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Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

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DOI:

10.3791/61991

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3. April 2021

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1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Zusammenfassung

Untersuchungen sowohl der Pathophysiologie als auch der therapeutischen Ziele bei Muskeldystrophien wurden durch die begrenzte Proliferativfähigkeit menschlicher Myoblasten behindert. Mehrere Mausmodelle wurden erstellt, aber sie stellen entweder nicht wirklich die menschliche Physiopathologie der Krankheit dar oder sind nicht repräsentativ für das breite Spektrum von Mutationen beim Menschen. Die Verewigung menschlicher Primärmyoblasten ist eine Alternative zu dieser Einschränkung; Es ist jedoch immer noch abhängig von Muskelbiopsien, die invasiv und nicht leicht verfügbar sind. Im Gegensatz dazu sind Hautbiopsien leichter zu erhalten und weniger invasiv für Patienten. Fibroblasten, die aus Hautbiopsien gewonnen werden, können verewigt und in Myoblasten transdifferenziert werden, was eine Quelle von Zellen mit ausgezeichnetem myogenem Potenzial bietet. Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte Reprogrammierungsmethode von Fibroblasten in eine myogene Abstammung. Fibroblasten werden mit zwei Lentiviren transduziert: hTERT zur Verewigung der Primärkultur und ein tet-induzierbares MYOD, das durch Zugabe von Doxycyclin die Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten induziert und dann reife Myotuben auslöst, die späte Differenzierungsmarker ausdrücken. Dieses schnelle Transdifferenzierungsprotokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um pathologische Mechanismen zu untersuchen und innovative genbasierte oder pharmakologische Biotherapien für neuromuskuläre Störungen zu untersuchen.

Einleitung

Zelluläre Modelle, die direkt aus menschlichen Geweben gewonnen werden, sind nützlich, um viele menschliche genetische Störungen zu modellieren, mit dem Vorteil, dass der ursprüngliche genomische Kontext besteht und in vielen Fällen die gleichen molekularen und zellulären Merkmale reproduziert werden, die bei den Patienten beobachtet wurden. Im Bereich der neuromuskulären Störungen, Muskelbiopsien haben eine große Quelle für menschliche Myoblasten und haben bei der Aufklärung der pathologischen Mechanismen geholfen. Darüber hinaus sind sie ein wichtiges Werkzeug für In-vivo-Tests von Medikamenten und Gentherapien. Einerseits ist die Ableitung von Myoblasten aus Muskelfragmenten relativ einfach. Auf der anderen Seite sind die Kultur und die Aufrechterhaltung der primären Myoblasten aufgrund ihrer begrenzten Proliferationsrate und replizierbaren Seneszenz in vitro1herausfordernd. Eine Alternative für diese Einschränkungen ist die Verewigung von Myoblasten mit der Einfügung der menschlichen Telomerase (hTERT) und/oder der cyclinabhängigen Kinase 4 (CDK4) Gene2,3, mit Erhaltung der Skelettmuskelmerkmale4. Dennoch ist die Obtention von primären Myoblasten immer noch abhängig von der Muskelbiopsie, einem chirurgischen Eingriff mit Nachteilen für die Patienten, die in vielen Fällen ihre Muskeln in fortgeschrittener Degeneration haben. So besteht der Muskel dieser Patienten aus einem signifikanten Anteil an fibrotischem und/oder fettigem Gewebe und ergibt weniger Muskelzellen, was die Reinigung der Zellen vorher bis zur Verewigung erfordert.

Im Gegensatz zu Muskelbiopsien sind Hautbiopsien leichter zugänglich und weniger schädlich für Patienten. Primäre Fibroblasten können aus Hautfragmenten in vitroabgeleitet werden. Obwohl Fibroblasten nicht in erster Linie von Mutationen betroffen sind, die neuromuskuläre Störungen verursachen, können sie in Myoblasten transdifferenziert werden. Dies kann durch die Einfügung des Myod-Gens erreicht werden, einem myogenen regulatorischen Transkriptionsfaktor5. In diesem Manuskript beschreiben wir das Protokoll zur Erlangung transdifferenzierter Myoblasten, von der Etablierung von Fibroblastenkulturen bis zur Obtention differenzierter Myotubes (eine repräsentative Zusammenfassung der Methode ist in Abbildung 1dargestellt).

Die präklinische Prüfung therapeutischer Strategien hängt von zellulären und tierischen Modellen ab, die Mutationen tragen, die den Mutationen bei menschlichen Patienten ähneln. Obwohl die Entwicklung von Tiermodellen mit dem Fortschritt von Gen-Editing-Technologien wie CRISPR/Cas96machbarer geworden ist, ist sie immer noch anspruchsvoll und kostspielig. Daher sind patientenabgeleitete Zelllinien eine zugängliche Option, um Modelle zu haben, die das große Spektrum von Mutationen von Krankheiten wie Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) abdecken. Die Beobachtung und die Erstellung von Zellmodellen sind entscheidend für die Entwicklung personalisierter Therapien für solche Pathologien.

