Methodenartikel

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

DOI:

10.3791/61995

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14. Januar 2021

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1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Das Herz-Kreislauf-System ist ein Wichtiger Akteur in der menschlichen Physiologie und versorgt die meisten Gewebe im Körper mit Nahrung. Gefäße sind in verschiedenen Größen, Strukturen, Phänotypen und Leistung vorhanden, abhängig von jedem spezifischen durchbluteten Gewebe. Das Gebiet des Tissue Engineering, das darauf abzielt, beschädigtes oder fehlendes Körpergewebe zu reparieren oder zu ersetzen, stützt sich auf eine kontrollierte Angiogenese, um eine ordnungsgemäße Vaskularisierung innerhalb der künstlichen Gewebe zu schaffen. Ohne ein Gefäßsystem können dicke konstruierte Konstrukte nicht ausreichend genährt werden, was zu Zelltod, schlechter Transplantation und letztendlich zum Versagen führen kann. Daher ist das Verständnis und die Kontrolle des Verhaltens von künstlichen Blutgefäßen eine herausragende Herausforderung auf diesem Gebiet. Diese Arbeit stellt ein Hochdurchsatzsystem vor, das die Erstellung organisierter und wiederholbarer Schiffsnetzwerke zur Untersuchung des Schiffsverhaltens in einer 3D-Gerüstumgebung ermöglicht. Dieses zweistufige Seeding-Protokoll zeigt, dass Gefäße innerhalb des Systems auf die Gerüsttopographie reagieren und je nach Kompartimentgeometrie, in der sich die Gefäße befinden, ein ausgeprägtes Keimverhalten aufweisen. Die erhaltenen Ergebnisse und das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems können angewendet werden, um bessere 3D-biogedruckte Gerüstkonstruktionsentwürfe zu erstellen, wobei die Herstellung verschiedener 3D-Geometrien nicht schnell bewertet werden kann, wenn der 3D-Druck als Grundlage für zellularisierte biologische Umgebungen verwendet wird. Darüber hinaus kann das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems für die Verbesserung des schnellen Wirkstoffscreenings, die schnelle Entwicklung von Co-Cultures-Modellen und die Untersuchung mechanischer Reize auf die Blutgefäßbildung genutzt werden, um das Wissen über das Gefäßsystem zu vertiefen.

Einleitung

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Das Gebiet des Tissue Engineering schreitet schnell voran in Richtung der Herstellung von technischen Konstrukten, um fehlende oder beschädigte Organe und Gewebe zu ersetzen1. Voll funktionsfähige Konstrukte müssen jedoch teilweise noch erreicht werden, da die Erzeugung operativer vaskulärer Netzwerke für die Gewebeernährung eine herausragende Herausforderung bleibt. Ohne richtige Vaskularisierung sind künstliche Gewebe auf einen passiven Diffusionstransport von Sauerstoff und Nährstoffen beschränkt, wodurch die maximale lebensfähige Gewebedicke auf die Diffusionsgrenze von etwa 200 μm2beschränkt wird. Solche Dicken sind nicht geeignet, um große Gewebedefekte zu reparieren oder für die vollständige Organherstellung, was das Vorhandensein eines funktionellen Gefäßnetzwerks zu einem obligatorischen Merkmal für funktionelle und implantierbare Gewebe macht3.

Das Gefäßsystem besteht aus einer Vielzahl von Blutgefäßen mit unterschiedlichen Größen, Phänotypen und Organisationen, die eng mit dem Wirtsgewebe verbunden sind. Das Verständnis des Verhaltens, der Reaktion und der Migrationsentscheidungen, die von den sich entwickelnden und sprießenden Gefäßen getroffen werden, kann ihre Integration in künstliche Gewebe anweisen4. Derzeit ist der gebräuchlichste Ansatz zur Schaffung von In-vitro-Gefäßnetzwerken die Kombination von Endothelzellen (ECs) mit Unterstützungszellen (SCs, mit der Fähigkeit, sich zu Wandzellen zu differenzieren), die in einer dreidimensionalen Mikroumgebung ausgesät sind. Diese Umgebung liefert chemische und physikalische Hinweise, damit sich die Zellen an Gefäßnetzwerke anheften, vermehren und selbst zu Gefäßnetzwerken zusammensetzenkönnen 2,5,6,7,8. Wenn sie co-kultiviert werden, sezernieren SCs extrazelluläre Matrixproteine (ECM) und bieten gleichzeitig mechanische Unterstützung für die ECs, die die röhrenförmigen Strukturen bilden. Darüber hinaus fördert eine Kreuzinteraktion zwischen beiden Zelltypen tubulogenese, Gefäßkeimung und Migration, zusätzlich zur SCs Reifung und Differenzierung in α-glatte Muskel-Aktin-exprimierende (αSMA) Wandzellen4. Die Entwicklung von Gefäßnetzwerken wird am häufigsten in 3D-Umgebungen untersucht, die mit Hydrogelen, porösen polymeren Gerüsten oder einer Kombination davon erstellt wurden. Letztere Option bietet gleichermaßen eine zellfreundliche Umgebung und die erforderliche mechanische Unterstützung sowohl für die Zellen als auch für das ECM9.

