsphäroide als in vitro bioengineered Herzgewebe zur Untersuchung der menschlichen Herzpathophysiologie

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DOI:

10.3791/61962

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23. Januar 2021

 , 
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, 3D-Herzsphäroide (CSs) zu fabrizieren, indem Zellen in hängenden Tropfen mitgebaut werden. Kollagen-eingebettete CS werden mit Doxorubicin (DOX, einem kardiotoxischen Mittel) in physiologischen Konzentrationen behandelt, um Herzinsuffizienz zu modellieren. In-vitro-Tests mit DOX-behandelten CS können verwendet werden, um neuartige Therapien für Herzinsuffizienz-Patienten zu identifizieren.

Zusammenfassung

Trotz mehrerer Fortschritte in der Herzgewebetechnik bleibt eine der größten Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt, die Erzeugung eines voll funktionsfähigen Gefäßnetzes, das mehrere Komplexitätsstufen umfasst, um Sauerstoff und Nährstoffe in biotechnischen Herzgeweben bereitzustellen. Unser Labor hat ein dreidimensionales In-vitro-Modell des menschlichen Herzens entwickelt, das als "Herzsphäroid" oder "CS" bekannt ist. Dies stellt biochemische, physiologische und pharmakologische Merkmale dar, die typisch für das menschliche Herz sind, und wird durch die Ko-Kultivierung seiner drei Hauptzelltypen, wie Herzmyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten, erzeugt. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs oder iCMs) werden in Einem Verhältnis kokultiviert, das denen entspricht, die in vivo mit menschlichen Herzfibroblasten (HCFs) und menschlichen koronaren Endothelzellen (HCAECs) in hängenden Tropfenkulturplatten für drei bis vier Tage gefunden wurden. Die konfokale Analyse von CSs, die mit Antikörpern gegen Herz Troponin T, CD31 und Vimentin (Marker für Herzmyozyten, Endothelzellen bzw. Fibroblasten) befleckt sind, zeigt, dass CSs ein komplexes Endothelzellnetzwerk darstellen, das dem nativen im menschlichen Herzen ähnelt. Dies wird durch die 3D-Rendering-Analyse dieser konfokalen Bilder bestätigt. CSs enthalten auch extrazelluläre Matrix (ECM) Proteine, die typisch für das menschliche Herz sind, wie Kollagen Typ IV, Laminin und Fibronectin. Schließlich stellen CSs eine kontraktile Aktivität dar, gemessen als synzytiale Kontraktilität, die näher an der für das menschliche Herz typischen ist, verglichen mit CSs, die nur iCMs enthalten. Bei behandlung mit einem kardiotoxischen Krebsmittel, wie Doxorubicin (DOX, zur Behandlung von Leukämie, Lymphom und Brustkrebs), reduziert sich die Lebensfähigkeit von DOX-behandelten CSs bei 10 M genetischer und chemischer Hemmung der endotheliaalen Stickstoffmonoxid-Synthase, einem nachgelagerten Ziel von DOX bei HCFs und HCAECs, signifikant um 10 M genetische und chemische Hemmung der endotheliale Stickstoffmonthetase, ein nachgeschaltetes Ziel von DOX bei HCFs und HCAECs, was seine Toxizität in CS s reduzierte. Angesichts dieser einzigartigen Merkmale werden CSs derzeit als In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Herzbiochemie, Pathophysiologie und Pharmakologie verwendet.

Einleitung

Das menschliche Herz hat eine begrenzte Regenerationskapazität, während Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) trotz der jüngsten Fortschritte in der Gewebetechnik und Stammzelltechnologien die Haupttodesursache weltweit bleiben1. Die Notwendigkeit neuartiger Therapeutika, einschließlich molekularer und zellulärer Ansätze, um entweder ein geschädigtes Herz zu reparieren oder ein Herz am Versagen zu hindern, ist einer der wichtigsten aktuellen klinischen Bedürfnisse für Patienten mitHerzerkrankungen 2,3,4. Das Hauptziel der Herzgewebetechnik ist es, ein dreidimensionales (3D) Herzgewebe herzustellen, das molekulare, zelluläre und extrazelluläre Merkmale aufweist, die typisch für ein menschliches Herz sind, einschließlich seines Gefäßnetzwerks und seiner physiologischen kontraktilen Funktion4,5,6.

