Summary
يصف هذا البروتوكول تحويل الخلايا الليفية الجلدية إلى خلايا myoblasts وتمايزها إلى ميوتوب. وتستمد خطوط الخلية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية ويمكن استخدامها للتحقيق في الآليات المرضية واختبار الاستراتيجيات العلاجية.
Abstract
وقد أعاقت التحقيقات في كل من علم الفيزيولوجيا المرضية والأهداف العلاجية في dystrophies العضلات القدرة التكاثرية المحدودة من myoblasts الإنسان. وقد تم إنشاء عدة نماذج الماوس لكنها إما لا تمثل حقا فيزيولوجيا المرض البشري أو لا تمثل الطيف الواسع من الطفرات الموجودة في البشر. تخليد myoblasts الإنسان الأساسي هو بديل لهذا القيد; ومع ذلك، فإنه لا يزال يعتمد على خزعات العضلات، والتي هي الغازية وليس من السهل المتاحة. في المقابل، خزعات الجلد هي أسهل للحصول على وأقل الغازية للمرضى. يمكن تخليد الخلايا الليفية المشتقة من خزعات الجلد وتمايزها في الخلايا العضلية ، مما يوفر مصدرًا للخلايا ذات الإمكانات الميوجينية الممتازة. هنا ، ونحن وصف سريع وطريقة إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية في النسب ميوجيني. يتم نقل الخلايا الليفية مع اثنين من الفيروسات العدسية: hTERT لتخليد الثقافة الأولية و MYODtet-inducible ، والتي عند إضافة doxycycline ، تحفز على تحويل الخلايا الليفية إلى myoblasts ثم تنضج myotubes ، والتي تعبر عن علامات التمايز المتأخر. يمثل هذا البروتوكول السريع للتمايز أداة قوية للتحقيق في الآليات المرضية والتحقيق في العلاجات الحيوية المبتكرة المستندة إلى الجينات أو الأدوية للاضطرابات العصبية العضلية.
Introduction
النماذج الخلوية التي تم الحصول عليها مباشرة من الأنسجة البشرية مفيدة في نمين العديد من الاضطرابات الوراثية البشرية ، مع ميزة وجود السياق الجيني الأصلي ، وفي كثير من الحالات ، استنساخ نفس السمات الجزيئية والخلوية التي لوحظت في المرضى. في مجال الاضطرابات العصبية العضلية ، كانت خزعات العضلات مصدرًا كبيرًا للعضات العضلية البشرية وساعدت في توضيح الآليات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، فهي أداة هامة لاختبار في الجسم الحي من الأدوية والعلاجات الجينية. من ناحية ، اشتقاق myoblasts من شظايا العضلات من السهل نسبيا. من ناحية أخرى ، فإن ثقافة وصيانة myoblasts الأولية هي صعبة ، وذلك بسبب معدل انتشارها المحدود وssescence تكرار في المختبر1. بديل لهذه القيود هو تخليد myoblasts مع إدخال التيلوميراز البشري(hTERT)و / أو كيناز cyclin تعتمد 4(CDK4)الجينات2,3, مع الحفاظ على ملامح العضلات الهيكل العظمى4. ومع ذلك ، فإن منبع myoblasts الأولية لا يزال يعتمد على خزعة العضلات ، وهو إجراء جراحي مع مساوئ للمرضى ، والتي ، في كثير من الحالات ، وعضلاتها في انحطاط المتقدمة. وهكذا، والعضلات من هؤلاء المرضى يتكون من نسبة كبيرة من الأنسجة الدهنية وتليفي و/ أو، وغلة خلايا العضلات أقل، مما يتطلب تنقية الخلايا سابقا إلى تخليد.
على النقيض من خزعات العضلات ، فإن خزعات الجلد أكثر سهولة وأقل ضررًا للمرضى. يمكن أن تستمد الخلايا الليفية الأولية من شظايا الجلد في المختبر. على الرغم من أن الخلايا الليفية لا تتأثر في المقام الأول بالطفرات التي تسبب اضطرابات عصبية عضلية ، إلا أنه يمكن تقسيمها إلى myoblasts. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إدراج جين Myod، وهو عامل نسخ تنظيمي5. في هذه المخطوطة، نحن وصف بروتوكول للحصول على myoblasts عبر مختلفة، من إنشاء الثقافات الخلايا الليفية إلى منبرات myotubes مختلفة (يتم وصف ملخص تمثيلي للأسلوب في الشكل 1).
ويعتمد الاختبار السريري قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية على النماذج الخلوية والحيوانية التي تحمل طفرات مماثلة للطفرات الموجودة في المرضى البشريين. على الرغم من أن تطوير النماذج الحيوانية أصبح أكثر جدوى مع تقدم تقنيات تحرير الجينات مثل CRISPR/Cas96، إلا أنه لا يزال صعبًا ومكلفًا. وهكذا، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض هي خيار يمكن الوصول إليه للحصول على نماذج، تغطي الطيف الكبير من طفرات المرض مثل ضمور العضلات دوشين (DMD). إن عنتع وإنشاء نماذج الخلايا أمران حاسمان لتطوير العلاجات الشخصية لمثل هذه الأمراض.
