Method Article

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

DOI:

10.3791/62010

⸱

July 27th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein Antigenom zu produzieren, das wiederum als Vorlage für die Erzeugung eines Nachkommengenoms dient. Sowohl Genom- als auch Antigenom-RNAs werden vollständig durch das Nukleoprotein (N) verkapselt, um die Nukleokapsiden (NCs) zu bilden3. Da die NCs als Vorlagen für die Replikation und Transkription durch die RSV-Polymerase dienen, ist die richtige NC-Assemblierung entscheidend, damit die Polymerase Zugang zu den Vorlagen für die RNA-Synthese erhält5. Interessanterweise wird aufgrund der Strukturanalysen der NNS-Viruspolymerasen die Hypothese aufgestellt, dass mehrere N-Proteine vorübergehend von den NCs dissoziieren, um den Zugang der Polymerase zu ermöglichen und nach der RNA-Synthese wieder an RNA zu binden6,7,8,9,10,11,12.

Derzeit wurde der RSV-RNA-Polymerisationsassay unter Verwendung von gereinigter RSV-Polymerase auf kurzen nackten RNA-Vorlagen13,14etabliert. Die Aktivitäten der RSV-Polymerase erreichen jedoch nicht optimal, wie bei den nicht-prozessiven und abtreibenden Produkten beobachtet wird, die von der RSV-Polymerase bei der Verwendung nackter RNA-Schablonen erzeugt werden. Das Fehlen von NC mit virusspezifischer RNA ist eine primäre Barriere für das weitere mechanistische Verständnis der RSV-RNA-Synthese. Daher wird die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage zu einem kritischen Bedürfnis, um das grundlegende Wissen über die RSV-RNA-Synthese zu erweitern. Die bekannten Strukturen der nucleocapsid-like particles (NCLPs) von RSV und anderen NNS-RNA-Viren zeigen, dass die RNAs in den NCLPs entweder zufällige zelluläre RNAs oder durchschnittliche virale genomische RNAssind 15,16,17,18,19. Zusammen besteht die Haupthürde darin, dass N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um NCLPs zu bilden, wenn N in den Wirtszellen überexprimiert wird.

Um diese Hürde zu überwinden, haben wir ein Protokoll erstellt, um zuerst RNA-freie (N0)zu erhalten und N0 mit authentischer viraler genomischer RNA zu NCLPs20zusammenzusetzen. Das Prinzip dieses Protokolls besteht darin, eine große Menge rekombinantes RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem N mit einem Chaperon, der N-terminalen Domäne des RSV-Phosphoproteins (PNTD),co-exprimiert wird. Das gereinigteN0P konnte stimuliert und durch Zugabe von RSV-spezifischen RNA-Oligos zu NCLPs zusammengesetzt werden, und während des Assemblierungsprozesses wird das Chaperon PNTD durch die Zugabe von RNA-Oligos verdrängt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung und Densembierung von RSV-RNA-spezifischen NCs. In diesem Protokoll beschreiben wir das molekulare Klonen, die Proteinpräparation, die In-vitro-Assemblierung und die Validierung der komplexen Assemblierung. Wir stellen die Klonierungsstrategie zur Generierung bi-cistronischer Konstrukte für die Proteinkoexpression für das molekulare Klonen vor. Für die Proteinpräparation beschreiben wir die Verfahren der Zellkultur, Proteinextraktion und der Aufreinigung des Proteinkomplexes. Anschließend diskutieren wir die Methode zur in vitro Assemblierung der RSV-RNA-spezifischen NCs. Schließlich verwenden wir Größenausschlusschromatographie (SEC) und negative Färbungselektronenmikroskopie (EM), um die zusammengesetzten NCLPs zu charakterisieren und zu visualisieren.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Molekulares Klonen

HINWEIS: Ligase Independent Cloning (LIC) wurde verwendet, um ein RSV bi-cistronic Coexpressionskonstrukt Plasmid herzustellen. LIC ist eine in den frühen 1990er Jahren entwickelte Methode, die die 3'-5' Exo-Aktivität der T4-DNA-Polymerase nutzt, um Überhänge mit Komplementarität zwischen dem Vektor und dem DNA-Insert21,22zu erzeugen. Die Konstrukte wurden unter Verwendung der 2BT-10-Vektor-DNA hergestellt, die aus einem 10-fachen His-Tag am N-Terminal des Open Reading Frame (ORF) besteht(Abbildung 1).