Um ein funktionelles menschliches Herzgewebe zu bioengineeringund herzustellen, das das menschliche Herz für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen imitiert, wurden mehrere Ansätze untersucht, darunter technische Herzgewebe (EHTs), Zellblätter und Sphäroidkulturen7,8. Diese Gewebe können jedoch nicht die optimale 3D-Mikroumgebung rekapitulieren, die typisch für das menschliche Herz ist, und ihre mögliche Verwendung für CVD-Patienten kann nicht direkt von der Bank ins Bett übersetzen7. Dies liegt daran, dass sie nicht die komplexe Biologie, Morphologie und Physiologie von in vivo Herzgewebe9rekapitulieren. Eine der größten Herausforderungen in der Herzgewebetechnik ist die Entwicklung eines hierarchischen Gefäßnetzes innerhalb des biotechnischen Herzgewebes, da jedes Gewebe, das größer als 200 m im Durchmesser ist, den Zelltod in der Mitte2,10entwickelt. Ein richtig geformtes Gefäßnetz in einem menschlichen Herzgewebe spielt eine wichtige Rolle für die Versorgung der Herzzellen mit Blut, Sauerstoff und Nährstoffen11. Während der embryonalen Entwicklung bilden sich koronare Kapillaren und Arterien über Vaskulogenese (de novo Blutgefäßbildung) und Angiogenese (Generation von Blutgefäßen aus bereits bestehenden) aus endothelialen Vorläuferzellen8,12. Herzfibroblasten spielen auch eine wichtige Rolle bei der richtigen Vaskulären Netzwerkbildung, indem sie die optimale extrazelluläre Matrix (ECM) und Wachstumszusammensetzung13,14zur Verfügung stellen.

Das 3D-Gefäßnetzwerk aus bioengineered Herzgewebe steuert das Überleben und die Funktion der Zelle, indem sauerstoff- und nährstoffgradienten und parakrine Signalisierung, wie homotypische Zellinteraktion, heterotypische Zellinteraktion, Interaktion von Zellen durch abgesonderte lösliche Proteine und Zelle zu ECM-Wechselwirkungen3,10,15,16,17,18. Dies verhindert den Zelltod in der Mitte des Gewebes und fördert die Zelllebensfähigkeit und physiologische Funktion in biotechnischen Herzgeweben16,18,19.

Sphäroidkulturen aus Stammzellen wurden kürzlich als In-vitro-Modelle des menschlichen Herzens20erforscht. Um die kardiale Mikroumgebung in vitro weiter zu verbessern, haben sie die Verwendung aller wichtigsten Zelltypen im menschlichen Herzen, wie Herzmyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten, aufgenommen. Sphäroidkulturen stellen die erforderliche 3D-Strukturunterstützung für Zellen dar, die wachsen und funktionieren und können verwendet werden, um ein Gefäßnetzwerk zu bioengineering14,20,21,22. In diesem Zusammenhang hat unser Labor menschliche Herzsphäride (CSs) entwickelt, indem es Herzmyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten in Verhältnissen im menschlichen Herzen14trägt. Dieses Modell ist eine Erweiterung des kartotventrikulären Herzzellen-Sphäroidmodells, das durch die Ko-Kultivierung von Herzzellen in hängenden Tropfenkulturen erzeugt wird, die zur Modellierung der Herzfibrose verwendet wird21. Humane CSs können als Toxizitätstests verwendet werden, indem man sie doxorubicin (DOX, ein Anti-Krebs-Mittel zur Behandlung von Leukämie, Lymphom und Brustkrebs) behandelt, das bekanntist, um Herzfibrose und Herzinsuffizienz (HF) auch 17 Jahre nach seiner Somministration14zu induzieren.

In diesem Manuskript beschreiben wir, wie menschliche CSs durch die Ko-Kultivierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs oder iCMs), menschlichen Herzfibroblasten (HCFs) und menschlichen koronaren Endothelzellen (HCAECs) in hängenden Tropfenkulturen erzeugt werden können. Um CSs für In-vitro-Tests zu verwenden und abzubilden, sind sie in ein Kollagengel eingebettet. Die konfokale Analyse von CS, die mit Antikörpern gegen CD31, einem Marker für Endothelzellen, gefärbt sind, zeigte, dass diese Zellen ein Netzwerk bilden, das dem in vivo beobachteten ähnelt. Um HF zu induzieren und möglicherweise neuartige Wirkstoffe zu testen, die es behandeln oder verhindern können, wurden CSs mit 10 M DOX (eine Konzentration im Blutkreislauf von Krebspatienten, die das Medikament erhalten) behandelt. Bei Färbung mit Calcein-AM und Ethidium homodimer (Färbung lebender bzw. abgestorbener Zellen) stellen DOX-behandelte CS eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit im Vergleich zu CSs dar, die das Medikament nicht erhalten haben. CSs stellen auch eine homogene kontraktile Aktivität dar, wenn man feldpotente Stimulation zwischen 1 und 3 Hz verwendet.