بين العلاجات الشخصية التي تم التحقيق فيها، exon تخطي الاستراتيجيات هي واحدة من تلك الواعدة لdystrophies العضلات المختلفة7،8. تتكون هذه الاستراتيجية من إنتاج بروتين أقصر ولكن وظيفية. يتم تنفيذ هذا عن طريق إخفاء تعريف exon إلى الجُزَم ، وبالتالي استبعاد إكسون المتحول من الرسول النهائي. هذه هي التكنولوجيا الواعدة جدا التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير لDD. وهكذا، فإننا أيضا وصف في هذا البروتوكول، وأساليب لعابنة الأجهزة myoblasts مع اثنين من خارج مختلفة تخطي التكنولوجيات ذات الصلة: oligonucleotides المضادة للانكارين (AON) و U7snRNA-أدينو المرتبطة بالفيروس (AAV). AON transfection هو أداة جيدة للفحص الأولي لعدة تسلسلات تهدف إلى تعزيز exon تخطي9. ومع ذلك، فإن نشاط الـ AONs عابر. للحصول على تعبير مستمر من تسلسل antisenses، ونحن أيضا استكشاف RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) جنبا إلى جنب مع AAV، والسماح توطين النووية وإدراجها في آلية الربط10. U7 هو سنرنا تشارك في معالجة المرنا المرنا الحجر البشري التي يمكن هندستها لربط البروتينات التي سوف تعيد توجيهها إلى spliceosome وتقديم تسلسل antisense11. استخدام تعديل U7 snRNAs في تركيبة مع ناقلات AAV يتغلب على القيود المفروضة على AONs مما أدى إلى استمرار التعبير عن AONs وأفضل نقل الأنسجة ذات الأهمية12. نحن نستخدم الخلايا المستمدة من مرضى DMD لهذا البروتوكول لتوضيح استراتيجية تخطي exon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
100- وأجريت جميع التجارب والخزعات باتباع القواعد الأخلاقية للمؤسسات المعنية بموافقة مجلس الاستعراض المؤسسي لمستشفيات الأطفال على الصعيد الوطني.
1. بدء ثقافة الخلايا الليفية الجلدية
- إنشاء ثقافة الخلايا الليفية
- Aliquot 10 مل من الوسط الليفي(الجدول 1)في 15 مل أنابيب المخروطية. يجب وضع خزعة الجلد ونقلها في هذه الوسيلة. يمكن تخزين الخزعة في 4 درجة مئوية حتى تتم معالجتها ، بشكل تفضيلي في نفس اليوم.
ملاحظة: استخدم خزعة الجلد في غضون 24-36 ساعة لتجنب النمو المحتمل للتلوث. - استلهمي وسائل الإعلام من الأنبوب وشطف الخزعة بـ 10 مل 1X PBS (درجة حرارة الغرفة) ثلاث مرات. بعد الغسيل الثالث، اترك برنامج تلفزيوني في الأنبوب.
- صب خارج برنامج تلفزيوني والجلد على طبق 10 سم2.
- باستخدام مشرط عقيمة، وقطع خزعة إلى أصغر شظايا ممكن.
- باستخدام ماصة، نقل جزء الجلد الفردية وإسقاطه في طبق نظيف 10 سم2. مكان 10 إلى 12 شظايا في الطبق الواحد.
- التعرق الزائد من برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء كل جزء. كن حذراً لعدم التعرق في الجزء.
- غطي الأطباق جزئياً بالغطاء واسمح لشظايا الجلد بالجفاف لمدة 5-20 دقيقة. لا تسمح للشظايا بالجفاف بشكل مفرط.
- مرة واحدة في شظايا جافة، إمالة الطبق في 45 درجة، وإضافة ببطء 12 مل من المتوسطة الليفية إلى الزاوية. خفض أسفل الطبق، وتوزيع وسائل الإعلام بعناية حتى لا ترفع شظايا من قبل وسائل الإعلام.
- ضع الأطباق في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). استبدال وسائل الإعلام في 5-7 أيام، ومرة واحدة في الأسبوع بعد.
- مراقبة الخلايا الليفية الناشئة عن جزء (الشكل 2) و, مرة واحدة التقاء, مرور الخلايا في 75 سم2 قارورة. إزالة المتوسطة، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل 0.25 ٪ التربسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يتم رفع جميع الخلايا. إضافة 10 مل الليفية المتوسطة النمو لمنع التربسين ونقل الخلايا إلى قارورة جديدة.
ملاحظة: بالنسبة لعدد الممرات، يتم تأسيس P1 عندما يتم نقل الخلايا الليفية الأولى التي ظهرت من خزعة الجلد إلى قارورة جديدة للانتشار.
- Aliquot 10 مل من الوسط الليفي(الجدول 1)في 15 مل أنابيب المخروطية. يجب وضع خزعة الجلد ونقلها في هذه الوسيلة. يمكن تخزين الخزعة في 4 درجة مئوية حتى تتم معالجتها ، بشكل تفضيلي في نفس اليوم.
- الحفظ بالتبريد لخطوط الخلايا الليفية الأولية
- مرة واحدة في 75 سم2 قارورة هو التقاء، شطفه مع 10 مل 1X PBS وpirentate برنامج تلفزيوني.
- إضافة 3 مل من 0.25 ٪ التربسين إلى سطح الخلية. ضع القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تحقق من القارورة تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد تم رفعها. إذا لم يكن كذلك، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
- مرة واحدة يتم فصل الخلايا، إضافة 7 مل من الوسائط الليفية إلى القارورة والماصات صعودا وهبوطا لإعادة تعليق الخلايا. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل.
- إعداد 100 ميكروغرام من الأزرق trypan، وإزالة 100 μL من العينة التي يتم cryopreserved، وخلط مع الأزرق trypan. تحميل المزيج على قياس الهيموسيتاتل العد. عد الخلايا في أربعة مجالات مختلفة من مقياس الهيموسيت تحت المجهر. لحساب العدد الإجمالي للخلايا، استخدم الصيغة: (خلايا محسوبة/100) * حجم الثقافة.
- تدور أنابيب المخروطية في 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 4 °C.
- التعرق قبالة المتوسطة و resuspend الخلايا في حجم كافية من تجميد المتوسطة: 1 مل لكل 1 مليون خلية / قارورة. الماصات صعودا وهبوطا لتجانس وتوزيع 1 مل على كل كريوفيال المسمى.
- ضع القنينات في صندوق التجميد، واسمح للقارورة بالتجميد بمعدل 1 درجة مئوية/دقيقة عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي نقل قوارير إلى خزان النيتروجين السائل أو -150 درجة مئوية الفريزر.