Unter den personalisierten Therapien, die untersucht wurden, exon Überspringen Strategien ist eine der vielversprechenden für verschiedene Muskeldystrophien7,8. Diese Strategie besteht in der Herstellung eines kürzeren, aber funktionellen Proteins. Dies geschieht, indem die Exon-Definition dem Spliceosomen verborgen wird, also das mutierte Exon vom letzten Boten ausgeschlossen wird. Dies ist eine sehr vielversprechende Technologie, die von der FDA für DMD zugelassen wurde. So beschreiben wir in diesem Protokoll auch Methoden zur Transfektion von Myoblasten mit zwei verschiedenen Exon-Übersprungtechnologien: Antisense-Oligonukleotide (AON) und U7snRNA-adeno-assoziiertes Virus (AAV). AON-Transfektion ist ein gutes Werkzeug für das erste Screening mehrerer Sequenzen, die entwickelt wurden, um exon skipping9zu fördern. Die Aktivität von AONs ist jedoch vorübergehend. Um eine nachhaltige Expression von Antisense-Sequenzen zu erhalten, untersuchten wir auch kleine nukleare RNAs (snRNAs) in Kombination mit AAV, was die nukleare Lokalisierung und Aufnahme in die Spleißmaschinerie10ermöglichte. U7 ist eine snRNA, die an der Verarbeitung von Histon-mRNA beteiligt ist, die entwickelt werden kann, um Proteine zu binden, die sie an das Spliceoom umleiten und Antisense-Sequenzen liefern11. Die Verwendung modifizierter U7-SnRNAs in Kombination mit AAV-Vektoren überwindet Die Einschränkungen der AONs, was zu einer fortgesetzten Expression der AONs und einer besseren Transduktion von Geweben von Interesseführt 12. Wir verwenden Zellen, die von DMD-Patienten für dieses Protokoll abgeleitet wurden, um die Exon-Skipping-Strategie zu veranschaulichen.

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Protokoll

Alle Experimente und Biopsien wurden nach den ethischen Regeln der beteiligten Institutionen unter der Genehmigung des Nationwide Children es Hospital Institutional Review Board durchgeführt.

1. Initiierung dermaler Fibroblastenkultur

  1. Etablierung der Fibroblastenkultur
    1. Aliquot 10 ml Fibroblastenmedium (Tabelle 1) in 15 ml konischen Röhren. Die Hautbiopsie sollte in diesem Medium platziert und transportiert werden. Die Biopsie kann bei 4 °C gelagert werden, bis sie bevorzugt am selben Tag verarbeitet wird.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Hautbiopsie innerhalb von 24-36 Stunden, um ein potenzielles Wachstum der Kontamination zu vermeiden.
    2. Die Medien aus dem Rohr ansaugen und die Biopsie mit 10 ml 1X PBS (Raumtemperatur) dreimal abspülen. Nach der dritten Wäsche die PBS in der Röhre lassen.
    3. Gießen Sie die PBS und die Haut auf eine 10 cm2 Schale.
    4. Mit sterilen Skalpellen, schneiden Sie die Biopsie in so klein wie möglich Fragmente.
    5. Mit einer Pipette ein einzelnes Hautfragment übertragen und in eine saubere 10 cm2 Schale geben. Legen Sie 10 bis 12 Fragmente pro Gericht.
    6. Aspirieren Sie den Überschuss an PBS aus der Umgebung jedes Fragments. Achten Sie darauf, das Fragment nicht zu saugen.
    7. Bedecken Sie das Geschirr teilweise mit dem Deckel und lassen Sie die Hautfragmente für 5-20 min trocknen. Lassen Sie die Fragmente nicht übermäßig trocknen.
    8. Sobald die Fragmente trocken sind, kippen Sie die Schale bei 45 Grad und fügen Sie langsam 12 ml Fibroblastenmedium zur Ecke hinzu. Unten auf dem Teller, sorgfältig die Verteilung der Medien, so dass die Fragmente nicht durch die Medien heben.
    9. Legen Sie das Geschirr in den Brutkasten (37 °C, 5% CO2). Ersetzen Sie die Medien in 5-7 Tagen und einmal pro Woche danach.
    10. Beobachten Sie die Ausläufer des Fragments(Abbildung 2) und, sobald sie konfluent sind, durchdiestigen Sie die Zellen in 75 cm2 Kolben. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 1 ml 0,25 % Trypsin hinzu. Bei 37 °C für 5 min oder bis alle Zellen angehoben werden. Fügen Sie 10 ml Fibroblasten-Wachstumsmedium hinzu, um das Trypsin zu hemmen und die Zellen in einen neuen Kolben zu übertragen.
      HINWEIS: Für die Durchgangsnummer Nomenklatur wird P1 etabliert, wenn die ersten Fibroblasten, die aus der Hautbiopsie hervorgegangen sind, auf einen neuen Kolben zur Proliferation übertragen werden.
  2. Kryokonservierung von primären Fibroblastenlinien
    1. Sobald der 75 cm2 Kolben konfluent ist, spülen Sie ihn mit 10 ml 1X PBS und aspirieren PBS.
    2. Fügen Sie der Zelloberfläche 3 ml 0,25 % Trypsin hinzu. Legen Sie den Kolben für 5 min in den Inkubator. Überprüfen Sie die Kolben unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob die Zellen angehoben werden. Wenn nicht, legen Sie den Kolben für weitere 5 min wieder in den Inkubator.
    3. Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie 7 ml Fibroblastenmedien in den Kolben und die Pipette nach oben und unten, um die Zellen wieder auszusetzen. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 ml konischen Rohr.
    4. Bereiten Sie 100 L Aliquot von Trypan blau vor, und entfernen Sie 100 l aus der Probe, die kryokonserviert wird, mit dem Trypan blau mischen. Laden Sie die Mischung auf das Hämozytometer, um zu zählen. Zählen Sie die Zellen in vier verschiedenen Feldern des Hämozytometers unter dem Mikroskop. Um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen, verwenden Sie die Formel: (gezählte Zellen/100) * Kulturvolumen.
    5. Drehen Sie die konischen Rohre bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur oder 4 °C.
    6. Abspirieren Sie das Medium und setzen Sie die Zellen im ausreichenden Volumen des Gefriermediums wieder aus: 1 ml pro 1 Million Zellen/Durchstechflasche. Pipette nach oben und unten, um zu homogenisieren und verteilen 1 ml auf jede beschriftete kryovial.
    7. Legen Sie die Fläschchen in die Gefrierbox und lassen Sie die Durchstechflaschen über Nacht bei -80 °C Gefrierschrank bei einer Rate von 1 °C/min einfrieren.
    8. Am nächsten Tag die Durchstechflaschen in einen Flüssigstickstofftank oder -150 °C Gefrierschrank überführen.

