Method Article

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

DOI:

10.3791/62109

⸱

July 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine zuverlässige Genexpressionskontrolle in Säugetierzellen erfordert Werkzeuge mit hoher Faltenänderung, geringem Rauschen und bestimmten Input-to-Output-Transferfunktionen, unabhängig von der verwendeten Methode. Um dieses Ziel zu erreichen, haben optogenetische Genexpressionssysteme in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit für die raumzeitliche Kontrolle des Proteinspiegels in Säugetierzellen gewonnen. Die meisten bestehenden Schaltkreise, die die lichtinduzierte Genexpression steuern, variieren jedoch in der Architektur, werden von Plasmiden exprimiert und verwenden variable optogenetische Ausrüstung, was die Notwendigkeit schafft, die Charakterisierung und Standardisierung optogenetischer Komponenten in stabilen Zelllinien zu erforschen. Hier bietet die Studie eine experimentelle Pipeline zuverlässiger Genschaltungskonstruktion, -integration und -charakterisierung zur Kontrolle der lichtinduzierbaren Genexpression in Säugetierzellen, wobei ein optogenetischer Schaltkreis mit negativer Rückkopplung als Fallbeispiel verwendet wird. Die Protokolle veranschaulichen auch, wie die Standardisierung optogenetischer Geräte und Lichtregime Genschaltungsmerkmale wie Genexpressionsrauschen und Proteinexpressionsgröße zuverlässig aufdecken kann. Schließlich kann dieses Papier für Laboratorien von Nutzen sein, die mit Optogenetik nicht vertraut sind und eine solche Technologie anwenden möchten. Die hier beschriebene Pipeline sollte für andere optogenetische Schaltkreise in Säugetierzellen gelten, was eine zuverlässigere, detailliertere Charakterisierung und Kontrolle der Genexpression auf transkriptioneller, proteomischer und letztendlich phänotypischer Ebene in Säugetierzellen ermöglicht.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ähnlich wie andere Ingenieurdisziplinen zielt die synthetische Biologie darauf ab, Protokolle zu standardisieren, so dass Werkzeuge mit hochgradig reproduzierbaren Funktionen zur Untersuchung von Fragen verwendet werden können, die für biologische Systeme relevant sind1,2. Ein Bereich in der synthetischen Biologie, in dem viele Kontrollsysteme aufgebaut wurden, ist der Bereich der Genexpressionsregulation3,4. Die Genexpressionskontrolle kann sowohl auf Proteinspiegel als auch auf Variabilität (Rauschen oder Variationskoeffizient, CV = σ/μ, gemessen als Standardabweichung vom Mittelwert) abzielen, die aufgrund ihrer Rolle in physiologischen und pathologischen Zellzuständen entscheidende zelluläre Merkmale sind5,6,7,8. Viele synthetische Systeme, die den Proteingehalt und das Rauschen4,9,10,11,12 kontrollieren können, wurden entwickelt, um Möglichkeiten zur Standardisierung von Protokollen über Werkzeuge hinweg zu schaffen.

Eine neuartige Reihe von Werkzeugen, die Gennetzwerke kontrollieren können, die kürzlich entstanden sind, ist die Optogenetik, die die Verwendung von Licht zur Kontrolle der Genexpression ermöglicht13,14,15,16,17. Ähnlich wie ihre chemischen Vorgänger können optogenetische Genschaltkreise in jeden Zelltyp eingeführt werden, von Bakterien bis hin zu Säugetieren, was die Expression jedes nachgeschalteten Gens von Interesse ermöglicht18,19. Aufgrund der schnellen Generierung neuartiger optogenetischer Werkzeuge sind jedoch viele Systeme entstanden, die sich in der genetischen Schaltungsarchitektur, dem Expressionsmechanismus (z. B. plasmidbasierte vs. virale Integration) und der lichtversorgenden Kontrollausrüstung unterscheiden11,16,20,21,22,23,24,25 . Daher bleibt Raum für die Standardisierung optogenetischer Merkmale wie Genschaltungsaufbau und -optimierung, Methode der Systemnutzung (z. B. Integration vs. transiente Expression), experimentelle Werkzeuge für die Induktion und Analyse der Ergebnisse.

Um Fortschritte bei der Standardisierung optogenetischer Protokolle in Säugetierzellen zu erzielen, beschreibt dieses Protokoll eine experimentelle Pipeline zur Entwicklung optogenetischer Systeme in Säugetierzellen am Beispiel eines in HEK293-Zellen integrierten Genschaltkreises mit negativem Feedback (NF), der in HEK293-Zellen (humane embryonale Nierenzelllinie) integriert ist. NF ist ein ideales System, um Standardisierung zu demonstrieren, da es in der Natur reichlich vorhanden ist26,27,28, so dass der Proteingehalt abgestimmt und eine Geräuschminimierung erfolgen kann. Kurz gesagt, NF ermöglicht eine präzise Genexprimationskontrolle durch einen Repressor, der seine eigene Expression ausreichend schnell reduziert, wodurch jede Veränderung weg von einem stationären Zustand begrenzt wird. Der stationäre Zustand kann durch einen Induktor verändert werden, der den Repressor inaktiviert oder eliminiert, um eine höhere Proteinproduktion zu ermöglichen, bis für jede Induktorkonzentration ein neuer stationärer Zustand erreicht wird. Vor kurzem wurde ein technisch entwickeltes optogenetisches NF-System entwickelt, das eine breitdynamische Reaktion der Genexpression erzeugen, ein geringes Rauschen aufrechterhalten und auf Lichtreize reagieren kann, was das Potenzial für eine räumliche Genexpressionskontrolle ermöglicht11. Diese Werkzeuge, die als lichtinduzierbare Tuner (LITer) bekannt sind, wurden von früheren Systemen inspiriert, die die Genexpressionskontrolle in lebenden Zellen ermöglichten4,10,29,30 und stabil in menschliche Zelllinien integriert wurden, um eine langfristige Genexpressionskontrolle zu gewährleisten.

Hier wird am Beispiel des LITers ein Protokoll zur Schaffung lichtreaktionsfähiger Genschaltkreise, zur Induktion der Genexpression mit einem Light Plate Apparatus (LPA, einer optogenetischen Induktionshardware)31 und zur Analyse der Reaktionen der manipulierten, optogenetisch kontrollierbaren Zelllinien auf kundenspezifische Lichtreize skizziert. Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, die LITer-Tools für jedes funktionelle Gen zu verwenden, das sie erforschen möchten. Es kann auch für andere optogenetische Systeme mit unterschiedlichen Schaltungsarchitekturen (z. B. positives Feedback, negative Regulation usw.) angepasst werden, indem die unten beschriebenen Methoden und optogenetischen Geräte integriert werden. Ähnlich wie bei anderen Protokollen der synthetischen Biologie können die hier beschriebenen Videoaufzeichnungen und optogenetischen Protokolle in Einzelzellstudien in verschiedenen Bereichen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebsbiologie, Embryonalentwicklung und Gewebedifferenzierung.