2. إنشاء خط الخلايا فيبروميابلاستس (FM)
- بذور الخلايا الليفية الأولية في حوالي 30٪ من التقاء في اثنين من الآبار من لوحة 12-well (2 × 104 خلايا / جيدا) من أجل الحصول على حوالي 50٪ من التقاء في اليوم التالي.
- بالنسبة إلى تحويل الألياف الليفية، أضف 2 إلى 5 × 109 vg (جزيئات الجينوم الفيروسي) من فيروس العدس hTERT-puromycin في 400 ميكرولتر من الوسط الليفي. إلى البئر الثاني، أضف فقط 400 ميكرولتر من الوسط الليفي. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام في اليوم التالي.
ملاحظة: تم الحصول على Plasmids لإنتاج فيروس العدس من المجموعة التي نشرت Chaouch et al،ورقة 2009. كما أنها وصفت بشكل فردي في أور وآخرون, 200713 لht plasmid و باردي وآخرون ,200614 لنظام Tet-on المستخدمة لتصميم ميود بلاسميد. وقد تم الحصول عليها بفضل اتفاقية نقل المواد مع جينثون، فرنسا (يرجى الاتصال الدكتور فنسنت مولي للحصول على هذه البلازميدات - vincent.mouly@upmc.fr). باختصار، يتكون hTERT من البديل hTERT 1 التي يقودها المروج CMV بينما يتم دفع البوسوميسين من قبل المروج PGK. يحتوي MyoD plasmid على متغير ميود 1 مدفوعًا بمروج CMV تحت سيطرة المكبوت rtTA2. هذا البلازميد يحتوي أيضا على اختيار الهيغروميسين أعرب عن الشكر إلى المروج SV40.
تم إنتاج الفيروسات العدسية باستخدام إنتاج العدسي الفيروسية العادية (انظر بروتوكول وانغ وماكمانوس جوف15). لفترة وجيزة، MDL-المساعد، القس مساعد، SVS-G-المساعد كانت مصابة عبر كلوريد الكالسيوم هطول الأمطار أيضا من htert أو MyoD plasmids. بعد 48 ساعة، تم جمع المناط، ثم لمدة ثلاثة أيام إضافية. ثم تم تركيز جميع المناذرين عن طريق الطرد المفرط. ثم أعيد تعليق البيليه في مخزن Tris-HCL +NaCl+EDTA. تم تقييم تقدير تيتر من قبل معيار العدس qPCR المقايسة. - بعد يوم أو يومين، نقل الخلايا إلى لوحة 6-جيدا وتنمو حتى تصل إلى التقاء 60-70٪.
- تكملة المتوسطة الليفية مع 1 ميكروغرام / مل من البورومايسين وإضافة 2 مل لكل بئر.
- إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة جيدا ميتة (تصل إلى 12 يوما)، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. عبور الخلايا من لوحة 6-جيدا في اثنين من 10 سم2 أطباق لمزيد من الانتشار.
- تجميد قوارير الخلايا الليفية بعد الاختيار. تسمية كـ F (hTer).
- البذور hTERT التعبير عن الخلايا الليفية (F(hTer)) في حوالي 30٪ التقاء في المتوسطة الليفية، في بئرين من لوحة 12-جيدا، أن يكون حوالي 50٪ التقاء في اليوم التالي.
- بالنسبة لعملية تحويل الفيروسة العدسية، اخلط 2 إلى 5 × 109 vg من فيروس العدس ميو دي-هيغروميسينب في 400 ميكرولتر من الوسط الليفي وإضافة إلى الآبار المعنية؛ إلى بئر ثالثة يضيف 400 ميكرول فيليبلاست وسط. إضافة 1 مل من المتوسط في اليوم التالي.
- بعد يوم أو يومين نقل الخلايا إلى لوحة 6-جيدا وتنمو حتى 60-70٪ التقاء.
- تكملة المتوسطة نمو الخلايا الليفية مع hygromycin B (400 ميكروغرام / مل) وإضافة 2 مل لكل بئر.
- إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة جيدا ميتة (تصل إلى 12 يوما)، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
- تجميد قوارير الخلايا الليفية بعد الاختيار. تسمية FM متبوعة برقم/اسم تعريف الخلية.
3. بروتوكول التغاير
- البذور التي تم نقلها FM على 10 سم2 أطباق مع التقاء 30-40٪. في لوحة 12-جيدا، بذرة 6 × 104 الخلايا (وهذا يعتمد على خط الخلية الفردية).
ملاحظة: بالنسبة للمناعة، خلايا البذور على أغطية الزجاج أو شرائح الغرفة المغلفة Matrigel. تميّف Matrigel في الساعة 1:10 في متوسطة DMEM، أضف حجمًا يكفي لتغطية السطح، ودع الشرائح تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. التعرق قبالة الحق قبل بذر الخلايا. - لsyoblasts التعريفي, عندما وصلت الخلايا الليفية 70٪ التقاء(الشكل 3A),شطف سطح الخلية مع برنامج تلفزيوني وإضافة وسائل الاعلام myoblast الطازجة تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل doxycline.
ملاحظة: نجاح التمايز هو للخطر الماضي 80٪ التقاء. - بعد يومين إلى ثلاثة أيام في وقت لاحق، والخلايا هي 90-95٪ التقاء وmorphology الخاصة بهم سوف تتغير (الشكل 3B). شطف سطح الخلية مع برنامج تلفزيوني وإضافة وسائل الاعلام تمايز جديدة تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل doxycycline.
- الاستمرار في تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام دون passaging حتى يتم تأسيس myotubes (تأكيد عبر مورفولوجيا) (الشكل 3C).
- سبعة إلى عشرة أيام بعد بدء التمايز myotube، يجب أن تكون الخلايا متمايزة تماما، ويمكن أن تبدأ في فصل أو يموت. قبل أن يحدث هذا، حصاد myotubes لمزيد من التحليل.