2. Einrichtung der FibroMyoblasten (FM) Zelllinie

  1. Saat primärer Fibroblasten bei ca. 30% der Konfluenz in zwei Brunnen einer 12-Well-Platte (2 x 104 Zellen/Well), um am nächsten Tag etwa 50% der Konfluenz zu haben.
  2. Für die lentivirale Transduktion 2 bis 5 x 109 vg (virale Genompartikel) des hTERT-Puromycin-Lentivirus in 400 l Fibroblastenmedium hinzufügen. Zum zweiten Brunnen, fügen Sie nur 400 l Fibroblastenmedium hinzu. Fügen Sie am nächsten Tag 1 ML Medium hinzu.
    HINWEIS: Plasmide für die Lentivirus-Produktion wurden von der Gruppe erhalten, die das Buch Chaouch et al, 2009 veröffentlichte. Sie werden auch einzeln in Aure et al, 200713 für hTERT Plasmid und Barde et al, 200614 für das Tet-on-System für die Entwicklung von MyoD Plasmid verwendet beschrieben. Sie wurden dank einer Materialtransfer-Vereinbarung mit Genethon, Frankreich (bitte wenden Sie sich an Dr. Vincent Mouly, um diese Plasmide zu erhalten - vincent.mouly@upmc.fr). Kurz gesagt, das hTERT besteht aus hTERT Variante 1, die von einem CMV-Promotor angetrieben wird, während das Puromycin von einem PGK-Promotor angetrieben wird. Das MyoD-Plasmid enthält eine MyoD-Variante 1, die von einem CMV-Promotor unter der Kontrolle des Repressors rtTA2 angetrieben wird. Dieses Plasmid enthält auch die Hygromycin-Auswahl, die dank des SV40-Promoters zum Ausdruck gebracht wird.
    Lentiviren wurden unter verwendung regelmäßiger Lentiviralproduktion hergestellt (siehe Wang und McManus JoVe Protokoll15). Kurz gesagt, MDL-Helfer, Rev-Helper, SVS-G-Helfer wurden über Calciumchlorid-Fällung auch von hTERT oder MyoD Plasmiden transfiziert. Nach 48 h wurde der Überstand gesammelt, und dann für weitere drei Tage. Alle Überstand wurde dann durch Ultrazentrifugation konzentriert. Das Pellet wurde dann in den Tris-HCL+NaCl+EDTA-Puffer zurückgesetzt. Die Titer-Schätzung wurde mit dem Standard-Lentivirus qPCR-Assay ausgewertet.
  3. Ein oder zwei Tage später übertragen Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und wachsen sie bis zum Erreichen von 60-70% Zusammenfluss.
  4. Ergänzen Sie das Fibroblastenmedium mit 1 g/ml Puromycin und fügen Sie jedem Brunnen 2 ml hinzu.
  5. Halten Sie die Zellen unter Auswahl, bis alle Zellen im Kontrollbrunnen tot sind (bis zu 12 Tage), und alle 2-3 Tage die Medien wechseln. Durchgehen Sie die Zellen aus der 6-Well-Platte in zwei 10 cm2 Gerichte für die weitere Proliferation.
  6. Durchstechflaschen von Fibroblasten nach der Selektion einfrieren. Bezeichnung als F(hTer).
  7. Saat hTERT-exemittierende Fibroblasten (F(hTer)) bei etwa 30% Zusammenfluss in Fibroblastenmedium, in zwei Brunnen einer 12-Well-Platte, um am nächsten Tag etwa 50% zusammenzutreffen.
  8. Für die Lentivirus-Transduktion 2 bis 5 x 109 g MyoD-HygromycinB-Lentivirus in 400 l Fibroblastenmedium mischen und zu den jeweiligen Brunnen hinzufügen; zum dritten Brunnen 400 l Fibroblastenmedium hinzufügen. Fügen Sie 1 ml Medium am nächsten Tag hinzu.
  9. Ein oder zwei Tage später übertragen Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und wachsen bis 60-70% Zusammenfluss.
  10. Ergänzen Sie das Fibroblasten-Wachstumsmedium mit Hygromycin B (400 g/ml) und fügen Sie jedem Brunnen 2 ml hinzu.
  11. Halten Sie die Zellen unter Auswahl, bis alle Zellen im Kontrollbrunnen tot sind (bis zu 12 Tage), und alle 2-3 Tage die Medien wechseln.
  12. Durchstechflaschen von Fibroblasten nach der Selektion einfrieren. Etikettals FM gefolgt von der Zellenidentifikationsnummer/dem Namen.