  1. Linearisierung von LIC-Vektoren mit SSPI-Aufschluss.
    1. Kombinieren Sie 10 μL SSPI 10X-Puffer, 4 μL SSPI-Enzym in einer Konzentration von 5 U/ μL, das äquivalente Volumen von 5 μg Vektor-Miniprep-DNA und sterile ddH2O bis 100 μL.
    2. Den Digest 3 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    3. Führen Sie den Digest mit einem 1,0% igen Agarosegel für die Extraktion von Vektor-DNA aus.
    4. Verwenden Sie ein Gelextraktionskit, um die Extraktion und Reinigung durchzuführen. Suspendieren Sie das endende Volumen der Vektor-DNA in 30 μL ddH2O und lagern Sie es bei -20 °C.
  2. Bereiten Sie die DNA-Inserts fürN 1-391 und P1-126 mit dem N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer und P1-126 Reverse Primer vor (Tabelle 1).
    HINWEIS: Es gibt eine ausreichende Überlappung mit dem linearisierten Vektor, um eine Schmelztemperatur zwischen 55 °C und 60 °C zu gewährleisten. Für den umgekehrten Primer gibt es aus dem gleichen Grund eine ausreichende Überlappung mit dem umgekehrten komplementären Strang des linearisierten Vektors.
    1. Führen Sie eine PCR-Amplifikation des DNA-Inserts unter Verwendung der Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 durch.
    2. Extrahieren Sie den amplifizierten DNA-Insert. Führen Sie die PCR-Produkte aus dem vorherigen Schritt auf einem 1,0% igen Agarosegel aus, extrahieren und reinigen Sie dann die Bänder durch Gelextraktion. Suspendieren Sie das endvolumen der extrahierten DNA in 15 μL ddH2O.
  3. T4 DNA Polymerase Behandlung von Vektor- und Insert-DNA (Tabelle 4).
    HINWEIS: Die Behandlung muss getrennt für die Vektor-DNA und die Insert-DNA durchgeführt werden.
    1. Inkubieren Sie die Mischung für 40 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wird die Polymerase bei 75 °C für 20 Minuten heiß inaktiviert. Lagern Sie das Reaktionsgemisch bei -20 °C.
  4. Glühen Sie den LIC-Vektor und den Insert-Vektor.
    1. Richten Sie eine Negativkontrolle mit 2 μL LIC-Vektor-DNA und 2 μL sterilem ddH2O ein.
    2. Kombinieren Sie 2 μL Insert-DNA und 2 μL LIC-Vektor-DNA aus den vorherigen T4-DNA-Polymerase-Reaktionen in einem 0,2-ml-Röhrchen.
    3. Führen Sie die Glühreaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten durch.
    4. Löschen Sie die Reaktion mit 1,3 μL EDTA in einer Konzentration von 25 mM.
    5. Wandeln Sie die Reaktion in 100 μL E. coli Top10 kompetente Zellen um und platten Sie sie auf einer Ampicillin-Selektionsplatte23,24.
  5. Identifizieren Sie die positiven Konstrukte.
    1. Bereiten Sie die Plasmid-Miniprep-Lösung vor. Dies kann durch Kolonie-Picking und Impfung in LB-Medien erfolgen. Normalerweise sind 3 Kolonien ausreichend.
    2. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 °C.
    3. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4.560 x g für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
    4. Resuspendieren Sie die Pellets in 250 μL P1-Puffer und bereiten Sie Plasmid-Minipreps mit einem Spin-Miniprep-Kit vor.
    5. Führen Sie eine Verdauungsanalyse des Miniprep-Produkts mit AseI oder anderen Restriktionsenzymen durch.
    6. Laden Sie die Proben auf 0,8% Agarosegel und führen Sie das verdaute Plasmid aus. Analysieren Sie das Gel unter einer UV-Lampe.
    7. Verwenden Sie einen Sequenzierungsdienst, um die Sequenz des positiven Produkts zu validieren.
  6. Erhalten Sie den Coexpressions-DNA-Insert.
    1. Führen Sie eine PCR durch, um N1-391 und P1-126 unter Verwendung der zuvor konstruierten 2BT-10 N1-391 und 2BT-10 P1-126 als Vorlagen zu erhalten.
    2. Führen Sie die1. PCR durch, um N1-391 aus dem Konstrukt 2BT-10N 1-391 unter Verwendung der PCR-Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 mit dem N1-391 Forward Primer und Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG zu erhalten.
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
    3. Führen Sie die2. PCR durch, um P1-126 aus dem 2BT-10 P1-126-Konstrukt mit dem Forward Primer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC zu erhalten.
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́und der P1-126 Reverse Primer (verwenden Sie die PCR-Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3).
    4. Schließlich wird eine Überlappungs-PCR an den gemischten Produkten der vorherigen 2 PCR-Reaktionen durchgeführt, um N1-391 und P1-126zu verschmelzen. Verwenden Sie den N1-391 Forward Primer und den P1-126 Reverse Primer. Verwenden Sie die PCR-Bedingungen in Tabelle 5 und Tabelle 6.
  7. Verbinden Sie den Vektor und den DNA-Insert.
    1. Behandeln Sie das Überlappungs-PCR-Produkt mit T4-DNA-Polymerase gemäß dem Protokoll in Schritt 1.3.
    2. Glühen Sie den LIC-Vektor und das PCR-Produkt nach dem Protokoll in Schritt 1.4.
    3. Identifizieren Sie die positiven Konstrukte nach dem Protokoll in Schritt 1.5.