ملاحظة: يعتمد الوقت دورة تشكيل ميوتوب على خط الخلية. قد تتداخل الطفرات في البروتينات المرتبطة بالعضلات في إمكانية الميوجينية. عندما تبدأ myotubes تظهر مشرقة وتبدو بيضاء على الحدود هو إشارة أنها بدأت في فصل (الشكل 4). - لحصاد myotubes، وجمع وسائل الإعلام ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. قد تحتوي الوسيطة على شتّى الالوتوب التي تم فصلها.
- شطف myotubes مع 5 مل PBS ونقل برنامج تلفزيوني إلى أنبوب 50 مل.
- إضافة 3 مل من 0.25 ٪ التربسين إلى سطح الخلية. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تحقق من الطبق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد رفعت. إذا لم يكن كذلك، وضعه مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
- مرة واحدة يتم فصل الخلايا، إضافة 7 مل من الوسائط الليفية إلى الطبق والماصات صعودا وهبوطا لإعادة توزيع الخلايا. جمع الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي عند 1200 x ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- pirate بعناية قبالة السائل، دون إزعاج بيليه. تخزين الكريات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
4. المناعة من ميوتيوبات مختلفة
ملاحظة: بالنسبة إلى الكبت المناعي، يمكنك زراعة الخلايا في أغطية الزجاج أو شرائح الحجرة كما هو مذكور أعلاه.
- مرة واحدة يتم تمييز myotubes تماما، وpirate قبالة وسائل الإعلام وشطف بعناية الشرائح مع برنامج تلفزيوني. الطامح برنامج تلفزيوني قبالة.
- إضافة 4٪ PFA الطازجة (500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 12-well) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. التعرق PFA قبالة.
- شطف مع 1 مل PBS.
- احتضان مع 0.2 M الجليسين في درجة حرارة الغرفة، لمدة 10 دقيقة. البيربيرات الجليسين قبالة.
- Permeabilize مع برنامج تلفزيوني 0.5٪ TritonX-100 (300 ميكرولتر / بئر من لوحة 12-well)، لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف.
- كتلة مع 300 ميكرولتر /جيدا من حظر الحل، لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف 1:50 في 300 ميكرولتر من محلول الحجب، لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز لطيف.
- شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، مع اهتزاز لطيف.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1:500 في 300 ميكرولتر من محلول الحجب، لمدة ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز لطيف. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم.
- شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، مع اهتزاز لطيف.
- احتضان مع DAPI المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني.
- إضافة قطرة من متوسطة التركيب إلى شريحة زجاجية. إزالة غطاء مع ملقط ووضعها على وجهه إلى أسفل على قطرة من المتوسط المتصاعد.
- عكس الشريحة على منشفة ورقية واضغط بلطف لإزالة فقاعات والإفراط في تركيب المتوسطة.
- ختم الشرائح مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى التصوير.
5. Antisense oligonucleotide transfection
ملاحظة: البروتوكول أدناه هو لtransfection من لوحة 6-جيدا. قم بضبط وحدات التخزين وفقًا لذلك للوحات أصغر أو أكبر. يتم نقل في 100٪ التقاء myoblasts عندما تكون الخلايا جاهزة لخطوة التمايز.
- pirate وسائط النمو myoblast وشطف الخلايا مع 1 مل PBS.
- إضافة 500 ميكرولتر /بئر من وسائل الاعلام OptiMEM واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تخفيف oligonucleotide المضادة للsense (AON) في 100 ميكرولتر من OptiMEM إلى التركيز النهائي المطلوب (أي 50 ن م، 100 NM، 200 NM، 500 nM). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول ل 2'omethyl-فوسفوروثيوات AONs. - اخلطي الدهون مع OptiMEM (الحجم النهائي 100 ميكرولتر) لإعطاء نسبة نهائية من 1:1 (ميكروغرام الحمض النووي: μL ليبوميكتامين). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين ليبووليكتامين المخفف مع AON المخفف. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح تشكيل معقدة. تجنب فقاعات الهواء.
- أضف 200 ميكرولتر من الدهون والليفية ومزيج AON إلى الآبار المعنية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- في اليوم التالي إزالة مزيج transfection وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام التمايز الدافئة تكمل مع doxycycline.
- جمع الخلايا على الأقل ثلاثة أيام في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الريبي أو 7-21 يوما في حالة تحليل البروتين.
ملاحظة: قد تختلف أيام التمايز اللازمة للكشف عن RNA و/أو التعبير البروتيني وفقًا للجين الذي يهمك أو خط الخلية. في حالة DMD، من الممكن الكشف عن مرنا في غضون ثلاثة أيام. اكتشاف بروتين دستروفين يتطلب سبعة أيام على الأقل. هذا سوف تختلف تبعاً لخط الخلية. يمكن أن تؤثر التركيزات العالية من AON ومكشف نقل الملوثات على التفّاثر.
6. AAV1-U7 النقل
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للوحات 6-جيداً. اضبط وحدات التخزين بشكل متناسب مع مساحة السطح الثقافي. يتم نقل في 100٪ التقاء myoblasts عندما تكون الخلايا جاهزة لخطوة التمايز. AAV1 هو النمط المصلي AAV مع أفضل قدرة نقل myoblasts المستزرعة.
- التعرق قبالة متوسطة نمو myoblast وشطف الخلايا مع 1 مل PBS.
- تمييع 0.5-1 ×10 11 جزيئات فيروسية من AAV1-U7 في 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز الدافئة تكمل مع doxycycline.
ملاحظة: نحن نستخدم qPCR لتحديد التركيز الفيروسي. قد تختلف كمية الفيروس المستخدم وفقًا لطريقة القياس الكمي ويجب تحديدها مسبقًا باستخدام مقايسة المراسل. - إضافة مزيج الفيروسية إلى البئر عن طريق إسقاطه متجانس.