Protokoll

HINWEIS: hiPSC-CMs, die für dieses Protokoll verwendet werden, sind im Handel erhältlich. Bitte fordern Sie die Zustimmung der Ethikkommission für die institutionellen Menschen ein, bevor Sie mit dieser Arbeit in Arbeit kommen, falls erforderlich.

1. Menschliche Herz-Fibroblasten und Endothelzellkultur-Beschichtung und Wachstum

  1. Kryovials mit HCFs und HCAECs in einem Wasserbad bei 37 °C für eine Minute auftauen.
  2. Bewegen Sie Kryovials unter einem sterilen laminaren Fluss Biosicherheitskabinett Klasse 2.
  3. Sammeln Sie 1 ml Zellsuspension von den Kryovials mit einer 1000 l Pipette Spitze und fügen Sie in eine 15 ml Rohr mit 7 ml Human Cardiac Fibroblast Medium für HCFs und 7 ml Human Meso Endo Growth Medium für HCAECs.
    HINWEIS: Um die Mehrheit der Zellen aus jedem Kryovial zu sammeln, spülen Sie sie zweimal mit 1 ml Kulturmedium aus dem gleichen 15 ml Rohr.
  4. Mischen Sie zellgefedert sanft.
  5. Übertragen Sie Zellsuspensionen mit einer 10 ml serologischen Pipette in T75-Kulturkolben.
  6. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C mit 5%CO2.
  7. Nach 18 h das Medium aus beiden Kulturkolben ansaugen und einmal mit steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) abspülen, um gefrierende Mittel und abgestorbene Zellen zu entfernen.
  8. PBS mit 7 ml geeignetem Kulturmedium für jeden Kulturkolben ersetzen und bei 37 °C brüten.
  9. Untersuchen Sie regelmäßig die Zellausdehnung und -lebensfähigkeit und ersetzen Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen.

2. iCM-Kulturbeschichtung und Wachstum

  1. Vorlackieren Sie zwei T25-Kulturkolben mit 2 ml PBS, die 40 g/ml Fibronectin (FN) enthalten, und brüten Sie bei 37 °C, 5 %CO2 für mindestens 4 Stunden.
  2. Nach 4 Stunden ein Kryovial mit iCMs sammeln und 4 min in ein Wasserbad bei 37 °C stellen.
  3. Bewegen Sie den Kryovial unter einem sterilen laminaren Fluss Biosicherheitskabinett Klasse 2.
  4. Übertragen Sie die iCMs vorsichtig mit einer 1 ml Pipettenspitze vom Kryovial auf ein steriles 50 ml Zentrifugenrohr.
  5. Spülen Sie die leeren iCMs kryovial mit 1 ml Raumtemperatur-Beschichtungsmedium, um restliche Zellen zurückzugewinnen. Übertragen Sie die 1 ml Beschichtungsmediumspülung von der kryovialen Tropfenweise über 90 Sek. auf das 50 ml Zentrifugenrohr, das die iCM-Zellsuspension enthält.
    HINWEIS: Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig, während Sie das Medium hinzufügen, um die Lösung vollständig zu mischen und den osmotischen Schock auf den aufgetauten Zellen zu verringern.
  6. Fügen Sie dem 50 ml Zentrifugenrohr langsam 8 ml Raumtemperatur-Beschichtungsmedium hinzu. Fügen Sie die ersten 1 ml tropfenweise über 30 - 60 s. Fügen Sie dann das verbleibende Volume über die nächsten 30 s hinzu. Das Zentrifugenrohr vorsichtig wirbeln, während Sie das Beschichtungsmedium hinzufügen. Mischen Sie den Inhalt des 50 ml Zentrifugenrohres vorsichtig, indem Sie 2 - 3 Mal invertieren (vermeidung von kräftigem Schütteln oder Wirbeln).
  7. Führen Sie die Zellzählung sofort mit einem Hämozytometer durch und bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte (in Zellen/ml).
  8. Nehmen Sie die FN-vorbeschichteten T25-Kolben und saugen Sie die FN-PBS-Lösung an, ohne die Kolben trocknen zu lassen. Dazu kommen das Saatvolumen von iCMs (1,6 x 106 lebensfähige iCMs in 8 ml Raumtemperaturbeschichtungsmedium).
  9. Kultur-iCMs im Inkubator für 48 h bei 37 °C, 5%CO2.
  10. Das Wartungsmedium vor Gebrauch bei 4 °C am Tag auftauen.
  11. Das Wartungsmedium in einem 37 °C-Wasserbad ausstellen und sofort verwenden.
  12. Nach 2 Tagen die iCMs T25-Flaschen unter den Biosicherheitsschrank bewegen.
  13. Abgestorbene Zellen und Schutt vorsichtig abwaschen, indem man das Plating Medium 5 Mal sanft nach oben und unten pfeift.
  14. Aspirieren Sie das Plating Medium und ersetzen Sie es durch das 8 ml vorgewärmte Wartungsmedium. Legen Sie die T25-Flaschen wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie das Wartungsmedium jeden zweiten Tag und untersuchen Sie die Konfluenz regelmäßig.