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Protocol

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1. Design von Genschaltkreisen

  1. Wählen Sie genetische Komponenten aus, die zu einem einzigen Genschaltkreis/Plasmid kombiniert werden sollen (z. B. Sequenzmotive der DNA-Integration von Säugetieren32, lichtempfindliche Elemente33 oder funktionelle Gene34).
  2. Speichern Sie die DNA-Sequenzen zur späteren Verwendung und Referenz mit gentechnischer und/oder molekularer Klonierungssoftware, kommentieren Sie jede Sequenz und untersuchen Sie alle erforderlichen Merkmale (z. B. START-Codons, regulatorische oder übersetzte Sequenzen)35.
  3. Entwickeln oder übernehmen Sie Teile entsprechend dem gesamten Genschaltungsdesign36. Beispiel: Bei optogenetischen Repressoren wie bei den LITern11 wird eine Gensequenz verschmolzen, die für eine Domäne kodiert, die zum lichtinduzierbaren Abbau37,38 oder zur Inaktivierung der DNA-Bindungsfähigkeit eines Repressors39 neben und im Rahmen des Repressor-Gens (z. B. TetR) fähig ist4.
    1. Stellen Sie bei optogenetischen Aktivatoren sicher, dass eine Aktivatordomäne40 vorhanden ist, die die Genexpression bei lichtinduzierter DNA-Bindung fördert41. Stellen Sie bei negativer oder positiver Autoregulation sicher, dass eine regulatorisch bindende Stelle im oder vor dem Promotor des Regulatorgens vorhanden ist (z. B. tetO-Stellen im oder oberhalb des TetR-exprimierenden Promotors)42.
  4. Entwerfen Sie die Primer für die DNA-Sequenzamplifikation oder Sequenzierung des Plasmids mit der molekularen Klonierungssoftware für jeden Genschaltkreis.
  5. Validieren Sie die Primer rechnerisch für die Plasmidkonstruktion durch die integrierten Festmahle der molekularen Klonierungssoftware (z. B. Sequenzausrichtung).
  6. Oligonukleotid-Primer beim Hersteller bestellen. Plasmide, die in dieser Arbeit konstruiert und verwendet werden, finden sich im ursprünglichen Trägermaterial11 zusammen mit den entworfenen und verwendeten Primern.
  7. Verdünnen Sie die Primer auf 100 mM Stammkonzentration in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O).
  8. Verdünnen Sie den Bestand von 100 mM Stammprimern auf eine Konzentration von 10 mM für die PCR.
  9. Bereiten Sie die PCR-Mischung mit 1 μL Vorwärtsprimer, 1 μL Reverse-Primer, 1 μL Template-DNA auf eine Gesamtmasse von 0,5-500 ng für genomische oder 0,5 pg-5 ng für Plasmid- oder virale DNA, 12,5 μL DNA-Polymerase 2x Master-Mix (oder das Volumen, das den Verdünnungsfaktor des Herstellers erfüllt) und 9,5 μL ddH2O für ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 μL vor.
  10. Inkubieren Sie die PCR-Mischung in einem Thermocycler in geeigneten Einstellungen, abhängig vom gewählten Enzym43. Zu den vorgeschlagenen Reaktionszyklen gehören:
    Schritt 1: Ein Zyklus von 30 s anfänglichem Denaturierungsschritt bei 95 °C.
    Schritt 2: 40 Zyklen à 5 s Denaturierungsschritt bei 98 °C.
    Schritt 3: Ein Zyklus von 30 s Glühschritt bei 65 °C (bestimmt durch zuvor entworfene Primer).
    Schritt 4: Ein Zyklus von 1 min Verlängerung bei 72 °C (~1 Kilobase (kb) Vorlagenfragmentlänge).
    Schritt 5: Ein Zyklus einer 2-minütigen Verlängerung bei 72 °C.
    Halten Sie die Reaktion bei 4 °C, bis sie mittels Gelelektrophorese getestet werden kann. Dieses Protokoll variiert je nach den verwendeten Reagenzien (z. B. Polymerase und Puffer).
  11. Wiederholen Sie Schritt 1.9, um alle Fragmente zu amplifizieren, die in einer DNA-Montagereaktion verwendet werden sollen, die für die Verknüpfung linearer PCR-Produkte zu einem einzigen zirkulären DNA-Vektor erforderlich ist.
  12. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1% igen Agarosegel aus, gefolgt von der Reinigung der Banden der gewünschten Länge.
  13. Bereiten Sie das Master-Mix für eine DNA-Assemblierungsreaktion vor (Tabelle 1).
    HINWEIS: In diesem Beispiel wird der Muttervektor in zwei Fragmente aufgeteilt, um die Effizienz der PCR-Schritte zu erhöhen, ohne signifikante Änderungen am Gesamtergebnis der Montage zu verursachen.
  14. Inkubieren Sie die DNA-Montagereaktions-Mastermischung in einem Thermocycler bei 50 °C für 1 h (sofern im DNA-Assemblierungsreagenz-Protokoll nicht anders angegeben) und lagern Sie die Reaktion bei 4 °C, um das Reaktionsprodukt für die bakterielle Transformation zu verwenden.
  15. Richten Sie die bakterielle Transformation (chemische oder Elektroporation) unter Verwendung kompetenter E. coli-Zellen (Escherichia coli) und des entsprechenden bakteriellen Transformationsprotokolls ein. Verwenden Sie nach der Transformation die bakteriellen Luria-Bertani (LB) -Agarplatten, die den gewählten bakteriellen Selektionsmarker (z. B. Ampicillin) enthalten, um die Transformationsmischung zu platten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren44.
  16. Überprüfen Sie die Platten am nächsten Tag. Um die Kolonien zu impfen, pflücken Sie einzelne Kolonien aus den Platten und suspendieren Sie sie in einer flüssigen LB-Brühe mit dem entsprechenden bakteriellen Selektionsmarker in Kulturröhrchen. Inkubieren Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 ° C, 300 U / min über Nacht.
  17. Führen Sie ein Plasmidpräparationsprotokoll durch, um die Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur zu extrahieren.
  18. Überprüfen Sie die Schaltung in zwei Schritten. Führen Sie zunächst einen Testaufschluss mit Restriktionsenzymen als grobe Überprüfung durch, um zu sehen, ob das ungefähre Plasmidprodukt erhalten wurde. Zweitens, wenn der Testaufschluss bestanden / bestätigt wird, senden Sie das Plasmid an eine Sanger-Sequenzierungsanlage (oder einen Prozess mit der verfügbaren Ausrüstung), um die genaue DNA-Sequenz zu erhalten, um sie später mit der erwarteten Sequenz in der Designsoftware zu vergleichen.
    1. Um den Testaufschluss durchzuführen, wählen Sie mindestens zwei Restriktionsenzyme aus, die mindestens zwei Fragmente produzieren, basierend auf der verwendeten molekularen Klonierungssoftware. Sobald die Enzyme ausgewählt sind, bereiten Sie die Testproben vor, indem Sie 1 μL jedes Enzyms, 5 μL der erzeugten DNA und 13 μL Wasser mit geeigneten Salzen und Puffern hinzufügen, abhängig von den verwendeten Enzymen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 1 h, oder wie der Enzymhersteller vorschlägt. Führen Sie die Testaufschlussprodukte auf einem 1% igen Agarosegel durch und stellen Sie fest, ob die Banden korrekt sind.
      HINWEIS: Wenn die Bänder korrekt sind, fahren Sie mit der Sequenzierung fort.
    2. Um die Sequenzierung durchzuführen, erzeugen Sie Primer basierend auf der in der Software gespeicherten DNA, so dass die Glühbereiche der Primer etwa 500 bp (Basenpaare) voneinander entfernt sind und das interessierende Fragment (Genschaltkreiskomponente) oder das vollständige Plasmid abdecken. Verdünnen Sie die Primer mit reinem nukleasefreiem Wasser (NF-H2O) auf 10 mM Konzentration. Bereiten Sie die Sequenzierungsproben vor, indem Sie 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL Primer und 8 μL NF-H2O zu einer 0,2 ml Röhre hinzufügen. Wiederholen Sie dies für jede Grundierung.
      HINWEIS: Wenn die Proben vorbereitet sind, geben Sie sie in der Sequenzierungsanlage ab und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der Plasmidsequenz unter Verwendung einer molekularen Klonierungssoftware.
  19. Erzeugen Sie in diesem Schritt etwa 100-1000 ng / μL DNA-Probe zur Integration der plasmidhaltigen Genschaltkreise in die entsprechende Zelllinie.