2. Proteinexpression und -reinigung

HINWEIS: Verwenden Sie E. coli für das bi-cistronische Konstrukt der Koexpression von N und P. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C, führen Sie die Expression jedoch bei einer reduzierten Temperatur (16 °C) über Nacht durch. Reinigen Sie die Proteinkomplexe durch eine Kombination aus Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2).

  1. Verwenden Sie den Stamm E. coli BL21(DE3) für die Proteinproduktion. Züchten Sie 4 L Zellkulturen bei 37 °C in LB (Luria Broth) Medium, bis OD600 0,6 erreicht.
  2. Senken Sie die Temperatur auf 16 °C. Eine Stunde später induzieren Sie die Expression mit 0,5 mM Isopropyl 1-thio--D-Galactopyranosid (IPTG) über Nacht.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.104 x g für 25 min und verwerfen Sie dann den Überstand.
  4. Die Zellpellets werden in 200 ml Lysepuffer A (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 10% Glycerin und 0,2% NP40) resuspendiert. Verwenden Sie 50 ml Lysepuffer, um die Zellpellets aus 1 L Zellkultur wieder aufzubelasten.
  5. Lyse der Zellen durch Beschallung für 15 minuten, 3 Sekunden an und 3 Sekunden aus. Dann Zentrifugenzellen bei 37.888 x g für 40 min.
    HINWEIS: Das Protokoll kann durch Einfrieren der Zellen vor der Beschallung in einem -80 °C-Gefrierschrank unterbrochen werden.
  6. Laden Sie den Überstand in eine Kobalt-Schwerkraftsäule (Durchmesser x Länge: 2,5 cm x 10 cm) mit ~10mL Perlen vorbalanviert mit 5-10 Säulenvolumina (CV) des Lysepuffers.
  7. Waschen Sie die Säule mit 5 CV Puffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% Glycerin und 5 mM Imidazol) und 5 CV Puffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% Glycerin und 5 mM Imidazol).
  8. Eluieren Sie das Protein aus den Perlen mit 2 CV Puffer D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl und 250 mM Imidazol).
  9. Verdünnen Sie das eluierte Protein 5x mit QA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerin) für die Q-Säule.
  10. Waschen Sie die 5 ml Q-Säule mit QA-Puffer, um die Säule auszugleichen, und laden Sie dann die verdünnte Probe mit der Peristaltikpumpe (z. B. Kaninchen) in die Q-Säule.
  11. Laden Sie die Q-Säule zusammen mit QA-Puffer und QB-Puffer (50 mM Tris-HCl pH7,4, 1,5 M NaCl, 5% Glycerin) in die HPLC-Maschine. Stellen Sie den Durchfluss auf 1 ml/min ein.
  12. Führen Sie das Programm "Pump Wash" aus, um die Maschine mit QB-Puffer zu waschen, gefolgt von QA-Puffer (1-2 CVs / jeweils). Stellen Sie den Systemdurchfluss auf 3 ml/min ein.
  13. Stellen Sie UV1 auf 280 nm und UV2 auf 260 nm ein. Verwenden Sie eine 96-Tiefbrunnenplatte, um die Fraktionen zu sammeln.
  14. Elute Proteine mit einem schrittweisen Gradienten des Elutionsmittels (QB Buffer), wobei 3-4 CV jeder Konzentration angewendet werden, wobei der Prozentsatz jedes Mal ab 0% QB um 5% erhöht wird. N0P Proteinkomplex wird bei 15% QB Buffer herauskommen.
  15. Sobald das gesamte Protein eluiert ist, waschen Sie die Säule mit 100% QB Buffer (2 CV).
  16. Isolieren Sie das Protein durch Gelfiltration Superdex 200 Erhöhen Sie die 10/300 GL Säule (Durchmesser x Länge: 1,0 cm x 30 cm) und gleichen Sie mit Puffer E (20 mM HEPES pH 7,4 und 200 mM NaCl) aus.
  17. Analysieren Sie proteinhaltige Fraktionen mit SDS-PAGE.