3. Zellisolation und Zählen

  1. Beginnen Sie mit dem Sammeln der ersten HCAECs und HCFs und dann der iCMs, indem Sie die Schritte 3.2-3.12 befolgen.
  2. Bereiten Sie CS-Kulturmedium durch Mischen von 10 ml iCMs Maintenance Medium, 5 ml Human Cardiac Fibroblast Medium und 5 ml Von Meso Endo Growth Medium.
  3. Entfernen Sie Kulturmedium aus jedem Gewebekolben, der HCFs und HCAECs enthält, und spülen Sie es einmal mit 5 ml PBS für T75-Flaschen. Entfernen Sie PBS.
  4. 5 ml 0,25% Trypsin EDTA-Lösung zu jedem T75-Kolben geben und 5 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
  5. Sobald sich die Zellen lösen, neutralisieren Sie sofort die Trypsin-EDTA-Lösung mit 5 ml Kulturmedium.
  6. Zellsuspensionen 4 min auf ein 15 ml Rohr und Zentrifugenzellen bei 300 x g übertragen.
  7. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig aus jedem Rohr. Fügen Sie 1 ml CS-Medium zu jedem Zellpellet hinzu und suspendieren Sie sie erneut. Halten Sie die Röhre auf Eis und zählen Sie Zellen mit Trypan Blue und einem Hämozytometer.
  8. Entfernen Sie Daserhaltungsmedium aus Gewebekolben, die iCMs enthalten, und spülen Sie sie einmal mit 3 ml PBS.
  9. 1 ml 0,25% Trypsin EDTA-Lösung zu jedem T75-Kolben geben und bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Überprüfen Sie Zellen jede Minute, bis sie getrennt sind.
  10. Sobald sich die Zellen lösen, neutralisieren Sie sofort die Trypsin-EDTA-Lösung mit 4 ml Kulturmedium.
  11. Zellsuspensionen in ein 15 ml-Rohr übertragen und bei 300 x g für 5 min zentrifugieren.
  12. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig aus jedem Rohr. Fügen Sie dem Zellpellet 1 ml Kulturmedium hinzu und setzen Sie es wieder auf. Halten Sie die Röhre auf Eis und zählen Sie Zellen mit Trypan Blue und einem Hämozytometer.

4.CS Erzeugung und Wachstum

  1. Mischen Sie iCMs, HCAECs und HCAECs im Verhältnis 2:1:1, indem Sie 10.000 iCMs, 5.000 HCFs und 5.000 HCAECs pro hängender Tropfenkultur mit einem Cs-Medium von 20 l verschichten. Passen Sie das endgültige Volumen für die Gesamtzahl der CS an.
  2. Pipette 20 l Zellsuspension in jeden Brunnen der 384 well HDC Platte entweder manuell oder mit einer Roboter-Mehrkanalpipette für die automatisierte Flüssigkeitshandhabung.
  3. Pipette 1,5 ml sterile PBS in jeder Seite des Kanals um die Hängende Tropfenplatte, um das Austrocknen von CSs zu verhindern. HDC-Platte bei 37 °C inkubieren.
  4. Untersuchen Sie die Bildung von CSs auf einer täglichen Basis, bis ein vollständig gebildetes Sphäroid in den meisten Brunnen beobachtet wird. Fügen Sie jeden zweiten Tag 7,5 L CS-Medium zu jedem Brunnen hinzu, bis ein CS gebildet wird.

5.CS Einbettung in Kollagengele

  1. Sammeln Sie CSs mit einer 1 ml Pipettenspitze.
    HINWEIS: Es ist notwendig, die Spitze der Pipette etwa 0,2 cm von der Kante vor ihrer Verwendung mit einer sterilen scharfen Oberfläche (entweder ein Skalpell oder eine Schere) zu schneiden, um Schäden Gel eingebettete Sphäroide während ihrer Sammlung zu verhindern.
  2. Sammeln Sie die CS-Federung in eine 50 ml Röhre auf Eis.
  3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min.
    HINWEIS: Das erhaltene Pellet muss bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden.
  4. Bereiten Sie eine Kollagen-Gel-Lösung (100 l/gut für 30 Brunnen von 96 Well-Platte) auf Eis mit Rattenschwanz kollagen und CS-Medium in einem 3:7-Verhältnis.
  5. Entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr, das CSs enthält.
  6. Mischen Sie die pelletierten CSs in der Kollagen-Gel-Lösung.
  7. Der CS-Kollagen-Gelsuspension 1 L/ml 5 mM Natriumhydroxid hinzufügen und schonend mischen.
  8. Übertragen Sie 100 l CS-Kollagen-Gel auf einen klaren flachen Boden 96 gut schwarze Polystyrol-Mikroplatte und inkubieren bei 37 °C für 30 min.