2. Stabiles Zelllinien-Engineering

  1. Bestellen Sie eine Säugetierzelllinie, die für die schnelle Erzeugung stabiler Unterlinien entwickelt wurde, die eine hohe Expression des interessierenden Proteins aus einem Expressionsvektor für Säugetiere gewährleisten. Der Zelltyp und die Leichtigkeit des Zelllinien-Engineerings können variabel sein, je nachdem, was die Benutzer bevorzugen oder erreichen wollen.
    1. Wenn Benutzer beispielsweise Zelllinien-Engineering mit minimalen Zwischenschritten bevorzugen, ordnen Sie die Zellen, die eine einzige stabile Integrationsstelle (z. B. FRT) enthalten, an einem transkriptionell aktiven genomischen Locus. Wenn ein nuancierteres Zell-Engineering bevorzugt wird, erstellen Sie Integrationszentren an bevorzugten Standorten mit gentechnischen Tools wie CRISPR/Cas9.
  2. Züchten Sie Zellen in 5% CO2 in befeuchteter Luft bei 37 °C. Passen Sie die Wachstumsbedingungen nach Bedarf für den Zelltyp an.
  3. Transfizieren Sie die oben entworfenen Genschaltkreise in den gewünschten Zellen, die aus den vorherigen Schritten erhalten wurden, um einen stabilen Zelllinien-Generationsprozess zu beginnen. Um dies zu erreichen, verwenden Sie eine Liposomenmischung45 des Genkreislaufs DNA mit geeigneter Rekombinase (z. B. Flp-Rekombinase für Flp-FRT-Rekombination) oder durch andere Methoden wie Elektroporation.
  4. Zwei Tage nach der Transfektion teilen Sie die Zellen auf 25% Konfluenz.
  5. Beginnen Sie sechs Stunden nach der Spaltung der Zellen mit der Antibiotikaauswahl, indem Sie das Medium gegen ein frisches Medium austauschen, das 50 μg/ml Hygromycin-Antibiotikum enthält (oder ein anderes antibiotisches Mittel, das dem während der Plasmidkonstruktion gewählten Antibiotikaresistenzgen für Säugetiere entspricht).
    HINWEIS: Es gibt eine Vielzahl von Antibiotikaresistenzgenen für Säugetiere, die bei der Konstruktion von Genschaltkreisen verwendet werden, von denen jedes eine andere Abtötungskurve aufweist. Unabhängig davon, welches Antibiotikaresistenzgen für Säugetiere für die Schaltungskonstruktion ausgewählt wird, sollte daher eine geeignete Abtötungskurve in den interessierenden Zellen untersucht werden. Dieser Schritt stellt sicher, dass Zellen, die die Nutzlast des Genkreislaufs enthalten, angereichert werden, während Zellen ohne System abgetötet werden.
  6. Lassen Sie die Zellen in den antibiotischen Selektionsmedien wachsen, wechseln Sie alle 2-3 Tage zu frischen Medien, bis die Platte oder der Kolben einige Dutzend Herde hat. Passage adhärente Kulturen, wenn sie sich in der Log-Phase befinden, bevor sie den Zusammenfluss erreichen.
  7. Sobald genügend Herde vorhanden sind, trypsinisieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin, 0,1% EDTA in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Kalzium, Magnesium und Natriumbicarbonat für mehrere Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin mit frischen Medien und geben Sie alle Zellen in einen frischen Behälter.
  8. Sobald die Zellen im frischen Behälter zu 80% -100% konfluent sind, frieren Sie sie in einer Mischung aus 45% alten Medien, 45% frischen Medien und 10% DMSO ein. Übertragen Sie die verbleibenden Zellen in ein steriles Röhrchen und führen Sie eine Einzelzellsortierung durch, um monoklonale Zellen in eine 96-Well-Platte zu isolieren.
  9. Etwa 2-3 Wochen nach der monoklonalen Sortierung sollten Vertiefungen innerhalb der 96-Well-Platte Herde aufweisen. Wenn etwa 50% -60% zusammenfließen, teilen Sie die Zellen in eine 12-Well-Platte.
  10. Sobald die 12-Well-Platte zu 80% -100% konfluent ist, teilen Sie sie in einen mit Gewebekulturen behandelten T-25-Kolben auf. Sobald die Zellen im T-25-Kolben zu 80% -100% konfluent sind, frieren Sie die Zellen ein und behalten Sie eine Passage zur Charakterisierung und Prüfung monoklonaler Zelllinien bei.
    1. Charakterisieren Sie die monoklonalen Zelllinien durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie-Assays, um Genexpressionsprofile basierend auf der induzierten fluoreszierenden Reporterproduktion zu melden. Verifizieren Sie die funktionelle Proteinproduktion durch fluoreszierende Antikörpermarkierung und Immunfluoreszenz-Assay. Testen Sie die Genexpressionsinduktion auf transkriptionaler Ebene mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR). Validieren Sie die genetische Sequenz- und Integrationsgenauigkeit durch lokale und gesamte Genomsequenzierung der Klone.