- في اليوم التالي، إضافة 1.3 مل من وسائل الإعلام التمايز الحارة تكمل مع doxycycline.
- جمع الخلايا على الأقل ثلاثة أيام في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الريبي أو 7 إلى 21 يوما في حالة تحليل البروتين.
7. RNA استخراج
ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة أثناء هذه الخطوة مجانية RNase.
- إضافة 500 μL من TRIzol لكل بيليه و pipet صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان أن الخلايا متجانسة lysed.
- نقل الخلية lysate في أنبوب 1.5 مل ومحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100 μL من الكلوروفورم ويهز يدويا لمدة 15 s. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- جهاز طرد مركزي عند 12000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية. جمع المرحلة مائي (أعلى واحد) ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
- 1 حجم من المرحلة مائي، إضافة 1 حجم الإيثانول 100٪ ومزيج عن طريق الأنابيب.
ملاحظة: نوصي بتنقية العمود وتركيزه. - نقل العينة إلى عمود Zymo-Spin IC في أنبوب جمع وطاردة مركزية عند 12,000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
- بالنسبة للديناس DNase I في العمود ، قم بغسل العمود مسبقًا مع 400 ميكرولتر RNA Wash Buffer. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
- إعداد 40 ميكرولتر من مزيج التفاعل DNase لكل عينة. مزيج 5 μL DNase الأول مع 35 ميكرولتر الحمض النووي الهضم العازلة.
- إضافة مزيج مباشرة إلى مصفوفة العمود. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 400 μL RNA الإعدادية العازلة إلى العمود والطرد المركزي في 12000 × ز لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
- أضف 700 ميكرولتر RNA Wash Buffer إلى العمود والطرد المركزي عند 12000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
- أضف 400 ميكرولتر RNA Wash Buffer إلى العمود والطرد المركزي عند 12000 x g لمدة 2 دقيقة لضمان الإزالة الكاملة لمخزن الغسيل. نقل العمود بعناية إلى أنبوب 1.5mL خالية من RNase.
- إضافة 15 ميكرولتر خالية من النوى المياه مباشرة إلى مصفوفة العمود. احتضان لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في 12،000 س ز لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: جمع الجيش الملكي النيبالي مائل وتطبيقه مرة أخرى إلى العمود لزيادة العائد. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x غم لمدة دقيقة واحدة. - ضع العينات على الجليد وتحديد العينات في قطرة نانو.
- تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
8- تحليل RT-PCR
ملاحظة: في هذه الخطوة، نقدم اقتراح الكواشف للكشف عن التعبير من مرنا ديستروفين، ولكن يمكن تكييفها بسهولة إلى الكواشف الأخرى من اختيار.
- النسخ العكسي
- اذيب كل الكواشف و أبقيها على الجليد
- إعداد مزيج مع 4 ميكرولتر من 5x التفاعل العازلة, 2 ميكرولتر من dNTP ميكس (10 mM), 1 ميكرولتر من ريبولوك RNase المانع, و 1 ميكرولتر من RevertAid RT.
- اخلط الأنبوب بلطف و جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة.
- في أنابيب PCR 0.2 مل، إضافة حجم كافية من RNA من أجل الحصول على 1 ميكروغرام لكل رد فعل. أضف الماء الخالي من النوى q.s.p 12 ميكرولتر.
- توزيع 8 ميكرولتر من مزيج التفاعل لكل أنبوب. الحجم الإجمالي هو 20 ميكرولتر.
- ضع الأنابيب في ثيرموسيسير واحتضان لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية متبوعة بـ 60 دقيقة عند 42 درجة مئوية. وقف رد الفعل عن طريق التدفئة في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- ضع الأنابيب على الجليد أو في -20 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.
- PCR
ملاحظة: تصميم التمهيديات في تقاطعات exons يفضل.- فورتيكس الكواشف وتدور إلى أسفل قبل الاستخدام.
- إعداد مزيج رئيسي باستخدام 0.5 ميكرولتر إلى الأمام (25 μM)، 0.5 ميكرولتر عكسي (25 μM)، 12.5 μL 2x PCR ماجستير ميكس، و 8.5 ميكرولتر من المياه خالية من النوى لكل عينة.
- Aliquot 22 ميكرولتر من مزيج رئيسي في أنبوب لكل عينة.
- إضافة 3 ميكرولتر من cDNA (150 نانوغرام) إلى أنبوب PCR لكل منها. إضافة 3 ميكرولتر من المياه خالية من النوى إلى أنبوب التحكم السلبي PCR.
- دوامة وتدور أسفل أنابيب PCR.
- احتضان الأنابيب في ثيرموستر في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (Tm-5) درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لـ (1 دقيقة/ك.ب) 34 مرة، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يمكن تحديد درجة حرارة التلاهم الأمثل تجريبياً. بالنسبة للمزيج الرئيسي المقترح، اطرح 5 درجة مئوية من درجة حرارة ذوبان التمهيدي. - تحميل 12 ميكرولتر من تفاعل PCR على هلام agarose وتجميد العينات في -20 درجة مئوية.
9. الكشف عن التعبير عن الديستروفين عن طريق النشاف الغربية
ملاحظة: هذا البروتوكول هو الأمثل لdystrophin، وهو بروتين غشاء كبير. قد تكون هناك حاجة إلى شروط محددة للبروتينات المختلفة.
- استخراج البروتين
- بعد 7-21 يوما من التمايز، وجمع الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 100 ميكرولتر 0.5 M EDTA، و 50 ميكرولتر مثبطات البروتياز. احتضان في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 1200 x غ لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. المفاجئة تجميد بيليه عن طريق غمس الأنبوب في النيتروجين السائل. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية أو المضي قدما في خطوة تحلل.