3. Transdifferenzierungsprotokoll

  1. Samen transduzierte FM auf 10 cm2 Gerichte mit 30-40% Zusammenfluss. In einer 12-Well-Platte, Samen 6 x 104 Zellen (dies ist abhängig von der einzelnen Zelllinie).
    HINWEIS: Zum Immunstainieren werden Samenzellen auf Glasabdeckungen oder mit Matrigel beschichtete Kammergweise. Matrigel bei 1:10 in DMEM-Medium verdünnen, ein Volumen hinzufügen, das ausreicht, um die Oberfläche zu bedecken, und lassen Sie die Dias eine Stunde bei Raumtemperatur sitzen. Apirieren Sie direkt vor dem Aussaat der Zellen.
  2. Bei der Myoblasten-Induktion, wenn die Fibroblasten 70% Zusammenfluss erreichten (Abbildung 3A), spülen Sie die Zelloberfläche mit PBS ab und fügen Sie frische Myoblast-Medien hinzu, die mit frischem 8-g/ml-Doxycyclin ergänzt werden.
    HINWEIS: Der Erfolg der Differenzierung wird nach 80% Zusammenfluss beeinträchtigt.
  3. Nach zwei bis drei Tagen sind die Zellen zu 90-95% konfluent und ihre Morphologie wird sich geändert haben (Abbildung 3B). Spülen Sie die Zelloberfläche mit PBS und fügen Sie frische Differenzierungsmedien hinzu, die mit frischem 8-g/ml-Doxycyclin ergänzt werden.
  4. Wechseln Sie alle 2-3 Tage ohne Passaging die Medien, bis Myotuben eingerichtet sind (Bestätigung über Morphologie) (Abbildung 3C).
  5. Sieben bis zehn Tage nach Beginn der Myotube-Differenzierung sollten die Zellen vollständig differenziert sein und beginnen zu lösen oder abzusterben. Bevor dies geschieht, ernten Sie Myotubes für weitere Analysen.
    HINWEIS: Der Zeitverlauf der Myotube-Bildung hängt von der Zelllinie ab. Mutationen in muskelbedingten Proteinen können das myogene Potenzial beeinträchtigen. Wenn Myotubes beginnen, hell zu erscheinen und an den Rändern weiß auszusehen, ist dies ein Signal, das sie zu lösen beginnen (Abbildung 4).
  6. Um Myotubes zu ernten, sammeln Sie Medien und übertragen Sie sie auf ein 50 ml konisches Rohr. Das Medium kann Myotubes enthalten, die sich gelöst haben.
  7. Spülen Sie die Myotubes mit 5 ml PBS und übertragen Sie PBS in das 50 ml Rohr.
  8. Fügen Sie der Zelloberfläche 3 ml 0,25 % Trypsin hinzu. Legen Sie das Gericht in den Inkubator für 5 min. Überprüfen Sie die Schale unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob die Zellen angehoben werden. Wenn nicht, legen Sie es für weitere 5 min wieder in den Inkubator.
  9. Sobald die Zellen abgetrennt sind, fügen Sie 7 ml Fibroblastenmedien in die Schale und Pipette nach oben und unten, um die Zellen wieder auszusetzen. Sammeln Sie die Zellen bis zum 50 ml konischen Rohr.
  10. Zentrifuge bei 1.200 x g für 7 min bei 4 °C.
  11. Die Flüssigkeit vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören. Bewahren Sie die Pellets bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C auf.

4. Immunostainierung von differenzierten Myotuben

HINWEIS: Zum Immunstainieren wachsen die Zellen in Glasabdeckungen oder Kammerglühbahnen, wie oben erwähnt.