3. Induktionstests für Leichtplattengeräte

  1. Konstruieren Sie ein LPA-Gerät31,46 für die Lichtinduktion von technischen Zellen. Kurz gesagt, mehrere allgemeine Schritte sind entscheidend für die Schaffung von LPA, das zur Kontrolle der Genexpression verwendet wird. Dazu gehören der 3D-Druck von LPA-Rahmenkomponenten, die Leiterplattenkonstruktion, die Programmierung der Schaltung über den Mikrocontroller-Programmierer, die Montage der Komponenten zu einem endgültigen LPA, die Programmierung der Speicherkarte über die IRIS-Software und die Kalibrierung des fertigen Geräts. Eine ausführlichere Erläuterung finden Sie in den obigen Referenzen.
    1. Drucken Sie die 3D-Teile wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) 31,46 beschrieben.
    2. Bestücken Sie die Leiterplatte wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) 31,46 beschrieben.
    3. Fügen Sie die Firmware mit dem Mikrocontroller-Programmierer zur montierten LPA-Schaltung hinzu, wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) 31,46 beschrieben.
    4. Kombinieren Sie 3D-gedruckte Teile und die bestückte Leiterplatte, wie in Gerhardt et al. (2016 und 2019) 31,46 beschrieben. Dazu gehören die Aufnahme der Montageplatte, der Leiterplatte, des LED-Abstandshalters (Light Emitting Diodes), des Plattenadapters, einer 24-Well-Platte, eines Plattendeckels, von Befestigungsschrauben sowie von Flügelmuttern und Stapelkomponenten, wie im gefilmten Video und in Abbildung 2 gezeigt.
    5. Führen Sie für die Speicherkartenprogrammierung und Kalibrierung des Geräts die unten beschriebenen Schritte aus.
  2. Verwenden Sie die auf der Website von Tabor Lab47 verfügbare IRIS-Software, um eine SD-Karte für den Light Plate Apparatus (LPA)31 zu programmieren und geeignete Lichtbedingungen zu untersuchen, die für den Beginn eines optogenetischen Experiments erforderlich sind.
    HINWEIS: Die IRIS-Software ist eine webbasierte Anwendung zur Programmierung der optogenetischen elektronischen Hardware, bekannt als LPA, die vom Tabor Lab entwickelt wurde. Die Software ermöglicht die Programmierung relativer IRIS-Werte, die die einzelnen Leuchtdioden (LEDs) in jeder Vertiefung der LPA-Hardware steuern.
  3. Wählen Sie die Dropdown-Option LPA (4 x 6) und klicken Sie anschließend auf den entsprechenden Beleuchtungsansatz (Steady-State, Dynamic, Advanced).
    HINWEIS: Für dieses Manuskript konzentrieren sich alle Assays auf die stationären Beispiele. Die fortgeschrittenen Einstellungsbeispiele können jedoch für Impulsdauern und Tastverhältnisregime verwendet werden.
  4. Wählen Sie, ob die oberen oder unteren LEDs beleuchtet werden sollen, indem Sie Werte in die Zellen eingeben, die den Vertiefungen der Platte entsprechen. Für die LPAs, die bei dieser Arbeit verwendet wurden, wurden in allen Experimenten blaue LEDs verwendet, die in der oberen Position platziert waren. Jede einmal programmierte LED kann eine kontinuierliche Lichtexposition mit einer konstanten Lichtintensität bieten. Die IRIS-Software ermöglicht 4096 Intensitätsstufen, die programmiert werden können.
  5. Sobald die LED-Positionen ausgewählt sind, geben Sie Intensitätswerte für die gewünschte experimentelle Kontur ein. Geben Sie beispielsweise 8 verschiedene Lichtintensitäten (oder Pulsdauern oder Tastverhältnisse) mit drei technischen Replikaten pro Platte ein (Tabelle 2). G.s. bezieht sich auf Graustufeneinheiten - die Messwerte für die Lichtintensität, die für die LPA-Programmierung in der IRIS-Software verwendet werden.
    1. Beachten Sie beim Entwerfen von IRIS-Versuchsdateien die Randeffekte benachbarter Vertiefungen auf dem LPA-Gerät, die Lichttoxizität durch zunehmende Intensitäten der Blaulichtexposition und die Bestimmung der Art der gewünschten Dosis-Wirkungs-Beziehung (z. B. monoton vs. nicht-monoton).
    2. Wenn Benutzer Zellen im LPA in aufsteigender / absteigender Reihenfolge eines bestimmten Lichtparameters (z. B. Intensität) programmieren, können Bohrlöcher Kanteneffekte von Lichtübersprechen oder sogar Wärme erzeugen, die benachbarte Vertiefungen beeinflussen können. Dies kann versehentlich das Ergebnis der gemessenen Ergebnisse beeinflussen, wenn die Experimente abgeschlossen sind. Um dies zu verringern, können Benutzer eine Randomisierungsmatrix in der IRIS-Software implementieren, um Bohrlochpositionen zu verschlüsseln und Randeffekte zu minimieren. Ein Beispiel wird in den folgenden repräsentativen Ergebnissen beschrieben (Abbildung 4A-B).
    3. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass höhere Intensitäten des blauen Lichts das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit beeinträchtigen48. Um die Lichttoxizität zu verringern, ist es daher wichtig, je nach untersuchter Modalität eine Lichtintensität, Pulsdauer oder Tastverhältnis-Antwortkurve zu erzeugen.
      1. Programmieren Sie beispielsweise 8 Lichtintensitätswerte mit drei Replikaten pro 24-Well-Platte mit einem Bereich von keinem Licht bis zu einer maximalen Intensität des LPA. Lassen Sie diese Proben dann auf einem Durchflusszytometer mit einem SSC-FSC-Gate oder einem lebenden Fleck wie Propidiumiodid laufen, um das Überleben der Populationszellen (lebende Zellen im Vergleich zu Gesamtereignissen einschließlich toter Zellen / zellulärer Trümmer) bei jedem Lichtwert zu quantifizieren.
      2. Bestimmen Sie dann die ideale Menge des Populationsüberlebens für den Versuchsaufbau, da jeder Reiz die Proliferation, die Genexpression oder das Überleben beeinträchtigen kann (z. B. 80% des Zellüberlebens als geeigneten Kompromiss). Zum Beispiel überschritt die Intensität in dieser Arbeit nach der Kalibrierung nicht 3000 g.s. Einheiten (~ 3/4 die maximale Intensität des LPA-Geräts). Ein Beispiel hierfür finden Sie in den folgenden repräsentativen Ergebnissen.
    4. Zusätzlich zur Einschränkung der Lichtwerte aufgrund der Toxizität können Benutzer die Lichtwerte einschränken, um einen bestimmten Teil der Dosis-Wirkungs-Beziehung zu charakterisieren, z. B. den Bereich der monotonen Reaktion.