- إعداد العازلة تحلل بإضافة 1٪ من digitonin، 1٪ مثبطات البروتياز، 10٪ مثبطات الفوسفاتيز، وقاعدة عازلة إلى حجم إجمالي (60 ميكرولتر لكل بيليه الخلية).
- إضافة 60 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى بيليه الخلية، على الجليد. سونيكات لمدة 5 s. اسمحوا الجلوس على الجليد لمدة 8 ق. كرر صوتنة والراحة الخطوات مرتين.
- عينات احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي عند 14000 x ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- نقل المناط إلى أنابيب نظيفة.
- كمي العينات من قبل حمض bicinchoninic (BCA) فحص, اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- خلط محلول البروتين مع حجم مناسب من عازلة Laemmli. جعل aliquots من 100 ميكروغرام. إذا لزم الأمر، ضبط مستوى الصوت إلى 25 ميكرولتر مع عازلة تحلل قاعدة. تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
- النشاف الغربي
- عينات ذوبان على الجليد.
- denature العينات في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبريدها في الجليد، وتدور أسفل.
- تخفيف 20X تريس خلات SDS تشغيل المخزن المؤقت في 200 مل dH2س وإضافة 500 ميكرولتر المضادة للأكسدة.
- إعداد 3-8٪ تريس-خلات هلام بولياكريلاميد عن طريق إزالة المشط والشطف مع dH2O. تجميع الجل في الجهاز الكهربائي. تعبئة الغرفة الداخلية مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
- تحميل 5 ميكرولتر من سلم البروتين و 25 ميكرولتر من العينة في الجل. تعبئة الغرفة الخارجية مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
- تشغيل في 80 V ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية. ثم، عند 120 فولت مقابل 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- إعداد 3 لتر من 1X العازلة نقل مع 150 مل من الميثانول 20X، 150 مل من 20X العازلة نقل، و 2700 مل من dH2O. تبريده وصولا الى 4 درجة مئوية.
- قطع 4 قطع من ورقة تصفية وقطعة واحدة من غشاء نيتروسيلولوز. انقع فلتر الورق والغشاء في صينية مع مخزن نقل مؤقت.
- إزالة بلطف هلام من القضية وتجميعه في جهاز نقل مع ورقة فلتر، والغشاء والإسفنج. يتم وضع الجل على الجانب السلبي والغشاء على الجانب الإيجابي.
- تشغيل نقل في 300 mA، واثارة، في 4 °C،بين عشية وضحاها.
- كتلة الغشاء في 10 مل من العازلة منع لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف، في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد حل الأجسام المضادة الأولية مع 10 مل من العازلة منع و 50 ميكرولتر من جسم ديستروفين المضاد (1:200).
- تجاهل المخزن المؤقت للحظر وإضافة حل الأجسام المضادة الأساسية. احتضان مع التحريض لطيف لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- شطف الغشاء ثلاث مرات مع 0.1٪ Tween برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف.
- إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية باستخدام 10 مل من محلول الحجب، 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة للأرنب (1:5000)، و 20 ميكرولتر من 0.2٪ توين.
- إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى الغشاء. احتضان لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف، مغطاة رقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
- تخلص من محلول الأجسام المضادة وشطف الغشاء 3 مرات مع 0.1٪ Tween PBS ، لمدة 5 دقائق مع التحريض اللطيف ، ومحمي من الضوء.
- التعرض وصورة الغشاء على جهاز التصوير.
- وصمة عار الغشاء للبروتين الكلي مع عودة 700 مجموع وصمة عار البروتين، اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: الكشف عن الديستروفين بواسطة النشاف الغربية يعتمد على عمر / طفرة المريض وقدرة الخلية على الصمامات والبقاء تعلق ما يكفي من الوقت لتتراكم ما يكفي من الديستروفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثقافات الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري وتحويلها إلى myoblasts ثم إلى ميوتوب متمايزة. هذا النوع من خط الخلية مفيد للغاية لدراسة الاضطرابات العصبية العضلية والاختبارات المختبرية للعلاجات المحتملة.
يظهر تمثيل تخطيطي لتحويل الخلايا الليفية في الشكل 1. الشكل 2A يظهر جزء من الجلد والالخلايا الليفية المنبثقة منه. يجب تمرير الخلايا الليفية إلى طبق جديد عند الوصول إلى التقاء (الشكل 2B). الشكل 3A يظهر التقاء مثالية من الخلايا الليفية قبل تغيير إلى نمو myoblast المتوسطة تكمل مع دوكسيسيكلين. يجب أن تكون الخلايا حوالي 70٪ التقاء لأنها لا تزال تتكاثر أثناء عملية التحويل. إذا كانت الخلايا فوق 80٪ التقاء، قد تكون للخطر التمايز. التحويل إلى myoblasts يستغرق يومين إلى أربعة أيام، ويتم تأكيد ذلك من خلال مراقبة مورفولوجيا. الخلايا تصبح ممدود ومتوازية المنحى ، كما هو مبين في الشكل 3B. بعد إضافة الوسط التمايز، و myoblasts وقف تقسيم والبدء في دمج لتشكيل ميوتوب متعددة النوى (الشكل 3C). عندما تبدو الحدود myotubes الأبيض ومشرق، فهي على وشك فصل (الشكل 4). عند هذه النقطة، جمع أو إصلاح الخلايا.
نجاح التمايز سوف تختلف بين مختلف خطوط الخلايا / الطفرات. المناعة من البروتينات العضلية التي أعرب عنها myotubes ناضجة يؤكد إمكانات myogenic من الخلايا الليفية المحولة (الشكل 5). أظهر تحليل RNA-Seq مقارنة ميوتوب FM وعضلات الهيكل العظمي تعبيرًا عالي المستوى عن النصوص من الجينات الجنينية (MYH3) والوليد (MYH8) جينات سلسلة الميوسين والارتباط العام الجيد على نطاق النص مع العضلات(الشكل 6). كما يتم التعبير عن نصوص للبروتينات الساركية العملاقة تيتين (TTN) ، والنيبولين (NEB) ، والغموض (OBSCN) بواسطة ميوتوب FM ، مما يشير إلى رفع مستوى هذه النصوص الكبيرة المشاركة في تكوين الميوفيبريجيني. وهكذا, خلايا FM لها ملف تعريف تعبير خاص بالعضلات, مما يدل على أنها بديلا مفيدة وموثوق بها لخطوط الخلايا المستمدة من العضلات.