  1. Sobald Myotubes vollständig differenziert sind, aspirieren Sie Medien ab und spülen Sie die Dias sorgfältig mit PBS ab. Aspirieren PBS aus.
  2. Fügen Sie frische 4% PFA (500 l pro Bohrung einer 12-Well-Platte) und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Aspirieren PFA aus.
  3. Spülen Sie mit 1 ml PBS.
  4. Mit 0,2 m Glycin bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Aspirieren Sie Glycin aus.
  5. Permeabilisieren mit PBS 0,5% TritonX-100 (300 l/Well einer 12-Well-Platte), für 10 min mit sanfter Rührung.
  6. Block mit 300 l/Well der Blockierlösung, für 10 min mit sanfter Rührung.
  7. Inkubieren Sie mit primärem Antikörper 1:50 in 300 l Blockierlösung, für 2 Stunden bei Raumtemperatur, mit sanftem Schütteln.
  8. Spülen Sie dreimal mit 1 ml/Gut von PBS für 5 min, mit sanftem Schütteln.
  9. Inkubieren Sie mit sekundärem Antikörper 1:500 in 300 l Blockierlösung, für 1 Stunde, bei Raumtemperatur, mit sanftem Schütteln. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie.
  10. Spülen Sie dreimal mit 1 ml/Gut von PBS für 5 min, mit sanftem Schütteln.
  11. Inkubieren Sie mit DAPI in PBS für 10 Minuten verdünnt. Spülen Sie dreimal mit 1 ml/Gut von PBS.
  12. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium zu einem Glasschlitten hinzu. Entfernen Sie den Deckelrutsch mit Zangen und legen Sie ihn mit dem Gesicht nach unten auf den Tropfen des Montagemediums.
  13. Invertieren Sie auf ein Papiertuch und drücken Sie vorsichtig, um Blasen und überschüssiges Montagemedium zu entfernen.
  14. Versiegeln Sie die Dias mit Nagellack und lagern Sie bei 4 °C bis zur Bildgebung.

5. Antisense-Oligonukleotid-Transfektion

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die Transfektion einer 6-Well-Platte. Passen Sie die Volumina entsprechend für kleinere oder größere Platten an. Die Transfektion erfolgt in 100% konfluenten Myoblasten, wenn die Zellen für den Differenzierungsschritt bereit sind.

  1. Aspirieren Sie die Myoblast-Wachstumsmedien und spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS ab.
  2. Fügen Sie 500 L /Well von OptiMEM-Medien hinzu und brüten bei 37 °C für 1 Stunde.
  3. Das Antisense-Oligonukleotid (AON) in 100 l OptiMEM auf die gewünschte Endkonzentration (d. h. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM) verdünnen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für 2'omethyl-phosphorothioate AONs optimiert.
  4. Mischen Sie das Lipofectamin mit OptiMEM (Endvolumen von 100 l), um ein Endverhältnis von 1:1 zu ergeben (dna: l Lipofectamin). Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  5. Kombinieren Sie das verdünnte Liptectamin mit dem verdünnten AON. Mischen Sie sanft durch Pipettieren und brüten für 20 min bei Raumtemperatur, um komplexe Bildung zu ermöglichen. Vermeiden Sie Luftblasen.
  6. Fügen Sie 200 L Lipofectamin und AON-Mischung zu den jeweiligen Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2.
  7. Am nächsten Tag entfernen Sie die Transfektionsmischung und fügen Sie 2 ml warme Differenzierungsmedien hinzu, die mit Doxycyclin ergänzt werden.
  8. Sammeln Sie Zellen mindestens drei Tage später für die RNA-Extraktion oder sieben bis 21 Tage im Falle einer Proteinanalyse.
    HINWEIS: Die Tage der Differenzierung, die zum Nachweis der RNA- und/oder Proteinexpression erforderlich sind, können entsprechend dem Gen von Interesse oder der Zelllinie abweichen. Im Fall von DMDist es möglich, seine mRNA innerhalb von drei Tagen zu erkennen. Der Nachweis des Dystrophin-Proteins dauert mindestens sieben Tage. Dies hängt von der Zelllinie ab. Hohe Konzentrationen von AON und Transfektionsreagenz können die Transdifferenzierung beeinflussen.

6. AAV1-U7-Transduktion

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für 6-Well-Platten optimiert. Passen Sie die Volumen proportional zur Kulturoberfläche an. Die Transduktion erfolgt in 100% konfluenten Myoblasten, wenn die Zellen für den Differenzierungsschritt bereit sind. AAV1 ist der AAV-Serotyp mit der besten Transduktionskapazität von kultivierten Myoblasten.

  1. Aspirieren Sie das Myoblast-Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS ab.
  2. Verdünnung von 0,5-1 x 1011 Viruspartikeln von AAV1-U7 in 700 l warmer Differenzierungsmedien, ergänzt durch Doxycyclin.
    HINWEIS: Wir verwenden qPCR, um die Viruskonzentration zu bestimmen. Die Menge des zu verwendenden Virus kann je nach Quantifizierungsmethode variieren und sollte zuvor mit hilfe eines Reporter-Assays bestimmt werden.
  3. Fügen Sie die virale Mischung in den Brunnen, indem Sie es homogen fallen.
  4. Am nächsten Tag 1,3 ml warme Differenzierungsmedien hinzufügen, die mit Doxycyclin ergänzt werden.
  5. Sammeln Sie die Zellen mindestens drei Tage später für die RNA-Extraktion oder sieben bis 21 Tage im Falle einer Proteinanalyse.