6. Lebensfähigkeits- und Toxizitätsmessungen von DOX-behandelten CS

  1. Nach 30 min sammeln Sie die 96 Well Platte aus inkubator
  2. Bereiten Sie einen DOX mit 10 M vor (basierend auf einem zuvor festgelegten Protokoll für den Zelltod in CSs14).
    HINWEIS: Um möglicherweise andere Agenten zu testen, die in CS vor HF schützen können, generieren Sie Lösungen, die DOX + Agent A, B usw. enthalten.
  3. Fügen Sie jedem Bohrwert 100 L Lösungen hinzu, die DOX und/oder andere Wirkstoffe enthalten. Kontrollkulturen enthalten Medien ohne DOX.
  4. Inkubationsplatte für 18 h bei 37 °C, 5%CO2.
  5. Sammeln Sie am nächsten Tag die Live/Dead-Färbereagenz-Lagerlösungen und lassen Sie sie im Dunkeln in einem Biosicherheitsschrank auf Eis auftauen.
  6. Bereiten Sie eine Lösung vor, die Hoechst-Färbung, 4 M Ethidium-Homodimer und 2 M Calcein-AM enthält.
  7. Fügen Sie 100 L Hoechst-Färbung, Calcein-AM/Ethidium-Homodimer-Lösung in jeden Brunnen ein.
  8. Messen Sie die Fluoreszenz in jedem Brunnen bei 645 nm für Ethidium homodimer bzw. bei 530 nm für calcein-AM, mit Multimode-Mikroplattenleser.
  9. Übertragen Sie Fluoreszenzmessungen in Graphpad PRISM (oder eine gleichwertige Software für statistische Analysen).
  10. Verwenden Sie die GraphPad Prism-Software für Datenanalysen und Statistiken.
  11. Zur Qualitätskontrolle sollten Sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop die Kernfärbung zusammen mit Calcein-AM und Ethidium-Homodimer überprüfen.

7.CS kontraktile Funktionsauswertung

  1. Sammeln Sie die Mikroplatte, wie in Schritt 5.8 vorbereitet.
  2. Schalten Sie den Computer ein, der die IonOptix-Software für eine videobasierte Kantenerkennung, die Fluoreszenzunterstützungsschnittstelle und den MyoPacer Field Stimulator enthält.
  3. Legen Sie einen neuen Deckelschlupf auf die Tissuehalterplattform und montieren Sie wasserbad mit Elektroden.
  4. Sammeln Sie vorsichtig CSs von Kollagengelen mit einer 1 ml Pipette Spitze geschnitten 0,5 mm von der Kante und übertragen Sie sie auf ein Falkenrohr. Fügen Sie Medien auf CS hinzu, um das Trocknen von CSs zu verhindern. Übertragen Sie CS (eine nach der anderen) mit ein paar L Medien auf der Bühne des IonOptix-Systems.
  5. Wählen Sie die zu analysierende CS aus, indem Sie spitzenauf der linken und rechten Seite von CS mithilfe der IonOptix-Software einstellen.
  6. Verwenden Sie den computerbasierten Bewegungsanalysator, um die Bewegung von CS-Kanten zu verfolgen.
    HINWEIS: Normalerweise wird die Kontraktilität entweder in % Zellverkürzung oder % fraktionierter Verkürzung gemessen. In diesem Fall haben wir % Sphäroidverkürzung gemessen.
  7. Stabilisieren Sie sowohl die Spitzeneinstellungsschwelle als auch die Kantenoptionen vom Computer aus.
  8. Setzen Sie CSs verschiedenen Frequenzen (0,3, 0,6, 1, 2 und 3 Hz) und Spannungen (1, 2, 3 und 5 V) mit dem Myopacer Field Stimulator aus.
  9. Zeichnen Sie sphäroide Verkürzungen als CS-Längenänderungen von DOX-behandelten und unbehandelten CSs auf. Analysieren Sie Daten mit der Soft-Edge-Software und gemittelt für jedes CS.