Es wurde eine große Menge an Arbeiten durchgeführt, um die vaskuläre Entwicklung zu untersuchen, einschließlich der Co-Kultivierung der Zellen auf Hydrogelen10,Hydrogelen-Gerüst-Kombinationen11,12, 2D-Plattformen und mikrofluidischen Geräten13. Hydrogele können jedoch leicht durch die von der Zelle ausgeübten Kräfte14deformiert werden, während 2D- und Mikrofluidiksysteme es nicht schaffen, eine naturnähere Umgebung nachzubilden, um eine extrapolierbarere Antwort zu erhalten15,16. Zu verstehen, wie umformende Gefäße auf ihre Umgebung reagieren, kann wichtige Einblicke liefern, die die Herstellung von technischen Umgebungen mit der Fähigkeit ermöglichen, die Schiffsentwicklung auf vorhersehbare Weise zu leiten. Das Verständnis von Gefäßbildungsphänomenen ist besonders wichtig, um mit dem schnellen Aufkommen von Fertigungstechniken im Submikron-zu-Mikron-Maßstab Schritt zu halten, wie Stereolithographie, digitale Projektionslithographie, kontinuierliche Flüssigschnittstellenproduktion, 3D-Schmelzelektro-Jetwriting, lösungsbasiertes 3D-Elektrojet-Schreiben und aufkommende Bioprinting-Techniken17,18,19,20,21. Die Kontrolle dieser Mikroherstellungstechniken mit einem vertieften Verständnis der vaskulären Biologie in Einklang zu bringen, ist der Schlüssel zur Schaffung eines geeigneten künstlichen Gefäßsystems für ein Zielgewebe.

Hier stellen wir ein 3D-System vor, um die Reaktion neuer sich bildender und keimender Gefäße auf die umgebende Gerüstgeometrie zu untersuchen und deren Keimursprung und anschließende Migration zu beobachten22. Durch die Verwendung von 3D-Gerüsten mit tessellierten Kompartimentgeometrien und einer zweistufigen Seeding-Technik ist es uns gelungen, hochorganisierte vaskuläre Netzwerke auf klare und einfach zu analysierende Weise zu erstellen. Die tessellierten Geometrien bieten ein System mit hohem Durchsatz mit einzelnen Einheiten, die Behälter enthalten, die auf ihre lokale Umgebung reagieren. Mit mehrfarbigen ECs verfolgten wir die Ursprünge der Sprossenbildung und nachfolgende Migrationsmuster, korreliert mit der Kompartimentgeometrie und der SCs-Position22.

Obwohl das vorgeschlagene Protokoll vorbereitet wurde, um die Auswirkungen geometrischer Hinweise auf das Vaskularisierungsverhalten zu analysieren, kann dieser Ansatz erweitert und auf eine Vielzahl neuer Anwendungen angewendet werden. Das tessellierte Gerüst und die leicht abbildbaren Netzwerke ermöglichen die einfache Analyse verschiedener ECs- und SCs-Interaktionen, die Addition spezifischer Organzellen und deren Interaktion mit den vaskulären Netzwerken, die Arzneimittelwirkung auf vaskuläre Netzwerke und vieles mehr. Unser vorgeschlagenes System ist sehr vielseitig und einfach herzustellen und zu verarbeiten.

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Protokoll

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1. Tessellierte Gerüstherstellung

HINWEIS: Die Photolithographie ist eine weit verbreitete Technik, die spezielle Geräte erfordert, die typischerweise in einer Nanofabrikationseinrichtung / einem Labor untergebracht sind. Die in diesem Protokoll dargelegte Methode wurde für das Publikum so weit wie möglich verallgemeinert; Je nach der dem Lesegerät zur Verfügung stehenden Ausrüstung können jedoch geringfügige Änderungen der Verfahren erforderlich sein. Wir empfehlen, diese Verfahren in einem Reinraum in einer Nanofabrikationsanlage durchzuführen, um höchste Prozessqualität zu gewährleisten. Bevor Sie beginnen, erhalten Sie Zugang zu einem Masken-Aligner (oder einer UV-Belichtungsanlage), einem Spincoater, Kochplatten, einer Lösungsmittelwaschstation, einer Fotomaske und einem Plasmareiniger. Die Lösungsmittel und Chemikalien, die im Verfahren verwendet werden, sind gefährlich, also seien Sie bitte sehr vorsichtig, um eine chemische Exposition zu vermeiden. Identifizieren Sie beim Entwerfen der Fotomaske, welche Größe Siliziumwafer und Fotomasken mit dem Spincoater und mask-aligner kompatibel sind. Darüber hinaus wird das Fotolack, das sich an den Kanten des Siliziumwafers befindet, typischerweise durch die Handhabung verformt. Daher machen Sie die Designs in Richtung des mittleren Bereichs des Wafers.