7. RNA-Extraktion

HINWEIS: Das gesamte Material, das in diesem Schritt verwendet wird, sollte RNase frei sein.

  1. Fügen Sie 500 l TRIzol pro Pellet und Pipet mehrmals nach oben und unten hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen lysiert werden.
  2. Übertragen Sie das Zelllysat in einem 1,5 ml Rohr und inkubiert für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. 100 L Chloroform hinzufügen und für 15 s manuell schütteln. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Sammeln Sie die wässrige Phase (obere) und übertragen Sie sie auf ein neues 1,5 ml Rohr.
  5. Für 1 Volumen der wässrigen Phase 1 Volumen Ethanol 100% hinzufügen und durch Pipettieren mischen.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Kolonnenreinigung und -konzentration.
  6. Übertragen Sie die Probe in eine Zymo-Spin IC-Säule in einem Sammelrohr und einer Zentrifuge bei 12.000 x g für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  7. Für die in-column DNase I Verdauung, waschen Sie die Säule mit 400 l RNA Wash Buffer. Zentrifuge bei 12.000 x g für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  8. Bereiten Sie 40 l DNase-Reaktionsmix pro Probe vor. Mischen Sie 5 L DNase I mit 35 L DNA-Verdauungspuffer.
  9. Fügen Sie die Mischung direkt zur Spaltenmatrix hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
  10. Fügen Sie der Säule 400 l RNA Prep Buffer und Zentrifuge bei 12.000 x g für 30 s hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  11. Fügen Sie der Säule 700 l RNA-Waschpuffer und Zentrifuge bei 12.000 x g für 30 s hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss.
  12. Fügen Sie der Säule 400 l RNA-Waschpuffer und Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min hinzu, um eine vollständige Entfernung des Waschpuffers zu gewährleisten. Übertragen Sie die Säule vorsichtig in ein RNase-freies 1,5 ml Rohr.
  13. Fügen Sie der Säulenmatrix 15 L nukleasefreies Wasser direkt hinzu. Inkubieren für 5 min und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 Minute.
    HINWEIS: Sammeln Sie die eluierte RNA und wenden Sie sie erneut auf die Säule an, um die Ausbeute zu erhöhen. Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 Minute.
  14. Legen Sie Proben auf Eis und quantifizieren Sie die Proben in einem Nanodrop.
  15. Proben bei -80 °C lagern.

8. RT-PCR-Analyse

HINWEIS: In diesem Schritt stellen wir einen Vorschlag von Reagenzien vor, um die Expression von Dystrophin mRNA zu erkennen, aber es kann leicht an andere Reagenzien der Wahl angepasst werden.

  1. Umgekehrte Transkription
    1. Alle Reagenzien auftauen und auf Eis halten.
    2. Bereiten Sie eine Mischung mit 4 l 5x Reaktionspuffer, 2 l dNTP Mix (10 mM), 1 l RiboLock RNase Inhibitor und 1 l RevertAid RT vor.
    3. Mischen Sie das Rohr sanft und Zentrifuge kurz.
    4. In 0,2 ml PCR-Röhren das ausreichende RNA-Volumen hinzufügen, um 1 g pro Reaktion zu haben. Fügen Sie nukleasefreies Wasser q.s.p 12 l hinzu. Fügen Sie eine Röhre ohne die umgekehrte Transkriptase als Negativkontrolle und eine Röhre mit nukleasefreiem Wasser anstelle von RNA hinzu.
    5. Verteilen Sie 8 l Reaktionsmischung pro Tube. Das Gesamtvolumen beträgt 20 L.
    6. Rohre in einen Thermocycler geben und 5 min bei 25 °C inkubieren, gefolgt von 60 min bei 42 °C. Stoppen Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 5 Minuten.
    7. Legen Sie die Rohre auf Eis oder bei -20 °C für längere Lagerung.
  2. Pcr
    HINWEIS: Design-Primer an exons-Kreuzungen vorzugsweise.
    1. Vortex-Reagenzien und Spin-down vor der Verwendung.
    2. Bereiten Sie einen Master-Mix mit 0,5 l Vorwärtsgrundierung (25 ,M), 0,5 l Reverse Primer (25 'M), 12,5 'L 2x PCR Master Mix und 8,5 l nukleasefreies Wasser pro Probe vor.
    3. Aliquot 22 l Master-Mix in eine Röhre für jede Probe.
    4. Fügen Sie dem jeweiligen PCR-Röhrchen 3 l cDNA (150 ng) hinzu. Fügen Sie dem PCR-Negativkontrollrohr 3 L nukleasefreies Wasser hinzu.
    5. Wirbel und drehen Sie die PCR-Röhren herunter.
    6. Inkubieren Sie die Rohre in einem Thermocycler bei 95 °C für 3 min, 95 °C für 30 s, (Tm-5) °C für 30 s, 72 °C für (1 min/kb) 34 mal, 72 °C für 5 min.
      HINWEIS: Die optimale Glühtemperatur kann empirisch bestimmt werden. Subtrahieren Sie für den vorgeschlagenen Master-Mix 5 °C von der Grundschmelztemperatur.
    7. 12 l der PCR-Reaktion auf ein Agarose-Gel laden und die Proben bei -20 °C einfrieren.