8. Mikroskopie von CSs: Fixierung und Immunkennzeichnung

  1. Sammeln Sie die 96-Wellplatte nach 30 min (wie in Schritt 5.8) vorbereitet und fixieren Sie CSs in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei Raumtemperatur.
  2. PFA entfernen und dreimal mit PBS mit 0,01 % Natriumazid (PBSA) abspülen.
  3. Entfernen PbSA.
  4. Fügen Sie 200 L PBSA mit 0,02% Triton-X-100 zu jedem Brunnen für 30 min auf einem Shaker hinzu.
    HINWEIS: Dieser Schritt durchdringt CSs für eine bessere Antikörperinfiltration.
  5. Fügen Sie 200 l 3% Rinderserumalbumin in PBSA-Lösung für 60 min bei Raumtemperatur hinzu.
    HINWEIS: Dieser Schritt blockiert die unspezifische Antikörperbindung in CSs.
  6. Bereiten Sie eine Lösung vor, die 10 g/ml primärer Maus-Antihumanantikörper gegen CD31 enthält, die in einer blockierenden Lösung verdünnt werden.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Primärantikörperlösung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
  8. Spülen Sie die Platte dreimal mit PBSA für 20 min bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplatte.
  9. Bereiten Sie eine Lösung vor, die einen Hoechst-DNA-Fleck und 10 g/ml Cy3-konjugierten Sekundäres-Anti-Maus-Antikörper enthält, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
  10. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Sekundärantikörperlösung mit Hoechst-Färbung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
    HINWEIS: Bedecken Sie die Platte ab diesem Zeitpunkt mit Aluminiumfolie.
  11. Spülen Sie die Platte dreimal für 20 min mit PBSA bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplatte.
  12. Fügen Sie jedem Bohrgut 100 L Vectashield-Montagemedium hinzu.
  13. Bild-CSs unter einem laserscannenden konfokalen Mikroskop. Führen Sie optische Schnitte entlang der Z-Achse durch und reduzieren Sie Bilder mithilfe der ImageJ-Software in eine einzelne Fokusebene.

Ergebnisse

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll stellt einen alternativen Ansatz zur Entwicklung eines komplexen herzendotheliaalen Zellnetzes innerhalb eines biotechnischen Herzgewebes mit verbesserter Zelllebensfähigkeit und -funktion im Vergleich zu bestehenden Modellen dar (Abbildung 1). Die Rekapitulation der 3D-in-vivo-Herzmikroumgebung innerhalb von CS förderte ihre Reaktion auf DOX in der Konzentration, die im Blutkreislauf von Krebspatienten gefunden wurde (zwischen 5 und 10 M, Abbildung 2). DOX behandelte CSs stellten eine statistisch signifikante Verringerung der Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu Kontroll-(keine DOX) CSs innerhalb von 24 h dar (Abbildung 2), eine toxische Wirkung, die bei menschlichen Krebspatienten auch 17 Jahre nach ihrer Behandlung mit dem Medikament beobachtet wird.

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Abbildung 1. CS-Formations- und Vaskularisationsanalyse. (A) Protokoll, das die Schritte zur Bildung eines CS aus der Kokultur von iCMs, HCAECs und HCF in hängenden Tropfen zeigt. Hellfeldbilder auf der rechten Seite zeigen die progressive Sphäroidbildung einzelner Zellen in hängenden Tropfen. (B) Kollabierte Z-Stacks von konfokalen Bildern eines CS, die mit Antikörpern gegen Herz Troponin T (cTNT), PECAM und Vimentin gefärbt sind, die Herzmyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten färben. Diese Zahl wurde von14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2. Lebensfähigkeit und Toxizität in CS. Statistische Analysen von Calcein-AM (A) und Ethidium homodimer (B) Fluoreszenz von CS, die nur in Gegenwart von Medien (DOX 0 'M) oder Doxorubicin (10 'M) behandelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Entwicklungsgemäß ist die richtige vaskuläre Netzwerkbildung entscheidend für die Erzeugung von funktionellen Geweben, einschließlich des menschlichen Herzens10,12,23,24,25,26. Die Berücksichtigung der richtigen Vaskularisation von 3D-Geweben ermöglicht den Austausch von Sauerstoff, Wachstumsfaktoren, Signalmolekülen und Nährstoffen und verhindert die Entwicklung von Zellnekrose in einem Gewebe dicker als 200 'm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Derzeit verfügbare in vitro 3D-Herzmodelle, die ein Gefäßnetzwerk darstellen, präsentieren in erster Linie kapillargroße, unorganisierte Gefäßnetzwerke und fehlen die hierarchisch-komplexe verzweigte Vaskularisation, die in vivo6,8,29beobachtet wurde. Der in diesem Manuskript beschriebene alternative Ansatz zur Entwicklung eines komplexen herzendothelialzellnetzes stellt eine verbesserte Zelllebensfähigkeit und -funktion im Vergleich zu bestehenden Modellen dar (Abbildung 1)14,22. 3D-In-vitro-CS modellieren das menschliche Herz, indem es seine in vivo Mikroumgebung, einschließlich seiner molekularen, zellulären und extrazellulären Komponenten14,22, besser rekapituliert. Die CS-Generierung aus Stammzell-abgeleiteten Zellen in den hängenden Tropfen ermöglicht ihre Kulturen unter definierten Bedingungen (z. B. Zelltypen und Verhältnis, richtige Gewebebildung). Ko-Kulturen von iCMs zusammen mit HCFs und HCAECs in CSs definieren das molekulare und zelluläre Übersprechen, das die Herzpathophysiologie reguliert, einschließlich ihrer kontraktilen Funktion und Reaktion auf Medikamente in Konzentrationen, die im Blutkreislauf des Patienten gefunden werden14. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften wurden CSs verwendet, um Herzfibrose zu modellieren, eine schwere Folge von Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz21. Unsere früheren Studien zeigten, wie das Vorhandensein von Endothelzellen und Fibroblasten entscheidend für die Rekapitulation der vaskulären Mikroumgebung im menschlichen Herzen ist, was die optimale Ablagerung von aus Fibroblasten abgeleiteten ECM-Proteinen wie Laminin, Fibronectin und Kollagen Typ IV ermöglicht, lokalisiert in der Nähe eines sich entwickelnden endothelialen Zellnetzwerks14,21.