3. In-vitro-Assemblierung der virusspezifischen NC

HINWEIS: Die In-vitro-Assemblierung des RSV-spezifischen NC (N:RNA) wurde durch Inkubation des präpariertenN0P-Komplexes mit RNA-Oligos durchgeführt. Dann wurde die SEC-Chromatographie verwendet, um den Assemblierungskomplex von der N0P und überschüssiger RNA zu trennen (Abbildung 2).

  1. Mischen und inkubieren Sie den gereinigtenN0P-Komplex mit RNA-Oligo mit dem molekularen Verhältnis von 1:1,5 bei Raumtemperatur für 1 Stunde, in der Regel reicht 1 ml des Proteins N0P mit einer Konzentration von 1 mg/ml für den nächsten Schritt. Richten Sie die Kontrollprobe ein, die nur die gleiche Menge an N0P-Protein enthält.
  2. Vorgleichung der Gelfiltration Superdex 200 Erhöhen Sie die 10/300 GL Säule mit dem Puffer E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
  3. Zentrifugieren Sie die Probe mit 21.130 x g für 15 min, entfernen Sie eventuelle Niederschläge und laden Sie den Überstand in die SEC-Säule.
  4. Vergleichen Sie die SEC-Chromatographiebilder von N:RNA-Assemblierungsprobe und N0P-Kontrollprobe, kombinieren Sie das A260/A280-Verhältnis, um zu identifizieren, welche Peaks die zusammengesetzte N-RNA,N 0P und freie RNA sind.
  5. Sammeln Sie die Spitzenfraktionen, führen Sie das SDS-PAGE-Gel aus oder erstellen Sie Gitter.
  6. Sammeln Sie für den N-RNA-Komplex alle Fraktionen des N-RNA-Peaks, führen Sie die RNA-Extraktion durch und führen Sie das Urea-PAGE-Gel aus, um die Länge der spezifischen RNA zu überprüfen, die im ersten Schritt gemischt und inkubiert wird.

4. Negative Fleckengitter erstellen

HINWEIS: Die Negativfleckenelektronenmikroskopie (EM) ist eine Methode, bei der die Moleküle an einen Kohlenstofffilm adsorbiert und dann in eine Schicht aus Schwermetallatomen eingebettet werden. Negative Flecken EM erzeugt einen hohen Bildkontrast, so dass es einfach ist, die Partikel zu sehen und rechnerisch auszurichten. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Adsorption der Partikel an einen Kohlenstofffilm die Moleküle in der Regel dazu veranlasst, mit wenigen bevorzugten Orientierungen am Gitter zu haften. Wenn sich die Moleküle in einer ähnlichen Ausrichtung befinden, ist es einfach, sie in strukturell unterschiedliche Klassen zu unterteilen. Negative Flecken-EM ist daher die geeignete Technik, um die Probenvorbereitung zu leiten25,26 ( Abbildung3).