  1. Bereiten Sie Gerüste mit einer Photolithographietechnik mit der ausgewählten Geometrie von Interesse vor.
    1. Reinigen Sie vor der Spinbeschichtung den Siliziumwafer. Dies kann mit plasmareinigung oder einer lösungsmittelbasierten Technik erfolgen. Befolgen Sie bei der Plasmareinigung die Standardbetriebsprozedur des Geräts für Betriebsdetails. Besprühen Sie mit komprimiertem Stickstoffgas und inspizieren Sie den Wafer vor der Spin-Beschichtung auf Schmutzfreiheit. Dieser Wafer dient als Substrat, auf dem die Gerüste entstehen.
      HINWEIS: Für beste Ergebnisse beginnen Sie mit einer frischen Waffel. Wafer können wiederverwendet werden, sollten aber frei von altem Fotolack, Oberflächendefekten und Ablagerungen sein. Es ist hilfreich, für die Handhabung eine Waffelpinzette zu verwenden.
    2. Zentrieren Sie einen Siliziumwafer mit einer Führung auf das Spincoaterfutter. Drehen Sie den Wafer kurz, um sicherzustellen, dass er richtig auf dem Futter zentriert wurde, und stellen Sie ihn nach Bedarf ein, bis er richtig zentriert ist. Dies muss jedes Mal erfolgen, wenn ein Wafer auf den Spincoater gelegt wird. Dosieren Sie 1-4 ml des Lift-Off-Reagenzes auf den Wafer (dies hängt von der Größe des Wafers ab). Etwa 2 ml Lift-Off-Reagenz funktionieren gut für einen 4-Zoll-Wafer.
      1. Stellen Sie die Spreizgeschwindigkeit des Spincoaters für 5 Sekunden auf 500 U / min und die Spin-Geschwindigkeit für 30 Sekunden auf 1000 U / min ein und drehen Sie dann das Lift-Off-Reagenz. Überprüfen Sie den Wafer, um sicherzustellen, dass er eine gleichmäßige Beschichtung über den Wafer hat. Alle Ablagerungen, die auf dem Wafer zurückbleiben, sind an dieser Stelle sehr offensichtlich. Alle Gerüste in einem Gebiet mit Trümmern werden wahrscheinlich unbrauchbar sein. Nach der Spin-Beschichtung auf eine kochplatte geben und 1 Minute bei 200 °C backen.
    3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch zwei Weitere Male für insgesamt drei Beschichtungen.
    4. Spin-coat den lift-off Reagenz beschichteten Siliziumwafer mit SU-8 2050 Fotolack bis zu einer Dicke von ca. 100 μm.
      1. Geben Sie 1 ml Lack pro 25 mm Substratdurchmesser ab.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, Blasen beim Gießen des Widerstands zu vermeiden. Für SU-8 2050 funktioniert das Gießen eines Kreises mit einem Durchmesser von etwa 2 Zoll bei Verwendung eines 4-Zoll-Siliziumwafers gut.
      2. Spin-Coat der SU-8 2050. 5 Sekunden lang mit einer Drehzahl von 500 U/min spreizen, gefolgt von einer Spindrehzahl zwischen 1700 und 1800 U/min, um eine Dicke von ca. 100 μm zu erreichen.
      3. Optional:Lassen Sie die spinbeschichteten Waffeln nach dem Spinnen über Nacht auf einer ebenen, lichtgeschützten Oberfläche vor dem Vorbacken entgasen. Dies kann helfen, den Widerstand von Blasen zu befreien und Defekte ausgleichen zu lassen.
        HINWEIS: Die tatsächliche Dicke des Widerstands und der resultierenden Gerüste kann je nach Benutzerfehler und Geräteparametern variieren. Daher sollte die Dicke der Gerüste später in Schritt 1.6 überprüft werden. Modifizieren Sie die Spin-Beschichtungsverfahren entsprechend, um die gewünschte Dicke zu erreichen.
    5. Vor der Belichtung die Waffeln bei 65 °C für 10 min und dann 95 °C für 40-50 min vorbacken. Testen Sie vor der Exposition die Oberfläche des Widerstandes, indem Sie mit einer Pinzette auf den Rand drücken, um sicherzustellen, dass er nicht mehr klebrig / viskos ist. Es ist hilfreich, die Waffel von der heißen Platte zu ziehen und sie 0,5-1 min abkühlen zu lassen, bevor Sie die Klebrigkeit beurteilen.
      HINWEIS: Langsame Temperaturrampenzeiten (Heizen und Kühlen) können dazu beitragen, ein Verziehen der Gerüste zu verhindern.
  2. Belichten Sie den Fotolack UV-Licht (350-400 nm) durch eine Fotomaske mit einer Belichtungsenergie von 215-240 mJ/cm2 für eine Widerstandsstärke von 85 - 110 μm. Die empfohlenen Korrelationen zwischen Belichtungsenergie und Dicke finden Sie in den Richtlinien des Fotolackherstellers.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Exposition ordnungsgemäß kalibriert ist, damit die Energie überprüft wird. Passen Sie die Belichtungszeit nach Bedarf an, um die gewünschte Belichtungsenergie zu erreichen. Darüber hinaus können Mask aligner verschiedene Belichtungsmodi ermöglichen: Vakuumkontakt, harter Kontakt, weicher Kontakt und Näherungskontakt (spezifische Begriffe können variieren). Im Allgemeinen wirken sich diese auf die Auflösung und die Ausrichtung der Funktionen aus. Die Autoren verwendeten typischerweise einen "Harten Kontakt" -Modus.
    2. Bei kleinen Features oder mehreren Ebenen, bei denen die Ausrichtung von Bedeutung ist, sollten Sie Belichtungsmodi und Maskenausrichtungsverfahren sorgfältiger berücksichtigen. Achten Sie darauf, die Höhe des Widerstands zu berücksichtigen, wenn Sie den Dickenwert einstellen. Einzelheiten zur Bedienung finden Sie in den Standardarbeitsanweisungen Ihres Maskenausrichers.
      HINWEIS: Das Design der Fotomaske bestimmt die Gerüstgröße, die Fachgeometrie und die Anzahl der pro Charge erhaltenen Gerüste. Die Verwendung einer Hartglas- oder Quarz-Fotomaske ergibt die höchste Auflösung; Für diese großen Merkmalsgrößen (>10 μm) kann jedoch im Allgemeinen eine transparente Polymerfilm-Fotomaske verwendet werden. Die Verwendung einer Film-Fotomaske kann aufgrund einer schlechteren Merkmalsauflösung zu topographischen Merkmalen entlang der z-Achse der Gerüstporen führen. Dies könnte möglicherweise einen Einfluss auf das Zellverhalten haben. Überprüfen Sie die gewünschte Auflösung, wenden Sie sich an den, der die Fotomaske herstellt, um sicherzustellen, dass die gewünschte Auflösung erreicht wird.
  3. Die Waffel unmittelbar nach UV-Einwirkung bei 65 °C für 2-5 Minuten und dann bei 95 °C für 8-10 Minuten backen.
  4. Entwickeln Sie die Gerüste, um unentwickelten Widerstand zu entfernen.
    1. Tauchen Sie die Gerüste mit einer SU-8-Entwicklerlösung mit geringem Volumen für 7-10 Minuten ein, um unentwickelten Widerstand aufzulösen.
    2. Mit Isopropylalkohol (IPA) abspülen.
    3. Trockenwaffel mit komprimiertem Stickstoff.
      HINWEIS: Achten Sie während Schritt 1.4 darauf, dass die Gerüste nicht vorzeitig losgelöst werden. Geringe Entwicklervolumina und schonende Handhabung sind notwendig, um dies zu erreichen.
  5. Nach der Entwicklung die Waffeln bei 150 °C 15 min hart backen.
    HINWEIS: Nach hartem Backen kann das Ausschalten der Kochplatte, damit die Waffeln sehr langsam abkühlen können, vorteilhaft sein, um ein Verziehen / Kräuseln der endgültigen Gerüste zu verhindern.
  6. Optional: Nach dem Hartbacken und vor dem Abheben die Gerüstdicke beurteilen, da die Gerüste noch sanft auf der Oberfläche der Waffel haftet. Für dieses Verfahren funktioniert die Kontaktprofilometrie gut; es könnte jedoch jede geeignete Methode angewendet werden.
  7. Heben Sie die Gerüste von der Waffel ab.
    1. Tauchen Sie die Gerüste in SU-8 Developer ein, damit sie sofort vom Wafer abheben. Wenn die Gerüste nicht abheben, drücken Sie die Gerüste vorsichtig mit einer Waffelpinzette.
    2. Entfernen Sie überschüssige Entwickler.
    3. Die Gerüste in einen neuen Behälter geben und in Isopropylalkohol tauchen. Spülen Sie IPA mindestens 6 Mal ein, um sicherzustellen, dass alle Entwickler entfernt wurden.
  8. Trocknen Sie die Gerüste mindestens eine Woche vor gebrauchen.