DOX ist ein bekanntes kardiotoxisches Medikament, das Herzinsuffizienz bei Krebspatienten auch 17 Jahre nach ihrer Behandlung entwickeln kann30. Dennoch bleibt es ein Medikament der Wahl für die Behandlung von Leukämie und Lymphom bei pädiatrischen Patienten und Brustkrebs bei Frauen30. DoX-Behandlung in CSs wurde dann verwendet, um Herzinsuffizienz (HF) in vitro zu modellieren, um sowohl die Mechanismen zur Regulierung der Toxizität in Herzmyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten14 zu untersuchen und HF-induzierte Herzfibrose21zu modellieren. Die Zelllebensfähigkeit wurde in DOX-behandelten CS innerhalb von 24 h statistisch reduziert, wenn das Medikament in der Konzentration im Blutkreislauf von Krebspatienten (zwischen 5 und 10 m)14 (Abbildung 2)ausgesetzt wurde. Frühere Studien in unserem Labor zeigten auch die toxischewirkung von DOX auf Herz-Endothel-Zellen und Fibroblasten über endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) mit genetischen und chemischen Inhibitoren dieses Signalwegs14. Die Verwendung von genetischen (NOS3 shRNA) und chemischen (N5-(1-iminoethyl)-L-Ornithin-, Dihydrochlorid- oder L-NIO-Antagonisten des eNOS-Signalwegs als nachgeschaltetes Ziel von DOX verhinderte seine toxischen Wirkungen sowohl in Herz-Endothelzellen als auch in Fibroblasten14.

Die kontraktile Aktivität innerhalb von CSs wurde auch durch die elektrische Kopplung von Herzzellen gemessen, wenn sie feldpotentialstimulation ausgesetzt sind. Wir fanden heraus, dass CSs, die mit Kontrollmedien (DOX 0 'M) kultiviert sind, spontan und homogen mit einer Schlaggeschwindigkeit zusammenziehen, die durch Feldstimulation innerhalb von 1 und 3 Hz beschleunigt werden kann, vergleichbar mit einem gesunden menschlichen Herzen. Auf der anderen Seite folgen DOX-behandelte CS s nicht der elektrischen Stimulation, da sie sich nicht zusammenziehen können. Zusammen mit den Messungen der Zelllebensfähigkeit und Toxizität mit Calcein-AM und Ethidium-Homodimer ermöglicht dieser funktionelle Assay für CS-Kontraktilen die Bewertung des für das menschliche Herz typischen komplexen Szenarios in vitro, das derzeit mit anderen Modellen nicht erreichbar ist. Im Vergleich zu kontraktilen Aktivitätsmessungen einzelner Herzzellen mit dem gleichen System sind wir nicht in der Lage, das Sarkome in CSs zu visualisieren und zu messen. Daher beschränken wir uns auf Messungen von % Sphäroidverkürzung im Laufe der Zeit, ein Test, den wir in unserem Labor entwickeln mussten. Wenn wir die Anzahl der Zellen kontrollieren, wir in jedem CS mitkulturieren und daher die Größe jedes CS, verwenden wir CSs mit ähnlicher Größe, die in der Tat homogene kontraktile Funktion darstellen. Doch selbst wenn wir CS s unterschiedlicher Größe erzeugten, änderte sich ihre kontraktile Aktivität nicht.

Es ist auch wichtig zu berichten, dass die multizelluläre Natur von CSs macht sie schwer genug, um am unteren Rand des Abdeckungsslip im Ion-Optix-System zu lokalisieren, auch wenn sie superfused sind. Basierend auf der Tatsache, dass CSs allein in einer bestimmten Position sitzen, müssen wir sie nicht an der Decklippe haften lassen, im Gegensatz zu dem, was in den meisten Laboratorien üblicherweise mit einzelnen Herzzellen gemacht wird.