لتوضيح تخطي exon ، استخدمنا هذا البروتوكول في واحدة من أكثر تكرارات exon في جين DMD. ازدواجية إكسون 2 يؤدي إلى تعطيل إطار القراءة DMD، وبالتالي فإن استعادة إطار القراءة بعد تخطي exon يجب أن يؤدي إلى التعبير عن ديستروفين كامل الطول. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن تخطي exon 2 فعالة جدا مما أدى إلى نسخة خارج الإطار. ومع ذلك، في هذه الحالة، تخطي كل من نسخ من exon 2 يدفع إلى استخدام موقع دخول الريبوسوم الداخلية البديلة (IRES) الموجودة في exon 5، وبالتالي إنتاج وظيفية N-مبتورة الديستروفين التي تم تحديدها في المرضى الذين لا يزالون مُخَلِّضين في 70s12. ويبين الشكل 7A النتائج التمثيلية لRT-PCR من خلايا FM مع ازدواجية إكسون 2. تم التعامل مع خلايا FM إما مع AON أو AAV1-U7 تحمل تسلسل مضاد للانفلات لـ EXON 2. في الشكل 7B، يظهر مناعي الكشف عن ديستروفين N مقتطعة في خلايا FM تعامل مع AAV1-U7. في المعالجة في المختبر من خلايا FM بمثابة دليل على مفهوم لاستراتيجيات exon-تخطي.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا ميوجينية. يتم الحصول على خزعة الجلد من البشر. يتم وضع شظايا الجلد على أطباق الثقافة. في غضون أسبوع واحد، تبدأ الخلايا الليفية في الظهور. يتم نقل الخلايا الليفية أولاً مع الجين hTERT ، ثم مع جين Myod ، باستخدام ناقلات العدسي الفيروسية. بعد اختيار المضادات الحيوية للخلايا المصابة، يتم تحويل إلى myoblasts الناجم عن إضافة دوكسيسيكلين إلى متوسط نمو myoblast. في غضون يومين إلى أربعة أيام ، تصبح الخلايا ممدودًا وموجهة بشكل مواز. بعد التحول إلى التمايز المتوسطة، وصمامات myoblast مع بعضها البعض وتشكيل ميوتوب متعددة النوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شظايا خزعة الجلد في الثقافة. (أ) الخلايا الليفية الأولى الناشئة من شظايا الجلد. (ب) ظهرت الخلايا الليفية الناقطة من شظية الجلد. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخلايا الليفية عبر مختلفة. (A) صورة تمثيلية من 70٪ الخلايا الليفية التقاء. (ب) myoblasts تحويلها قد تماد مورفولوجيا ويتم تنظيمها بالتوازي. (C) تم تمييز Myotubes لمدة 7 أيام. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة تمثيلية لفصل myotubes. تشير الأسهم إلى الحواف البيضاء والناصعة من ميوتوبس التي بدأت في الانفصال. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مناعية من ميوتيوبات مختلفة. مناعة من سلسلة الميوسين الثقيلة في myotubes مشتقة من صحة (A) الفرد والمرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية (B و C). في B تظهر الخلايا من الحثل العضلي نوع 1 (DM1) تحمل 230 CTG يكرر، وفي C هي خلايا DM1 مع 900 CTG يكرر. شريط مقياس: 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نمط transcriptome من ميوتوب FM مقارنة بالعضلات الهيكل العظمى. نمط transcriptome من ميوتوب FM مقارنة بالعضلات الهيكل العظمى. يتم عرض عدد القراءة لكل مليون من القراءات المعينة لـ 12,134 نسخة لمكتبات Illumina RNA-Seq التي تم إعدادها من ميوتيوب FM وخزعة العضلات الهيكل العظمي البشري. وكان مستويات النص بين المكتبتين ارتباط بيرسون من 0.71 وعلاقة رتبة سبيرمان من 0.73. يتم تسليط الضوء على نصوص سلاسل الميوسين الثقيلة التنموية والبروتينات الساركية الكبيرة باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: ممثل RT-PCR ولطخة غربية تظهر اضحاً في خلايا FM. (A) التعبير DMD بواسطة RT-PCR. تم تحويل الخلايا الليفية من المريض الذي يأوي ازدواجية من إمبرون DMD 2 إلى خلايا FM. تم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من خزعة العضلات كتحكم ، مما يدل على أن الخلايا غير المعالجة FM تعبر عن نفس النسخة المكررة. خلايا FM تعامل مع AON لديها تخطي جزئي من exon 2 الازدواجية, في حين أظهرت الخلايا المعالجة AAV1-U7 غلبة النصوص مع exon 2 الازدواجية تخطي. (ب) مناعة تمثيلية لخلايا FM المعالجة بـ AAV1-U7. تم الكشف عن دسروفين أصغر ن اقتطاع بعد 14 يوما من العلاج (المشار إليها من قبل السهم). البيانات التي سبق نشرها في Wein et al. ترجمة من EXON DMD 5 نتائج IRES في ايزوفورم ديستروفين وظيفية أن يخفف من اعتلال العضلات في البشر والفئران. طب الطبيعة. 2014. 2020 سبرينغر الطبيعة المحدودة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| متوسط نمو الخلايا الليفية | DMEM مع 20٪ FBS، 1٪ مضاد للمضادات الحيوية |
| تجميد المتوسطة | 10٪ DMSO، 90٪ فيبروماوست المتوسطة |
| دوكسيسيكلين الأسهم الحل 1000X | 8 ملغ من doxycycline في 1 مل المياه النقية للغاية. تصفية في 0.22 μm مرشّح الحقن. Aliquot في أنابيب PCR. يُخزن عند -20 درجة مئوية، ومحميًا من الضوء. |