2. Gerüst-Fibronektin-Beschichtung

  1. Zur Desinfektion die Gerüste mindestens 15 Minuten lang in 70% Ethanol (v/v) tauchen und vor Gebrauch 2 mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
    ACHTUNG: Die SU-8 Gerüste sind gebrechlich und können leicht brechen. Die Handhabung wird mit stumpfen und gekrümmten Spitzenzetten empfohlen, und sie sollten mit größter Sorgfalt behandelt werden. Eine einfachere Handhabung kann erreicht werden, indem die Gerüste in Flüssigkeit getaßt werden, um elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Gerüsten und der Oberfläche zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie eine Verdünnung von 50 μg / ml humanem Fibronektin in PBS vor und bedecken Sie die Gerüste durch Proteinadsorption.
    1. Mischen Sie 1,5 μL Fibronektin-Stammlösung (1 mg/ml) mit 28,5 μL PBS pro gesätes Gerüst. Vorzugsweise bereiten Sie nur eine Fibronektinverdünnung vor, die für alle Gerüste verwendet werden soll, um Pipettierfehler zu vermeiden.
      1. Für 10 Gerüste 15 μL Standard-Fibronektinlösung in 285 μL PBS mischen, was insgesamt 300 μL mit einer Fibronektinverdünnung von 50 μg/ml entspricht.
    2. Legen Sie die Gerüste spärlich auf eine hydrophobe Oberfläche (d. h. Nichtgewebekultur (nonTC) 10 cm Schüssel) und bedecken Sie jedes Gerüst mit 30 μL der in Schritt 2.2.1 hergestellten Fibronektinverdünnung.
      ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in den Gerüstfächern eingeschlossen sind. Wenn Blasen vorhanden sind, können sie durch sanftes Schütteln des Gerüsts innerhalb des Tröpfchens oder leichtes Pipettieren entfernt werden.
    3. Ersetzen Sie den Deckel der Platte und stellen Sie die mit Fibronektinen bedeckten Gerüste für mindestens eine Stunde in einen Inkubator mit 37 °C und 100% Luftfeuchtigkeit.
    4. Nach der Inkubation die Gerüste in PBS leicht ausspülen, um Fibronektinreste zu entfernen. Die Gerüste können bis zu einer Woche vor Gebrauch in PBS bei 4 °C gehalten werden.