  1. Mikrowelle oder Erhitzen Sie 5 mL ddH 2 O ineinemkleinen Glasbecherglas mit einer Wolframheizung, bis es kocht.
  2. Wiegen Sie 37,5 mg Uranylformiat und fügen Sie 5 ml erhitztes ddH2O hinzu, um eine 0,75% ige Uranylformiat-Färbelösung herzustellen. Unter einem mit Aluminiumfolie überzogenen Becherglas zum Schutz vor Licht umrühren.
  3. 4 μL 10 M NaOH in die Färbelösung geben und 15 min vor Licht geschützt weiterrühren.
  4. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-mm-Filter in ein Reagenzglas.
  5. Verwenden Sie Glühentladung, um die kontinuierlichen kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter hydrophil zu machen27.
    HINWEIS: Die Netze befinden sich in einer Kammer, die an eine Stromversorgung angeschlossen ist. Wenn Hochspannung angelegt wird, ionisiert das Gas in der Kammer und die negativ geladenen Ionen lagern sich auf den Kohlenstoffgittern ab, um sie hydrophil zu machen.
  6. Schneiden und falten Sie einen Parafilmstreifen. Pipetieren Sie 2 Tropfen des Puffers auf einer Seite des Parafilms und pipetieren Sie weitere 2 Tropfen 40 μL Färbelösung auf die andere Seite.
  7. Um die EM-Kohlenstoffgitter herzustellen, tragen Sie 3 μL Proteinprobe für 1 Minute auf.
  8. Bloten Sie die Gitter gegen ein Löschpapier.
    HINWEIS: Die Gitter werden 2x mit Puffer und 1x mit der 0,75% igen Uranylformiat-Färbelösung nach jedem Schritt gewaschen.
  9. Halten Sie die Gitteroberfläche im zweiten Tropfen von 0,75% Uranylformiat-Färbelösung für 30 Sekunden.
  10. Das Gitter gegen ein Löschpapier abtreichen, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen und das Gitter an der Luft trocknen zu lassen.
  11. Speichern Sie die Raster vor der Bildgebung im Rasterfeld.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufreinigung des RNA-freienN0P-Proteins
Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer RSV N0P-Komplex erhalten werden. Die volle Länge des N- und N-terminalen Teils der P-Proteine wurde mit 10X His-Tag auf dem N-Protein in E. colico-exprimiert. N0P wurde mit einer Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. N0P enthält sowohl das N- als auch das N-Terminal P in voller Länge, enthielt jedoch keine z...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit eine...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSIgmaA9539-500GHerstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
Amicon Ultra-15 ZentrifugalfiltereinheitMilliporeUFC901024Konzentrat der Proteinprobe
Ampicillin-NatriumGOLD BIOTECHNOLOGIE5118.111317EinAntibiotikum für die Zellkultur
AseINEBR0526SHerstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
Kobalt (Hohe Dichte) Agarose-PerlenGold BioH-310-500Für die Reinigung von His-Tag-Protein
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBErhitzen Sie die Probe
dCTPInvitrogen10217016Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
dGTPInvitrogen10218014Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
GlycerinSigmaG5516-4LLösung zur Herstellung
HEPESSigmaH3375-100GLösung zur Herstellung
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Proteinaufreinigung
ImidazolSigmaI5513-100GLösung zur Herstellung
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid)GOLD BIOTECHNOLOGIE1116.071717Ainduzieren die Expression von Protein
MikrozentrifugenröhrchenVWR47730-598für PCR
Misonix Sonicator XL2020 UltraschallflüssigkeitsprozessorSpectraLabMSX-XL-2020Ultraschallgerät für die Lysezelle
Negative FärbegitterElektronenmikroskopie SciencesCF400-Cu-THFür die Herstellung von negativen Färbegittern
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Shaker für die Kultivierung der
Zelle Nonidet P 40 ErsatzSigma74385-1LHerstellungslösung
OneTaq DNA-PolymeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706Aufreinigung
DNA SSPI-HFNEBR3132SHerstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
Superose 6 Erhöhung 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Proteinaufreinigung
T4 DNA PolymeraseSigma70099-3Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus ZentrifugeFisher Scientific36-101-0816Zentrifuge, höchste Drehzahl 20.000 U/min
Trizma-HydrochloridSigmaT3253-250GHerstellungslösung
Uranylformiat-ElektronenmikroskopieSciences22451Herstellung negativer Färbelösung
von

References

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