      1. Um dies zu erreichen, scannen Sie zunächst einen breiten Bereich von Lichtintensitäten, Pulsdauern oder Tastverhältnissen, abhängig von der Modalität, die bei der Bestimmung der gewünschten Dosis-Wirkungs-Beziehung analysiert wird (Tabelle 2), um das interessierende Lichtregime einzugrenzen, z. B. wenn die Genexpression positiv mit steigenden Lichtwerten für eine monotone Dosis-Wirkungs-Beziehung korreliert.
      2. Um den interessierenden Lichtbereich zu bestimmen, programmieren Sie einen einzelnen LPA mit bis zu 24 Wells unterschiedlicher Intensität / Pulsdauer / Tastverhältnis / etc. oder mehr Wells (z. B. 48, 72, 96 usw.), je nachdem, ob mehrere LPAs kalibriert sind, um äquivalente Lichtmengen zu liefern, und fahren Sie mit den unten beschriebenen Zellkulturarbeiten oder Assays fort. Beginnen Sie daher mit der Charakterisierung eines optogenetischen Systems mit einem breiten Dosisbereich von Lichtreizen, um das Bereichsintervall zu bestimmen, das die gewünschte Genexpression ergibt, und führen Sie anschließend Experimente in diesem verfeinerten Dosisbereich durch.
      3. Zum Beispiel wurden in dieser Arbeit einmal 3000 g.s. Einheiten als Schwellenwert für toxische Lichtintensität bestimmt; Dieser Schwellenwert wurde als obere Lichtgrenze für die unten beschriebenen Assays verwendet (z. B. Immunfluoreszenz).
        HINWEIS: Die obigen Schritte sind unabhängig von der optischen Kalibrierung des LPA und beziehen sich auf eine Kalibrierung auf molekularer Ebene für jedes optogenetische System.
  6. Sobald die entsprechenden Lichtintensitätswerte in IRIS programmiert sind, stecken Sie eine Speicherkarte mit der USB 3.0-Steckdose in den LPA, um die Dateien herunterzuladen und zu übertragen.
  7. Wenn die Kalibrierung des LPA abgeschlossen ist31, fahren Sie mit der Zellkulturarbeit zur Einleitung des Lichtinduktionstests fort. Wenn die Kalibrierung nicht durchgeführt wurde, kalibrieren Sie die LPA mit einer Bildanalysemethode (Schritte 3.7.1-3.7.3), sobald die LPA mit dem Mikrocontroller-Programmiergerät programmiert wurde.
    1. Programmieren Sie die LPA kurz, um den gleichen IRIS-Pegel zu haben, wie von Gerhardt et al. (2016) 31 beschrieben.
      HINWEIS: Für die Kalibrierung wurde der LPA so programmiert, dass er einen Wert von 2000 g.s hat.
    2. Sobald das Gerät mit der Speicherkarte programmiert und die Reset-Taste (physische Taste am LPA) gedrückt wird, erfassen Sie ein Bild des gesamten Geräts (z. B. Gelstation-Imager, Scannergerät usw.). Erfassen Sie für die Kalibrierung zwei Bilder, bei denen das Gerät um 180° gedreht ist.
    3. Verwenden Sie dann eine Open-Source-Software, die von Gerhardt et al. (2016) 31 entwickelt wurde, um die Variabilität der LED-Intensität auf der LPA-Platte anzuzeigen und die LED-Kompensationswerte zu berechnen, um die Intensität über Wells hinweg gleich zu machen. Ein Beispiel hierfür wird in den unten dargestellten Ergebnissen beschrieben (Abbildung 3). Sobald diese Kalibrierung abgeschlossen ist, fahren Sie mit den Zellkulturarbeiten fort, um einen Lichtinduktionsassay einzuleiten.
  8. Erhalten Sie Flaschen mit künstlich hergestellten monoklonalen Zellen aus dem vorherigen Abschnitt, um die Auswirkungen der Lichtinduktion auf die Genexpression zu untersuchen.
  9. Entfernen Sie die alten Medien aus dem Kolben.
  10. Fügen Sie 1 ml Trypsin zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 5 min.
  11. Nach 5 min Trypsin neutralisieren, indem 4 ml Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM oder andere gewünschte Medien) mit den notwendigen Chemikalien versetzt werden (diese Arbeit verwendete 50 μg / ml Hygromycin, 1% Penicillin / Streptomycinlösung, 10% fetales Rinderserum, FBS).
  12. Fügen Sie ~ 75.000 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Black-Platte in einem Gesamtvolumen von 500 μL hinzu. Die Anzahl der gesäten Zellen kann je nach Dauer des gewünschten Experiments und verwendetem Zelltyp variieren.
    HINWEIS: Beachten Sie außerdem, dass die Zellaussaatdichte die Kulturerhaltung und möglicherweise die Dauer des Experiments beeinflusst. Mit einer geringeren Anzahl von Zellen pro Well zu beginnen, sorgt für längere Zeit, bevor die Kultur zum Zusammenfluss kommt. Darüber hinaus beeinflusst die Art der optogenetischen Komponenten, die in die interessierenden Genschaltkreise integriert sind, wann die Genexpression einen stabilen Zustand erreicht und somit die Dauer der Experimente beeinflusst. Andere Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, sind zelllinienspezifische Wachstumsraten, Medienzusammensetzung und bedingte Wachstumseffekte (z. B. Licht).
  13. Nach der Beschichtung legen Sie die Zellen in einen befeuchteten Inkubator mit 5% CO2, damit sie sich für 2-6 h einsetzen können.
  14. Übertragen Sie die Zellen nach der Inkubation auf eine Gewebekulturhaube, entfernen Sie den Kunststoffdeckel und fügen Sie oben auf der Platte einen Klebefolienstreifen hinzu (Abbildung 2D). Dieser Schritt ermöglicht eine minimale Lichtübertragung zwischen den Bohrlöchern, da die Oberseite und die Seiten der Bohrlöcher beschichtet sind und das Licht jetzt nur noch von der Unterseite des Brunnens eindringen kann, wo die LED platziert ist.
  15. Platzieren Sie die Platte in den montierten 3D-Teilen des LPA. Decken Sie dann die Platte mit dem 3D-gedruckten LPA-Deckel ab, der an jeder Ecke über die Geräteschrauben passt.
  16. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an und drücken Sie die Reset-Taste am LPA-Gerät, um sicherzustellen, dass die aktualisierten LPA-Experimenteinstellungen angewendet werden.
  17. Inkubieren Sie die Zellen innerhalb des experimentellen Systems für eine angemessene Zeitspanne, abhängig von der ursprünglichen Aussaatdichte, der zelllinienspezifischen Wachstumsgeschwindigkeit und den Wachstumsbedingungen. In diesem Beispiel wurden die Zelllinien für 3 Tage kontinuierlich induziert, damit die Genexpression einen stabilen Zustand erreicht. Es sollte jedoch beachtet werden, dass viele optogenetische Systeme (z. B. VVD) die stationäre Genexpression viel früher erreichen können (z. B. 24 h), und daher können experimentelle Induktionszeiten nach Bedarf reduziert oder verlängert werden.
  18. Verwenden Sie am Ende des Lichtinduktionsexperiments die Proben für einen der folgenden vier Assays, um die künstlichen Zelllinien zu charakterisieren (Abschnitte 4-7).