3. Aussaat von Endothelzellen

  1. Bereiten Sie EC-Medium vor, indem Sie das Basalmedium mit den entsprechenden Medium-Kit-Komponenten mischen, einschließlich einer Antibiotikalösung (Pen / Strep), fetalem Rinderserum (FBS) und Endothelzellwachstumspräparaten, wie vom Hersteller angegeben.
  2. Herstellung einer humanen mikrovaskulären Endothelzellsuspension (HAMEC) in EC-Medium mit einer Konzentration von 4 x 106 Zellen/ml.
    HINWEIS: Echtzeit-Bildgebung kann durchgeführt werden, wenn die verwendeten Endothelzellen zuvor transfiziert wurden, um ein fluoreszierendes Protein zu exprimieren, oder mit einem ungiftigen zytoplasmatischen Membranfarbstoff (weiter als markierte ECs bezeichnet) vorgefärbt wurden.
  3. Legen Sie mit einer Zette ein fibronektinbeschichtetes Gerüst pro Vertiefung auf eine Nicht-TC-24-Well-Plattenbohrung.
  4. Decken Sie jedes Gerüst mit 25 μL Tröpfchen der HAMEC Suspension ab. Achten Sie darauf, die Suspension nicht vom Gerüst abfließen zu lassen, da sie die Zellhaftung behindern kann.
  5. Legen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie ihn in einen Inkubator bei 37 °C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit. Mindestens 60 Minuten und maximal 90 Minuten inkubieren lassen.
    HINWEIS: Während der Inkubation verbessert das Platzieren der Platte auf einem Orbitalschüttler innerhalb des Inkubators die Zellbefestigung an den Wänden des Gerüsts. Der Orbitalschüttler sollte auf nicht mehr als 5 U/min eingestellt werden.
  6. Nach der Inkubation jede Vertiefung mit einer Pipette mit 700 μL EC-Medium füllen.
    HINWEIS: Erwarten Sie ECs am Boden des Brunnens, da einige der Zellen nicht an das Gerüst anhaften und durch die Hohlräume des Gerüsts fallen.
  7. Inkubieren Sie die endothelialisierten Gerüste, bis der EC-Zusammenfluss mit Fluoreszenzmikroskopie an den Wänden des Gerüsts (bei Verwendung von markierten ECs) oder für 3 Tage (bei Verwendung von nicht markierten ECs) beobachtet werden kann, was genügend Zeit bietet, um EC-Konfluenz zu erreichen. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.

4. Unterstützen Sie die Zellaussaat und Co-Kultur

  1. Bereiten Sie das Medium der Dental pulp Stammzelle (DPSC) (DPSCm) vor, indem Sie 500 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM mit niedrigem Glukosegehalt), 57,5 ml FBS, 5,75 ml nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX und 5,75 ml Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung mischen.
  2. Übertragen Sie die endothelialisierten Gerüste in eine neue NonTC-24-Well-Platte, um ECs, die mit einer Zette am Boden der Bohrbrunnen befestigt sind, zu entsorgen.
    1. Entsorgen Sie alle Medien von der aktuellen Platte mit einer 1-ml-Pipette oder Vakuumabsaugung. Achten Sie darauf, kein Vakuum direkt auf das Gerüst aufzutragen.
    2. Platzieren Sie ein Gerüst pro Vertiefung, vorzugsweise in der Mitte des Bohrplatzes, um zu vermeiden, dass Flüssigkeit aufgrund von Oberflächenspannungseffekten in Richtung der Wände läuft. Trocknen Sie den Bereich um das Gerüst mit leichtem Vakuum, aber vermeiden Sie eine vollständige Trocknung des Gerüsts.
  3. Bereiten Sie eine DPSC-Suspension in Fibrin-Pre-Gel-Lösung vor.
    1. Thrombin- und Fibrinogen-Stammlösungen mit PBS verdünnen, bis eine Endkonzentration von 5 U/ml bzw. 15 mg/ml erreicht ist.
    2. Eine 8 x 106 DPSC/ml Suspension wird in der 5 U/ml Thrombinverdünnung vorbereitet und in einzelnen Eppendorfs 12,5 μL dieser Suspension pro zu säendem Gerüst verteilt.
    3. Stellen Sie eine 5-50 μL Pipette (oder ähnliches) auf 12,5 μL und füllen Sie sie mit der 15 mg/ ml Fibrinogenlösung.
    4. Ohne die Spitze zu entfernen, stellen Sie die Pipette auf 25 μL. Das Material in der Spitze sollte aufsteigen und ein leeres Volumen in Richtung der Spitzenöffnung hinterlassen.
    5. Drücken Sie langsam den Kolbenknopf, bis die Flüssigkeit die Spitzenöffnung erreicht, aber nicht austritt. Halten Sie den Kolben in dieser Position und stecken Sie die Spitze in eine der Mikrozentrifugenröhrchen, die die Zellen in Thrombinsuspension enthalten, um sicherzustellen, dass die Spitze mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt.
      ACHTUNG: Die Fibrinvernetzung beginnt unmittelbar nach dem Kontakt von Thrombin und Fibrinogen. Der folgende Schritt sollte schnell erledigt sein.
    6. Lösen Sie vorsichtig den Kolbenknopf und ziehen Sie die Zellaufhängung in die Spitze. Mischen Sie beide Materialien gründlich und vermeiden Sie Blasenbildung.
  4. Dosieren Sie die gemischten Materialien schnell auf einem endothelialisierten Gerüst. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für jedes Gerüst und stellen Sie sicher, dass Sie immer die Spitzen zwischen den Anwendungen wechseln, um unerwartete Fibringelbildung innerhalb der Spitze zu vermeiden.
  5. Ersetzen Sie den Plattendeckel und inkubieren Sie die Gerüste bei 37 °C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit für 30 Minuten.
  6. Nach der Inkubation jede Vertiefung mit 1 ml 1:1 DPSC und EC-Medium füllen.
    1. Kultur für 1 Woche, jeden zweiten Tag wechselnd.
    2. Entfernen Sie während der Kultur das Medium aus dem Brunnen und stellen Sie die Konstrukte mit einem konfokalen Mikroskop zu verschiedenen Zeitpunkten dar, um die vaskuläre Entwicklung oder einen anderen interessierenden Parameter zu untersuchen.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann nur durchgeführt werden, wenn das Experiment mit beschrifteten ECs durchgeführt wird. Siehe Schritt 6 - HINWEIS zur weiteren Erläuterung.

5. Immunfluoreszierende Färbung für charakteristische Gefäßmarker

HINWEIS: Die folgenden Schritte können in den gleichen Brunnen durchgeführt werden, in denen die Konstrukte kultiviert wurden. Es ist wichtig, immer darauf zu achten, dass die Lösungen die Gerüste vollständig abdecken. Darüber hinaus wird, wenn möglich, die Durchführung der Schritte an einem Orbitalschüttler empfohlen, wenn auch nicht obligatorisch.