| متوسطة Myoblast | الهيكل العظمي خلايا العضلات متوسطة النمو (انظر القائمة أعلاه) مع المكملات الغذائية, 8 ميكروغرام / مل doxycycline. على سبيل المثال: 100 μL من 1000X حل الأسهم في 100 مل. |
| تمايز وسط | الهيكل العظمي العضلات الخلية تمايز المتوسطة مع المكملات الغذائية (انظر القائمة أعلاه), 8 ميكروغرام / مل doxycycline. على سبيل المثال: 100 μL من 1000X حل الأسهم في 100 مل. |
| حظر حل لتلوين IF | 10٪ مصل الماعز (أو مصل الحيوان الذي أثيرت الأجسام المضادة الثانوية) في 1X PBS |
| قاعدة العازلة لاستخراج البروتين | NaCl 150 mM، تريس 50 mM، 0.05 ٪ NP-40. ضبط درجة اله إلى 7.4. يُخزن عند 4 درجة مئوية. |
الجدول 1: وصفات متوسطة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحصول على خطوط خلايا FM ذات نوعية جيدة، تكون بعض الخطوات حاسمة. وكلما أسرعت عملية خزعة الجلد، كلما كانت فرص الحصول على الخلايا الليفية الصحية أكبر. عدد مرور الثقافات الخلايا الليفية مهم أيضا. الخلايا الأولية لديها قدرة انتشارية محدودة وبعد العديد من الممرات ، تدخل في شيخوخة تكرارية. وبالتالي، فمن الأفضل أن يكون مخزون من الخلايا الليفية في عدد مرور منخفضة وتحويل الخلايا في أقرب وقت ممكن مرور.
خطوة أخرى مهمة هي أيضا أن يكون الإنتاج الفيروسي الذي يحتوي على أقصى قدر من النقاء والكم دقيقة. على سبيل المثال، يوفر تحديد الجينوم الفيروسي باستخدام qPCR قياسات معقولة، ولكن القياس الكمي بواسطة ddPCR (PCR القطيرات الرقمية) أكثر دقة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلط الكافي من الخلايا الليفية لتحويل myoblast أمر بالغ الأهمية. إذا كانت الخلايا أقل من 70٪ أو فوق 80٪ التقاء، قد يضعف التمايز الميوجينيك. إذا كانت الخلايا التقاء جدا، سيكون هناك تراكب طبقات من ميوتوب، والتي تتداخل مع تلطيخ والتصوير. تركيز doxycycline أمر حاسم للتنشيط الصحيح والتعبير المستمر عن جين Myod. من الأهمية بمكان أن تضيف دائما doxycycline إلى يمين المتوسطة قبل القيام بتغييرات الوسائط، كما أنه يتحلل بسرعة بعد تخفيفها في المتوسط وتخزينها في 4 درجة مئوية. يجب تخزين المخزون في -20 درجة مئوية بتركيز 1000X وحمايتها من الضوء. لا إعادة تجميد aliquots المذابة. ومن المهم جداً اتباع هذه التفاصيل لضمان إجراء تجارب قابلة للتكرار وتمييز التمايز الضعيف بسبب طفرة جينية عن المسائل التقنية. ومع ذلك ، قد لا يكون من الممكن التمييز الجيد ، اعتمادًا على الطفرة أو نوع المرض. ولضمان النتائج الموثوقة، من المهم جداً تكرار التجارب في أرقام مرور مماثلة.
في تجربتنا، والقدرة على التمايز لا تزال مستمرة على الأقل حتى مرور 25-27، وخاصة في الضوابط من النوع البرية. قد يكون نفس الشيء صالحًا لبعض خطوط الخلايا المريضة، ولكن يعتمد ذلك على خط الخلية. بعض خطوط خلايا DMD لا تزال تحتفظ المحتملة الميوجينية فوق P20. في المعارضة، قدم نوع ضمور 1 (DM1) الخلية (DM1) انخفاض myogenicity بعد P8. ومع ذلك، في حالة DM1، وهذا ليس من المستغرب كما ثبت أن الطفرات في DM1 تلعب دورا غير مباشر في تمايز العضلات16. وينبغي معالجة الاحتفاظ بقدرة التمايز الميوجيني بشكل فردي، ولكن عموما، فإن معظم خطوط الخلية تحتفظ بها حتى P20-25.
باختصار، تحويل الخلايا الليفية إلى الخلايا العضلية هو أداة قوية لدراسة واختبار الاستراتيجيات العلاجية للاضطرابات العصبية العضلية. أنه يسهل الوصول إلى نماذج الخلايا البشرية عن طريق تجنب obtention معقدة من خزعات العضلات والحد من إزعاج خزعة العضلات للمرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد رخصت مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني برنامج تخطي exon 2 الموصوفة هنا إلى Audentes Therapeutics. وقد تلقت K.M.F. وN.W. مدفوعات الإتاوات نتيجة لهذا الترخيص.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور فنسنت مولي على مشاركته معرفته في الماضي بشأن النموذج. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS043264 (K.M.F., وR.B.W.) ، والمعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة من التهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M. ، R.N., وN.W.). تلقت N.W. دعم الزمالة من جامعة ولاية أوهايو / مجموعة العضلات مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني ومؤسسة فيليب. وقد تم دعم هذا العمل أيضا من قبل صناديق تقديرية داخلية وجزء من exon 2 تخطي العمل وقد تم أيضا بدعم من قبل CureDuchenne (K.M.F.) ورابطة Francaise Contre ليه Myopathies. رقم IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 وIBBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M.
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