4. Fluoreszenzmikroskopie von lichtinduzierten künstlichen Zellen

  1. 24-72 h nach der Induktion entfernen Sie die Zellen im LPA aus dem Inkubator und legen sie in eine Gewebekulturhaube.
  2. Entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte 1-2 min stehen. Dies verhindert, dass sich Kondenswasser auf dem Kunststoffdeckel bildet, wenn es sofort auf die Platte gelegt wird.
  3. Nach 1-2 Minuten Sitzen den originalen Kunststoffdeckel wieder auf den Teller legen.
  4. Bilden Sie die Zellen mit dem entsprechenden Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskop ab.
  5. Passen Sie je nach Instrument die Belichtungszeit, die Intensität der Lichtquelle und die Verstärkung für die Anzeige von technischen Zellen an. In diesem Experiment wurden die folgenden Parameter angewendet: 50 ms für die Belichtungszeit der FITC/GFP-Lichtquelle (grün fluoreszierendes Protein) und 1-5 ms für die Phasenkontrast-Belichtungszeit bei jeweils 100% Intensität.
    HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass optimale Belichtungszeiten, Verstärkungspegel und Lichtquellenintensitäten oft empirisch aus den Erfahrungen dieser Arbeit abgeleitet werden, um die Übersättigung im Fluoreszenzreporter zu minimieren, Zellschäden zu minimieren und angemessene Bilder für qualitative und quantitative Analysen aufzunehmen. Bei der Bestimmung der Pegel jedes dieser Parameter sind die Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die Minimierung der Phototoxizität, die Minimierung der Übersättigung von Fluoreszenzsignalen und die Erhöhung der Fähigkeit, schwache Fluoreszenzsignale zu verstärken, zu beachten.
    1. Optimieren Sie diese Parameter grob ad-hoc; Frühere experimentelle Werte (z. B. Lichtquellenintensität, die eine Übersättigung des Fluoreszenzreporters verursacht) können jedoch gegebenenfalls zukünftige experimentelle Einstellungen bestimmen. Beispielsweise können die Verstärkungseinstellungen, Belichtungszeiten und Anfangswerte der Lichtintensität von einem Schaltkreis (LITer1.0) oder experimentellen Aufbau (z. B. Lichtintensität) als Ausgangspunkt verwendet werden, wenn Sie sich zu einem ähnlichen, aber anderen Genkreislauf (LITer2.0)11 oder einer anderen Lichtmodalität (z. B. Lichteinschaltzyklus) bewegen.
  6. Optimieren Sie die Plattenbildgebung durch eine Koordinatenvorlage, die in die Mikroskopiesoftware programmiert ist, sodass die gesamte Plattengröße (z. B. 24 Vertiefungen) eine automatisierte Bilderfassung von mehreren Bildpositionen pro Bohrloch ermöglicht.

5. Durchflusszytometrie von lichtinduzierten künstlichen Zellen

  1. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
  2. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte ein oder zwei Minuten ruhen.
  3. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
  4. Fügen Sie 100 μL 0,25% Trypsin zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
  5. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang ungestört im Inkubator.
  6. Entfernen Sie nach 5 Minuten die Platte und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube zurück.
  7. Neutralisieren Sie jeden trypsinisierten Brunnen mit 400 μL DMEM.
  8. Beschriften Sie ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsieb (oder einem geeigneten Durchflusszytometrieröhrchen, das gefiltert werden kann, um große Klumpen von Zellen zu entfernen, die nicht vollständig trypsinisiert sind) mit einem Namen, der jeder Vertiefung entspricht.
  9. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den Inhalt jedes Vertiefungs 6-8 Mal nach oben und unten zu pipettieren, um Zellklumpen zu brechen und einzellige Proben für die Durchflusszytometrie49 zu erstellen.
  10. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung (~ 500 μL) mit dem Sieb auf die markierten Röhrchen.
  11. Bringen Sie Zellen mit Lasern der richtigen Wellenlängen zum entsprechenden Durchflusszytometrie-Instrument (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
    HINWEIS: Das bei dieser Arbeit verwendete Durchflusszytometer war Teil einer Kerneinrichtung am Universitätsklinikum.
  12. Erstellen Sie ein Vorwärts- und Seitenstreutor (FSC bzw. SSC), um die einzelnen Zellen der entsprechenden Größe und Granularität zu erfassen, um Ablagerungen und Zellklumpen in der Durchflusszytometriesoftware auszuschließen.
  13. Sobald das Tor gesetzt ist, erfassen Sie ungefähr 10.000 Zellen mit dem entsprechenden Tor. Passen Sie diese Zahl abhängig von der Menge an Mobilfunkdaten an, die die Benutzer suchen. Wiederholen Sie dies für jede Röhre, die die Zellen aus dem Experiment enthält.
  14. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, importieren Sie die Daten zur Analyse in die verfügbare Durchflusszytometrie-Datensoftware.
  15. Erstellen Sie ein FSC-SSC-Gate (wie zuvor während der Erfassung) und wenden Sie es auf jeden Batch experimenteller Daten an. Eine Referenzquelle der uninduzierten Zellpopulation wird verwendet, um dieses Gate in diesem Manuskript zu erstellen, aber es existieren andere Metriken für die Gate-Erstellung, wie z.B. dichtebasierte Gates.
  16. Wenn die experimentellen Bedingungen mit einem FSC-SSC-Gatter versehen sind, können Sie die Durchflusszytometriedaten als Histogramme darstellen oder auf andere Weise darstellen, um die erhaltenen Expressionsmuster zu veranschaulichen. In diesem Experiment wurde die Fluoreszenz von den GFP / FITC- oder PE / TexasRed-Kanälen erfasst.