  1. Entsorgen Sie an Tag 7 die Medien aus den Vertiefungen und spülen Sie die Gerüste aus, indem Sie PBS zu den Vertiefungen hinzufügen und mit Vakuum entfernen.
  2. Fixieren Sie die Gerüste, indem Sie 20 Minuten lang 4% Paraformaldehyd hinzufügen. Waschen Sie in PBS 3 mal, 5 Minuten pro Waschgang.
  3. Permeabilisieren Sie die festen Zellen mit 0,3% Triton-X in PBS (v/v) für 15 Minuten. Waschen Sie in PBS 3 mal, 5 Minuten pro Waschgang.
  4. Bereiten Sie ein 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (w / v) Blocklösung vor und bedecken Sie die Gerüste. Bei Raumtemperatur 1 Stunde einlassen.
    HINWEIS: Alle erforderlichen Lösungsmengen hängen von der Anzahl der zu verfärbigenden Gerüste ab. Bereiten Sie die Lösungen nach Bedarf unter Einhaltung der angegebenen Konzentrationen vor.
  5. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Färbelösung vor und tragen Sie sie auf.
    1. Verdünnen Sie den Kaninchen-Antikörper gegen den Willebrand-Faktor (vWF) 1:150 und den Maus-Antikörper gegen SMA 1:50 in frischer Blocklösung.
      HINWEIS: Andere Endothelzellenmarker wie CD31 oder VE-Cadherin können verwendet werden.
    2. Decken Sie das Gerüst mit der primären Antikörperlösung ab und halten Sie es über Nacht bei 4 °C. Dreimal in PBS waschen, 5 Minuten pro Waschgang.
  6. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Färbelösung vor und tragen Sie sie auf.
    1. Verdünnen Sie Ziegen-Anti-Maus Cy3 Antikörper 1:150 und Ziege Anti-Kaninchen Alexa-Fluor 488 1:400 in PBS.
    2. Decken Sie die Gerüste mit der sekundären Antikörperlösung ab und inkubieren Sie sie mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht. 3 mal in PBS waschen, 5 Minuten pro Waschgang. Halten Sie das fleckige Gerüst in 0,3% PFA in PBS (v / v) für bis zu einem Monat.

6. Konfokale Gerüstbildgebung und Gefäßentwicklungsanalyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte können an den festen und gefärbten Gerüsten zum gewählten letzten Zeitpunkt oder, wenn fluoreszierende Zellen verwendet wurden, während der Zellkulturperiode durchgeführt werden, ohne dass das Experiment abgebrochen werden muss. Für Letzteres empfiehlt es sich, bestimmte Zeitpunkte festzulegen; Diese Arbeit zeigt Tag 0 (vor der Aussaat von SCs) und die Tage 1, 3, 5 und 7 nach der Aussaat von SCs(Abbildung 3A).