9. Nachweis der Dystrophinexpression durch Western Blotting

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für Dystrophin, ein großes Membranprotein, optimiert. Für verschiedene Proteine können besondere Bedingungen erforderlich sein.

  1. Proteinextraktion
    1. Sammeln Sie nach 7-21 Tagen der Differenzierung Zellen mit 5 ml PBS mit 100 l 0,5 M EDTA und 50 L Proteaseinhibitoren. Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen. Zentrifuge bei 1.200 x g für 5 min bei 4 °C. Fangen Sie das Pellet ein, indem Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff tauchen. Lagern Sie das Pellet bei -80 °C oder fahren Sie mit dem Lyseschritt fort.
    2. Bereiten Sie den Lysepuffer vor, indem Sie 1 % Digitonin, 1% Proteasehemmer, 10% Phosphatase-Inhibitor und Basispuffer zum Gesamtvolumen (60 l pro Zellpellet) hinzufügen.
    3. Fügen Sie dem Zellpellet auf Eis 60 L Lysepuffer hinzu. Beschallung für 5 s. Lassen Sie auf dem Eis für 8 s sitzen. Wiederholen Sie die Beschallung und ruhen Sie Schritte zweimal.
    4. Inkubieren Sie Proben auf Eis für 30 min.
    5. Zentrifuge bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C.
    6. Übertragen Sie den Überstand auf saubere Rohre.
    7. Quantifizieren Sie Proben durch Bicinchoninsäure (BCA) Assay, nach Herstelleranweisungen.
    8. Mischen Sie die Proteinlösung mit dem entsprechenden Volumen des Laemmli-Puffers. Machen Sie Aliquots von 100 g. Stellen Sie bei Bedarf die Lautstärke mit Basislysepuffer auf 25 l ein. Proben bei -80 °C lagern.
  2. Western Blotting
    1. Tauproben auf Eis auftauen.
    2. Die Proben bei 100 °C für 5 min denaturieren, dann im Eis abkühlen, abdrehen.
    3. Verdünnen Sie den 20X Tris-Acetat SDS Laufpuffer in 200 ml dH2O und fügen Sie 500 L Antioxidans hinzu.
    4. Bereiten Sie das 3-8% Trisacetat Polyacrylamid-Gel vor, indem Sie den Kamm entfernen und mit dH2O spülen. Das Gel im Elektrophoresegerät montieren. Füllen Sie die Innenkammer mit einem Laufpuffer.
    5. Laden Sie 5 l Proteinleiter und 25 l Probe in das Gel. Füllen Sie die äußere Kammer mit einem Laufpuffer.
    6. Laufen Sie bei 80 V für 1 h bei 4 °C. Dann bei 120 V für 2 h bei 4 °C.
    7. Bereiten Sie 3 L 1X Transferpuffer mit 150 ml 20X Methanol, 150 ml 20X Transferpuffer und 2.700 ml dH2O vor. Abkühlen auf 4 °C.
    8. Schneiden Sie 4 Stück Filterpapier und ein Stück Nitrocellulosemembran. Den Papierfilter und die Membran in einem Fach mit Transferpuffer einweichen.
    9. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Gehäuse und montieren Sie es im Transfergerät mit Filterpapier, Membran und Schwämmen. Das Gel wird auf der negativen Seite und die Membran auf der positiven Seite platziert.
    10. Run Transfer bei 300 mA, rührend, bei 4 °C, über Nacht.
    11. Blockieren Sie die Membran in 10 ml Sperrpuffer für 1 h mit sanfter Rührung bei Raumtemperatur.
    12. Bereiten Sie primäre Antikörperlösung mit 10 ml Blockierpuffer und 50 l Dystrophin-Antikörper (1:200) vor.
    13. Verwerfen Sie den Blockierungspuffer, und fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu. Mit sanfter Rührung mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    14. Spülen Sie die Membran dreimal mit 0,1% Tween PBS, für 5 min mit sanfter Rührung.
    15. Bereiten Sie sekundäre Antikörperlösung mit 10 ml Blockierlösung, 2 l Anti-Kaninchen-Antikörper (1:5000) und 20 l mit 0,2% Tween vor.
    16. Fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung in die Membran ein. Inkubieren Sie für 1 h mit sanfter Erregung, mit Aluminiumfolie bedeckt, um vor Licht zu schützen.
    17. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie die Membran 3 Mal mit 0,1% Tween PBS, für 5 min mit sanfter Rührung, vor Licht geschützt.
    18. Belichtung und Abbild der Membran auf einem Bildgebungsgerät.
    19. Färben Sie die Membran für das Gesamtprotein mit Revert 700 Total Protein Fleck, nach Herstelleranweisungen.
      HINWEIS: Die Dystrophin-Erkennung durch Western-Blotting hängt vom Alter/der Mutation des Patienten und der Fähigkeit der Zelle ab, zu verschmelzen und genügend Zeit zu haben, um genügend Dystrophin anzusammeln.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll zeigt, wie man menschliche, hautabgeleitete Fibroblastenkulturen etabliert und in Myoblasten und dann in differenzierte Myotuben umwandelt. Diese Art von Zelllinie ist äußerst nützlich für die Untersuchung von neuromuskulären Störungen und In-vitro-Tests von potenziellen Therapien.