6. RNA-Extraktion und quantitative PCR von Genschaltkreiskomponenten

  1. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
  2. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte ein oder zwei Minuten ruhen.
  3. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
  4. Fahren Sie fort, RNA aus den Zellen mit dem entsprechenden RNA-Extraktionskit zu extrahieren.
  5. Sobald die RNA-Extraktion abgeschlossen ist, führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion jeder Probe durch (Tabelle 3).
  6. Führen Sie außerdem eine quantitative PCR jeder Probe durch (Tabelle 4). Verwenden Sie eine DNA-Polymerase und ein zugehöriges Protokoll, um PCR-Reaktionen einzurichten. Richten Sie für diesen Schritt eine gemultiplexte Reaktion mit einem Housekeeping-Gen und einem Gen von Interesse ein oder erstellen Sie separate Reaktionen. In diesem Beispiel wurden GFP-, KRAS- und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Spiegel untersucht. Nach Abschluss des qRT-PCR-Experiments fahren Sie mit der Analyse über die verfügbare Software fort, um die Veränderung der Genschaltkreisfaltung auf RNA-Ebene zu veranschaulichen.

7. Immunfluoreszenz von Genkreiskomponenten

  1. Verwenden Sie ein Eisbad oder einen Gefrierschrank, um Methanol abzukühlen.
  2. 24-72 h nach der Induktion die Zellen aus dem LPA im Inkubator oder aus dem Mikroskop nach der Bildgebung entfernen und in die Gewebekulturhaube legen.
  3. Wenn Sie direkt aus dem LPA entfernt werden, entfernen Sie den Folienstreifen und lassen Sie die Platte 1-2 Minuten ruhen.
  4. Saugen Sie die Medien aus jedem Bohrloch (von der gesamten 24-Well-Platte, wenn alle Wells verwendet werden) ab.
  5. Fügen Sie 100 μL 0,25% Trypsin zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
  6. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang ungestört im Inkubator.
  7. Entfernen Sie nach 5 Minuten die Platte und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube zurück.
  8. Neutralisieren Sie jeden trypsinisierten Brunnen mit 400 μL DMEM.
  9. Etikettieren Sie Minizentrifugenröhrchen mit Namen, die jeder Vertiefung entsprechen.
  10. Verwenden Sie eine P1000-Pipette und pipettieren Sie den Inhalt jedes Brunnens 6-8 Mal nach oben und unten, um die Zellklumpen zu brechen.
  11. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung (~ 500 μL) auf die markierten Röhrchen.
  12. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
  13. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
  14. Resuspendieren Sie die Zellen (verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipette 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen zu brechen) in 750-1000 μL 4% Paraformaldehyd (verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS).
  15. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
  16. Nach der Inkubation 750-1000 μL PBS hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
  17. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
  18. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
  19. Resuspendieren Sie die Zellen (verwenden Sie eine P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen zu brechen) in 750-1000 μL eiskaltem Methanol.
  20. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis oder in einem -20 °C Gefrierschrank sitzen.
  21. Nach der Inkubation 750-1000 μL PBS hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
  22. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
  23. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
  24. Abhängig von der Art der verwendeten Antikörper ändern Sie das Protokoll ab diesem Zeitpunkt. Führen Sie die Schritte 7.24.1-7.24.14 oder 7.24.15-7.24.22 aus.
    1. Wenn Sie einen primären und sekundären Antikörper verwenden, resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL primärem Antikörper zu brechen. In diesem Fall wurde eine Verdünnung von 1:800 für Stammantikörper vorgenommen, einschließlich KRAS-Antikörper oder ERK-Antikörper, und durfte 1 h bei Raumtemperatur sitzen. Antikörper wurden in einem Inkubationspuffer aus 1x PBS mit 0,5 g BSA verdünnt.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die genaue Verdünnung des Antikörpers empirisch, indem Sie eine Standardkurve von Antikörperverdünnungen im Vergleich zum Antigen von Interesse erstellen.
    2. Nach Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf markierte Antikörper zu verhindern.
    3. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    4. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    5. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
    6. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL sekundärem Antikörper zu brechen. In diesem Fall wurden die Zellen in einem 100 μL Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:800 für KRAS-Antikörper oder 1:2000 für ERK-Antikörper resuspendiert und 30 min bei Raumtemperatur sitzen gelassen. Ähnlich wie bei primären Antikörpern verdünnen Sie die sekundären Antikörper im Inkubationspuffer wie oben beschrieben. Bestimmen Sie die Verdünnungen der sekundären Antikörper basierend auf den empirischen Befunden einer Standardkurve.
    7. Nach der Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf die markierten Antikörper zu verhindern.
    8. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    9. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    10. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.
    11. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen in 500 μL PBS zu brechen.
    12. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens (~ 500 μL) mit Sieben auf die markierten Röhrchen.
    13. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
      HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass mehrere Kontrollen wichtig sind, um mit der Durchflusszytometriemessung und der Analyse der manipulierten Zellgenexpression fortzufahren. Zum Beispiel können völlig unbefärbte Zellen, Zellen, die nur mit primären Antikörpern gefärbt sind, und Zellen, die mit sekundären Antikörpern allein gefärbt sind, nützlich sein, um die Ergebnisse mit Hintergrundsignalen von Antikörpern zu vergleichen.
    14. Fahren Sie als Nächstes mit der Analyse fort, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
    15. Wenn Sie nur einen primären Antikörper verwenden, resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 / P200-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jedem Röhrchen auf und ab, um Zellklumpen in 100 μL markiertem primären Antikörper zu brechen. Bestimmen Sie die geeignete Antikörperverdünnung und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur. Bestimmen Sie empirisch die Antikörperverdünnung aus der Standardkurve.
    16. Nach Zugabe von Antikörpern die Röhrchen mit einer Folie bedecken, um Lichteffekte auf markierte Antikörper zu verhindern.
    17. Nach der Inkubation 750-1000 μL des Inkubationspuffers hinzufügen. Pipette mehrmals auf und ab.
    18. Zentrifen Sie die Zellen für 5 min bei 400 x g.
    19. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette und pipettieren Sie 6-8 Mal in jeder Röhre auf und ab, um Zellklumpen in 500 μL PBS zu brechen.
    20. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens (~ 500 μL) auf markierte Röhrchen mit Sieben.
    21. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen (können Röhren mit Zellen auf oder außerhalb des Eises bringen).
      HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass mehrere Kontrollen wichtig sind, um mit der Durchflusszytometriemessung und der Analyse der manipulierten Zellgenexpression fortzufahren. Vollständig unbefärbte Zellen und Zellen, die nur mit primären Antikörpern gefärbt sind, sind nützlich, um die Ergebnisse mit Hintergrundsignalen von Antikörpern zu vergleichen.
    22. Fahren Sie von diesem Punkt aus mit der Analyse fort, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Aufbau von Genschaltkreisen und die stabile Zellliniengenerierung in diesem Artikel basierten auf kommerziellen, modifizierten HEK-293-Zellen, die eine transkriptionell aktive, einzelne stabile FRT-Stelle enthielten (Abbildung 1). Die Genschaltkreise wurden zu Vektoren konstruiert, die FRT-Stellen innerhalb des Plasmids hatten, was die Flp-FRT-Integration in das HEK-293-Zellgenom ermöglichte. Dieser Ansatz ist nicht auf Flp-In-Zellen beschränkt, da FRT-Stellen mit DNA-Editing-Technologie...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Leser dieses Artikels können einen Einblick in die Schritte erhalten, die für die Charakterisierung optogenetischer Genschaltkreise (sowie anderer Genexpressionssysteme) von entscheidender Bedeutung sind, einschließlich 1) Design, Konstruktion und Validierung von Genschaltkreisen; 2) Zell-Engineering zur Einführung von Genschaltkreisen in stabile Zelllinien (z. B. Flp-FRT-Rekombination); 3) Induktion der technischen Zellen mit einer lichtbasierten Plattform wie der LPA; 4) Erstcharakterisierung von Lichtinduktionsass...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Balázsi lab für Kommentare und Anregungen, Dr. Karl P. Gerhardt und Dr. Jeffrey J. Tabor für die Unterstützung beim Aufbau des ersten LPA und Dr. Wilfried Weber für die gemeinsame Nutzung der LOV2-degron Plasmide. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R35 GM122561 und T32 GM008444] unterstützt; Das Laufer Zentrum für Physikalische und Quantitative Biologie; und ein National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: NIH [R35 GM122561].