  1. Stellen Sie die Gerüste mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 5-fachen Objektiv und einem Zoom von 0,5 und dem gesamten Z-Bereich des Gerüsts ab. Auf diese Weise können 9 separate Kompartimente für die quadratischen und kreisförmigen Geometrien oder 8 volle Kompartimente für die sechseckige Geometrie erfasst werden. Stellen Sie das fluoreszierende Signal und das durchgelassene Licht ab, um sowohl die Gefäßnetzwerkstruktur als auch die Kompartimentgeometrie zu erhalten (Abbildung 3A).
  2. Schneiden Sie mit ImageJ (oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware) jedes einzelne Fach zu. für diesen Prozess sind nur die Marker der vaskulären Netzwerke relevant. Entfernen Sie alle Gefäße, die sich nicht im Abteilbereich befinden. Erstellen Sie eine Projektion mit maximaler Intensität und speichern Sie jedes einzelne zugeschnittene Fach als TIFF-Bild.
    1. Drücken Sie in ImageJ file > Öffnen und wählen Sie das gewünschte TIFF-Bild mit mehreren Fächern aus. Das Bild sollte mindestens zwei Kanäle haben, das fluoreszierende Gefäßnetzwerk und das Durchlichtbild.
    2. Wählen Sie in der Symbolleiste das Polygon-Auswahlwerkzeug aus. Wählen Sie den Durchlichtkanal aus. Klicken Sie auf eine der Ecken des sechseckigen Fachs, an der Schnittstelle zwischen dem Fachbereich und der Gerüstwand beginnt die Maskendefinition. Klicken Sie weiter auf die nächsten Ecken in einer sequenziellen Reihenfolge, bis die erste Ecke ausgewählt ist, und schließen Sie die Maske.
      HINWEIS: Diese Erklärung gilt für ein sechseckiges Fach. Wenn das Fach quadratisch oder kreisförmig ist, verwenden Sie die Werkzeuge Rechteck bzw. Oval, um eine geeignete Maske zu erstellen. Unabhängig von der Form, passen Sie die Maske immer an die Innenwand des Gerüsts an.
    3. Klicken Sie auf Analyse > Tools > ROI-Manager. Klicken Sie im ROI-Manager (ROI, Region von Interesse) auf die Schaltfläche Hinzufügen, um die erstellte Maske zu speichern. Die neue Maske wird in der Linken angezeigt. Dieser Schritt ermöglicht es, dass die Analyse zwischen verschiedenen Bildern konsistent ist.
      HINWEIS: Im ROI-Manager ist es möglich, eine Datei mit allen erstellten Masken zu speichern, indem Sie auf Mehr > Speichernklicken. Wählen Sie im Fenster Auswahl speichern einen Namen und einen Speicherort aus, und speichern Sie die ROI-Datei. Um die Maske abzurufen, klicken Sie im ROI-Manager auf Mehr > Öffnen und wählen Sie die gewünschte .roi-Datei aus.
    4. Wählen Sie das Bild des fluoreszierenden Gefäßnetzwerks aus und klicken Sie auf Edit > Clear outside. Nur das in der Maske enthaltene Bild bleibt erhalten, während der Rest eliminiert wird.
    5. Klicken Sie bei geöffneter Datei des gelöschten Netzwerkabbilds auf Image > Duplicate. Geben Sie im Popupfenster Duplizieren den Namen des Bilds ein. Wenn der Hyperstack Duplizieren ausgewählt ist, heben Sie die Auswahl auf und klicken Sie auf OK. Es wird ein neues Bild erstellt, das nur die beschnittenen fluoreszierenden Gefäßnetzwerke enthält.
    6. Speichern Sie das zugeschnittene Bild,indem Sie auf Datei > Speichern unter > Tiff klicken. Wählen Sie den Namen und das Verzeichnis aus und klicken Sie auf OK.
  3. Analysieren Sie die Gefäßentwicklung auf den zugeschnittenen Bildern.
    1. Laden Sie die kostenlose analytische Software AngioTool herunter und installieren Sie sie, die quantitative Werkzeuge zur Quantifizierung einer Vielzahl von vaskulären Parametern bereitstellt. Die Software kann unter folgender Adresse bezogen werden, https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Legen Sie den Skalierungswert der Bilder fest, um Ergebnisse in Millimetereinheiten zu erhalten und ein Bild zu laden.
      1. Klicken Sie auf die Registerkarte Einstellung und füllen Sie die Entfernung in Pixel und Abstand in mm mit repräsentativen Werten aus den aufgenommenen Bildern. Unter Verwendung der oben genannten Bildparameter betragen die zu füllenden Werte 400 Pixel pro 1 mm.
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bild öffnen und suchen Sie nach dem interessierenden Bild.
    3. Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die Analyseparameter zur Quantifizierung der Gefäßentwicklung aus.
      1. Heben Sie unter dem Feld Gefäßdurchmesser und -intensität die Auswahl eines vorhandenen Markers aus dem oberen Bereichswähler auf, und aktivieren Sie den Marker, der die Zahl 3 darstellt.
      2. Bewegen Sie unter dem Feld Behälterdurchmesser und -intensität auf der unteren Bereichsauswahl die Markierung für den unteren Bereich auf 60 und belassen Sie den Hohen Ranger-Maker bei 255.
      3. Aktivieren Sie das Feld Kleine Partikel entfernen und setzen Sie die Markierung auf 100.
      4. Wählen Sie im Feld Speichereinstellungenden Namen und den Speicherort der Tabellenblattdatei aus, in der die Ergebnisse gespeichert werden sollen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse ausführen. Wenn das Feld Ergebnisbild speichern aktiviert ist, generiert und speichert Angiotool ein neues JPEG-Bild, das die quantifizierten Parameter des Gefäßnetzwerks zeigt.
        HINWEIS: Für jede durchgeführte Analyse, ohne den Namen der Tabellentabelle zu ändern, wird am unteren Rand der Datei eine neue Zeile mit den neu erfassten Ergebnissen hinzugefügt.
  4. Organisieren Sie die Daten und führen Sie eine statistische Analyse durch.
    1. Wählen Sie für alle verarbeiteten Bilder den interessierenden Parameter aus dem Tabellenblatt (z. B. Gesamtgefäßlänge und Behälterfläche)und geben Sie ihn in eine statistische Analysesoftware ein, um die erhaltenen Ergebnisse ordnungsgemäß zu untersuchen (Abbildung 3C).