Die mikroskopische Analyse von Mit Antikörpern gefärbten CSs gegen Herztroponin T, CD31/PECAM und PECAM (als Marker für iCMs, HCAECs bzw. HCFs) zeigte die Bildung eines endotheliaalen Zellnetzwerks(Abbildung 1,blau). Um Nekrose im inneren Teil von CSvollständig auszuschließen, wurde in unserem Labor eine räumliche Bewertung der Zelllebensfähigkeit durch konfokale Analyse von calcein-AM/ethidium homodimer gefärbten CSs durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass zukünftige Entwicklungen im Bereich der Biofertigung, um andere komplexe Merkmale, die typisch für das menschliche Herz in vivo sind, besser rekapitulieren, die derzeit im bestehenden Modell nicht verfügbar sind. Dazu gehören: i) kontraktile Funktion typisch für erwachsene Kardiomyozyten; ii) Durchblutungs- und Druckkräfte; iii) parakrine Signalisierung; iv) Immunantwort, die entscheidend sein wird, um dieses und andere in vitro Herzmodelle zu verbessern6. Da jedes andere Modell darauf abzielt, die Hauptmerkmale eines gesunden Gewebes oder eines Krankheitszustandes zu rekapitulieren, zielt das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von CS darauf ab, dem Forscher bei der Lösung spezifischer Fragen zu helfen, die mit diesem Ansatz möglicherweise nicht erschöpfend sind. Beispielsweise würde die mögliche Verwendung von patientenabgeleiteten Zellen für die Erzeugung von CSs Werkzeuge für die personalisierte Medizin bereitstellen, die derzeit nicht mit allgemein verfügbaren Hochdurchsatz-Assays für kardiovaskuläre Forschung verfügbar sind.

Abschließend zeigten wir eine einfache Möglichkeit, die Mikroumgebung des menschlichen Herzens mit Herzzellen besser zu rekapitulieren. Herzsphäride stellen ein endothelialezelliges Netzwerk dar, das das im menschlichen Herzen vorhandene besser rekapituliert als monolayer Kulturen von Herzzellen. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften stellen sie fortschrittliche Werkzeuge für In-vitro-Tests für kardiovaskuläre Forschung dar. Zukünftige Studien mit Patienten-abgeleiteten Zellen könnten Optionen für personalisierte Medizin und neuartige Therapien bieten, um Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu verhindern und besser zu behandeln.

Danksagungen

Ein besonderer Dank geht an Nat Johnston für die Aufnahme und Bearbeitung des Videos.

Poonam Sharma wurde von der University of Newcastle mit UNIPRS und UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) Stipendien unterstützt. Carmine Gentile wurde durch eine UTS Seed Funding, das Catholic Archdiocese of Sydney Grant for Adult Stem Cell Research und ein Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA1933
Esel-Anti-Maus-SekundärantikörperJackson Immunological Research Labs, Inc.715-165-150Cyanin-Cy3-konjugierter Sekundärantikörper
DoxorubicinhydrochloridSigma-AldrichD1515
FibronektinSigma-AldrichF1141-1MGaus Rinderplasma Humane
kardiale Fibroblasten (HCFs)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA306AK-05a5x10^5 Zellen (adult), Medium & Subkultur-Reagenzien
Humane Koronararterien-Endothelzellen (HCAECs)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA300K-05a5x10^5 Zellen (adult), Medium & Subkultur-Reagenzien
Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iCMs)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Cardiomyozyten Kit, 01434
HCF WachstumsmediumCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA316-500
Humanes MesoEndo-ZellwachstumsmediumCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen, Carlsbad, CA, USAL3224
Erhaltungsmedium (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Cardiomyozyten Kit, 01434
Maus Monoklonales Anti-Human-CD31/PECAMBD Pharmingen, San Diego, CA, USA566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagenz (Hoechst 33342)Invitrogen, Carlsbad, CA, USAR37605
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8537
Beschichtungsmedium (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Kardiomyozyten-Kit, 01434
Rattenschwanz-KollagenSigma-AldrichC3867
NatriumazidSigma-AldrichS2002
Trypsin– EDTA, 0,25 %Gibco, Thermofisher Scientific25200072
Trypanblau-Lösung, 0,4 %Gibco, Thermofisher Scientific15250061
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
Gewebekulturflaschen (T25)Thermofisher Scientific156367
96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem, klarem Boden und schwarzem Polystyrol TC-behandeltCorning, New York, USA3603
384-Well hängende Fallplatte3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USAHDP1385

Referenzen

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