Eine schematische Darstellung der Fibroblastenkonvertierung ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2A zeigt ein Hautfragment un...

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Diskussion

Um FM-Zelllinien mit guter Qualität zu erhalten, sind einige Schritte entscheidend. Je früher die Hautbiopsie verarbeitet wird, desto größer sind die Chancen, gesunde Fibroblasten zu erhalten. Wichtig ist auch die Durchgangszahl der Fibroblastenkulturen. Primärzellen haben eine begrenzte proliferative Kapazität und treten nach vielen Passagen in reproduktiver Seneszenz ein. Daher ist es besser, einen Vorrat an Fibroblasten bei einer niedrigen Durchgangszahl zu haben und Zellen so schnell wie möglich zu transformieren.

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Offenlegungen

Nationwide Children es Hospital hat das hier beschriebene exon 2-Skipping-Programm an Audentes Therapeutics lizenziert. K.M.F. und N.W. haben aufgrund dieser Lizenz Lizenz Lizenzgebühren erhalten.

Danksagungen

Wir danken Dr. Vincent Mouly für den Austausch seines Wissens in der Vergangenheit in Bezug auf das Modell. Diese Arbeit wurde vom US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., und R.B.W.)), das US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., und N.W.). N.W. wurde von der Ohio State University/Nationwide Children es Hospital Muscle Group und der Philippe Foundation unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch interne Diskretionsfonds unterstützt und ein Teil der exon 2-Überspringarbeit wurde auch von CureDuchenne (K.M.F.) und Association Francaise Contre Les Myopathies unterstützt. IRB-Nummer: IRB10-00358/ CR00005138 und IBCSC-Nr.: IBS00000123.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm SchaleCorning430167
0,25 % Trypsin-EDTA, PhenolrotThermo Fisher2500056
10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Fisher ScientificBP3994
12-Well-PlatteCorning3513
20X TransferpufferThermo FisherNP00061
20X Tris-Acetat SDS LaufpufferThermo FisherLA0041
3-8% Tris-Acetat-GelThermo FisherEA0378BOX
75 cm2 KolbenCorning430641U
Antibiotikum-Antimikotikum 100XThermo Fisher15240062
Anti-Myosin schwerkettig, Sarkomer AntikörperEntwicklungsstudien Hybridome BankMF20 ÜberstandVerdünnung 1:50
AntioxidationsmittelThermo FisherNP0005
BCA Protein AssayThermo Fisher23227
ChloroformSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Verdünnung 1:1000
DigitoninMillipore Sigma300410250MG
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2438
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX-Ergänzung, PyruvatThermo Fisher10569044
DNAse I set (250U)Zymo Research CorporationE1010
DoxycyclinhydrochloridFisher ScientificBP2653-5
Dup2 humane PrimerFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTCC
CTGT
Abcamab15277Verdünnung 1:200
Fötales RinderserumThermo Fisher16000
GlycinSigma-AldrichG8898
Ziege Anti-Maus, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Verdünnung 1:1000
Halt Proteasehemmer Cocktail 100XThermo Fisher78430
HämozytometerHausser Scientific3100
Hygromycin BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD Ziegen Anti-Kaninchen IgG (H+L)Li-Cor926-68071Verdünnung 1:5000
Lab-Tek II CC2 Kammer-ObjektträgersystemThermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamine 3000 TransfektionsreagenzThermo FisherL3000008
Matrigel GFR-MembranmatrixCorning354230
MethanolFisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty GefrierbehälterThermo Fisher51000001
Nitrozellulosemembran 0,45 µ mGE Healthcare Life Sciences10600002
Normales Ziegenserum KontrolleThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Blocking Buffer for Western Blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PCR-MastermixThermo FisherK0172
Phosphatase-InhibitorThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Gesamtproteinfleck für Western-Blot-NormalisierungLi-Cor926-11021
RevertAid KitThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrator-25Zymo Research CorporationR1018
SkalpelleAspen Surgical372611
Skelettmuskelzell-DifferenzierungsmediumPromocellC23061
SkelettmuskelzellwachstumsmediumPromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
TRIzol-ReagenzThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
UltratiefkühlschrankThermo Scientific7402
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Vectashield Eindeckmedium mit LichtschutzVector LabsH1000
3'Dystrophin-Antikörper

Referenzen

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Fibroblasten ReprogrammierungMyoblasten Differenzierunglentivirale TransduktionhTERT ImmortalisierungMYOD InduktionDoxycyclin BehandlungMyotubenbildungHautbiopsie

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