Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).
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Methodenartikel
Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.
Einleitung
Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein....
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Protokoll
1. Molekulares Klonen
HINWEIS: Ligase Independent Cloning (LIC) wurde verwendet, um ein RSV bi-cistronic Coexpressionskonstrukt Plasmid herzustellen. LIC ist eine in den frühen 1990er Jahren entwickelte Methode, die die 3'-5' Exo-Aktivität der T4-DNA-Polymerase nutzt, um Überhänge mit Komplementarität zwischen dem Vektor und dem DNA-Insert21,22zu erzeugen. Die Konstrukte wurden unter Verwendung der 2BT-10-Vektor-DNA hergestellt, die aus einem 10-fachen His-Tag am N-Terminal des Open Reading Frame (ORF) besteht(Abbildung 1).
- Li....
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Ergebnisse
Aufreinigung des RNA-freienN0P-Proteins
Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer RSV N0P-Komplex erhalten werden. Die volle Länge des N- und N-terminalen Teils der P-Proteine wurde mit 10X His-Tag auf dem N-Protein in E. colico-exprimiert. N0P wurde mit einer Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. N0P enthält sowohl das N- als auch das N-Terminal P in voller Länge, enthielt jedoch keine z.......
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Diskussion
Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit eine.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | SIgma | A9539-500G | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit | Millipore | UFC901024 | Konzentrat der Proteinprobe |
| Ampicillin-Natrium | GOLD BIOTECHNOLOGIE | 5118.111317Ein | Antibiotikum für die Zellkultur |
| AseI | NEB | R0526S | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| Kobalt (Hohe Dichte) Agarose-Perlen | Gold Bio | H-310-500 | Für die Reinigung von His-Tag-Protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Erhitzen Sie die Probe |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| Glycerin | Sigma | G5516-4L | Lösung zur Herstellung |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | Lösung zur Herstellung |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Proteinaufreinigung |
| Imidazol | Sigma | I5513-100G | Lösung zur Herstellung |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) | GOLD BIOTECHNOLOGIE | 1116.071717A | induzieren die Expression von Protein |
| Mikrozentrifugenröhrchen | VWR | 47730-598 | für PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultraschallflüssigkeitsprozessor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | Ultraschallgerät für die Lysezelle |
| Negative Färbegitter | Elektronenmikroskopie Sciences | CF400-Cu-TH | Für die Herstellung von negativen Färbegittern |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker für die Kultivierung der |
| Zelle Nonidet P 40 Ersatz | Sigma | 74385-1L | Herstellungslösung |
| OneTaq DNA-Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Aufreinigung |
| DNA SSPI-HF | NEB | R3132S | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| Superose 6 Erhöhung 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Proteinaufreinigung |
| T4 DNA Polymerase | Sigma | 70099-3 | Herstellung eines Konstrukts mit der LIC-Methode |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Zentrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Zentrifuge, höchste Drehzahl 20.000 U/min |
| Trizma-Hydrochlorid | Sigma | T3253-250G | Herstellungslösung |
| Uranylformiat-Elektronenmikroskopie | Sciences | 22451 | Herstellung negativer Färbelösung |
Referenzen
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2....
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Nachdrucke und Genehmigungen