7. Zeitraffer-Bildgebung zur Erkennung des Keimursprungs und zur Migrationsverfolgung

  1. Alternativ zur Kultivierung der Gerüste im Inkubator wie in Schritt 4.6 beschrieben, stellen Sie eine konfokale Mikroskopkulturkammer auf 37 °C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit ein.
    1. Legen Sie die Platte mit den vollständig ausgesäten Gerüsten in die konfokale Mikroskopkammer und stellen Sie die Bildgebungsparameter auf die gewünschten Werte ein.
    2. Legen Sie das Bildaufnahmeintervall auf 30 Minuten und die Gesamtbildzeit auf 72 Stunden fest. Dies ermöglicht es, den Zeitraffer vollständig ohne die Notwendigkeit eines Mittlerenwechsels auszuführen.
      ACHTUNG: Falls eine längere Zeitrafferbildgebung gewünscht wird, sollte eine sorgfältige Positionskalibrierung durchgeführt werden, um den ursprünglichen Bildgebungsort abrufen zu können, da Mediumsveränderungen das Entfernen der Platte aus dem konfokalen Inkubator und in die sterile biologische Haube erfordern.
      HINWEIS: Die Ablösung der ECs von den Gerüstwänden und die Bildung von Rohrstrukturen beginnt innerhalb der ersten Stunde nach der Aussaat der SCs (Schritt 4) und kann bis zu 50 Stunden dauern. Nach der anfänglichen Röhrenbildung wandern neue Sprossen aus den umgebenden Gefäßen in das Kompartiment. Das Keimen und der anschließende Netzwerkumbau werden während des gesamten Experiments ungefähr bis zum Tag 10 fortgesetzt, wenn die Schiffsnetzwerke stabil werden22. Verwenden Sie diese Informationen, um den Startpunkt und den Zeitschritt für den Zeitraffer entsprechend auszuwählen.
  2. Speichern Sie die komplette Zeitrafferfilmdatei als TIFF-Sequenz.
  3. Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Datei > Importieren Sie > Bildsequenz und wählen Sie Ihre Dateien aus. Dadurch wird Ihre TIFF-Sequenz als Film geöffnet.
  4. Öffnen Sie das Manuelle Tracking-Plugin, indem Sie auf Plugins > Manual Trackingklicken. Dadurch wird das Fenster Tracking geöffnet.
  5. Beobachten Sie den Film und wählen Sie das schiff, das verfolgt werden soll. Achten Sie auf seine Herkunft und Migration.
  6. Aktivieren Sie das Feld Parameter anzeigen und geben Sie die 30 Minuten für Zeitintervall ein. Die x/y-Kalibrierung hängt von der während der Bildgebung ausgewählten Pixelmenge ab.
  7. Fahren Sie fort, die keimenden Gefäße manuell von der Gerüstkontur aus zu verfolgen.
    1. Drücken Sie die Taste Spur hinzufügen. Drücken Sie im ersten Bild des Films die Position des Schiffes, das verfolgt werden soll. Danach wechselt der Film automatisch zum nächsten Frame.
    2. Klicken Sie auf das Bild des zweiten Rahmens, in dem sich das Gefäß befindet. Auch hier wechselt der Film automatisch zum nächsten Frame.
    3. Fahren Sie mit demselben Schiff fort, bis die vollständige Migrationsverfolgung abgeschlossen ist.
    4. Klicken Sie im Fenster Tracking auf Overlay Dots & Lines, um einen visuellen Pfad der Schiffsmigration in den Film einzuprägen. Dadurch wird eine Kopie des Films mit einem Punkt geöffnet, der die aktuelle Position des Trackers darstellt, und einer Linie, die den vorherigen Pfad anzeigt.
    5. Klicken Sie auf die Schaltfläche End Track, um die Aufzeichnung der aktuellen Schiffsbewegung abzuschließen.
    6. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Track hinzufügen, um mit einem neuen Schiff von vorne zu beginnen. Dabei ändern die Linien- und Punktmarkierungen automatisch ihre Farbe für das neue Gefäß. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle gewünschten Schiffe verfolgt sind.
      HINWEIS: Die x/y-Position, die Schiffsgeschwindigkeit und die bewegte Entfernung können aus dem Popup-Fenster Ergebnisseabgerufen werden. Jedes Schiff wird durch seine Tracknummer in der linken Spalte identifiziert. Diese Daten können kopiert und in ein Tabellenblatt eingefügt werden, um weitere Analysen durchzuführen.

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Ergebnisse

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Das vorgestellte Protokoll, das Stereolithographie-Techniken verwendet, ermöglicht die Herstellung von tessellierten Gerüsten aus SU-8 Fotolack. Gerüste mit unterschiedlichen Kompartimentgeometrien (Quadrate, Sechsecke und Kreise) und hochgenauen und wiederholbaren Merkmalen wurden erhalten (Abbildung 1).

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Diskussion

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Die Notwendigkeit eines reichen Gefäßes, das in künstliche Gewebe eingebettet ist, ist entscheidend für das Überleben des Konstrukts und die ordnungsgemäße Funktion1. Obwohl die Entwicklung des Gefäßsystems im Mittelpunkt einer großen Menge an Forschung stand, bleibt noch viel zu untersuchen und zu verstehen24. Insbesondere bei der Nachbildung eines bestimmten Gewebes sollte sich die Mikrovaskulatur entsprechend verhalten und organisieren12. Der gebr...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch Mittel der University of Michigan - Israel Partnership for Research unterstützt. Die Autoren danken Uri Merdler, Lior Debbi und Galia Ben David für ihre große Unterstützung und Unterstützung, Nadine Wang, Ph.D. und Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. der Lurie Nanofabrication Facility an der University of Michigan, sowie Luis Solorio, Ph.D. für aufschlussreiche Diskussionen über Photolithographietechniken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Angiotool FreewareNIH-CCRKostenloser Download bei https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Rinderalbumin-Serum ProbuminMillipore82-045-1
Zahnpulpa-StammzellenLonzaPT-5025
ECM Medien + Bullet KitSciencell#1001
Ethanol 96%Gadot-Gruppe64-17-5
Evicel Fibrin VersiegelungJohnson& JohnsonEVB05ILBietet sowohl Thrombin- als auch Fibrinogen (BAC2)-Lösungen
GlutaMAXGibco35050061
Ziege Anti-Maus Cy3-AntikörperJackson115-166-072
Ziege Anti-Kaninchen Alexa-Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA11034
Menschliche mikrovaskuläre FettzellenSciencell#7200
Mensch FibronektinSigmaF0895-5MGStammkonzentration: 1 mg/mL
ImageJNIHKostenloser Download bei https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IsopropylalkoholGadot-Group67-63-0
Lift-off-ReagenzKayaku Advanced Materials, IncG112850Handelsname Omnicoat
Low-glucose DMEMBiological Industries01-050-1A
Maus Anti-SMA-AntikörperDakoM0851
NEAAGibco11140068
Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBSChemCruzSC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin-LösungBiologische Industrie03-032-1B
Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaP5368-10PAK
Kaninchen-Anti-vWF-AntikörperAbcamab9378
SiliziumwaferSilicon Valley Microelectronics (SVM)Wafer 4", Typ N-1-10, 500-550 Mikrometer dick
SU-8 2050 FotolackKayaku Advanced Materials, IncY11058
SU-8 EntwicklerKayaku Advanced Materials, IncY020100
Tryton-X 100BioLab LtdArtikel-Nr.: 57836

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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