Autorenbeiträge: M.T.G. und G.B. konzipierten das Projekt. M.T.G., D.C., und L.G., führten die Experimente durch. M.T.G., D.C., L.G. und G.B. analysierten die Daten und bereiteten das Manuskript vor. G.B. und M.T.G. betreuten das Projekt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 mL PCR-RöhrchenEppendorf951010006Reagenz für die Durchführung von PCR
0,25 % Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIReagenz für die Spaltung und Ernte von Säugetierzellen
0,5-10 μ; L Pipette mit einstellbarem VolumenEppendorf3123000020Werkzeug zum Pipettieren von Reaktionen
100-1000 μ L Pipette mit einstellbarem VolumenEppendorf3123000039Werkzeug zum Pipettieren von Reaktionen
20-200 μ L Pipette mit einstellbarem VolumenEppendorf3123000055Werkzeug zum Pipettieren von Reaktionen
2-20 & mu; L Pipette mit einstellbarem VolumenEppendorf3123000039Werkzeug zum Pipettieren von Reaktionen
5 mL Polystyen-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeCorning352235 Reagenz für die Durchflusszytometrie
5702R Zentrifuge, mit 4 x 100 Rotor, 15 und 50 mL Adaptern, 120 VEppendorf22628113Ausrüstung für die Arbeit an Säugetieren
AgaroseDenville ScientificGR140-500Reagenz für die Gelelektrophorese
Aluminiumfolien für 96-Well-PlattenVWR®60941-126Werkzeug zum Abdecken von Platten in Lichtinduktionsexperimenten
AmpicillinSigma AldrichA9518-5GReagenz zur Auswahl von Bakterien mit dem richtigen Plasmid
Analoger Vortex-MischerThermo Fisher Scientific02215365PRWerkzeug zum Tragen von PCR-, Transformations- oder Gelextraktionsreaktionen
Bacto Dehydratisierter AgarFisher ScientificDF0140010Reagenz für züchtende Bakterien
BD LSRAriaBD656700Werkzeug zur Sortierung von manipulierten Zelllinien in monoklonale Populationen
BD LSRFortessaBD649225Werkzeug zur Charakterisierung von manipulierten Zelllinien
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1GReagenz für IF-Inkubationspuffer
Zellkulturplatte 12-Well, klar, flacher Boden mit Deckel, Polystyrol, nicht pyrogen, Standard-TCCorning353043-Platte für die Züchtung monoklonaler Zellen
ZentrifugeVWR22628113Instrument für die Säugetierzellkultur
Chemischer AbzugN/AN/A-Gerätzur Durchführung von IF-Reaktionen
Klare Zellkulturplatte 24 Well flacher Boden mit DeckelBD353047Platte für die Züchtung monoklonaler Zellen
CytoOne T25 Filterkappe TC-KolbenUSA ScientificCC7682-4825Behälter für die Züchtung von Säugetierzellen
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fischer ScientificBP231-100Reagenz zum Einfrieren von gentechnisch veränderten Säugetierzellen
EthidiumbromidThermo Fisher Scientific15-585-011Reagenz für die Gelelektrophorese
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Kultur-Mikrotiterplatte, mit DeckelCorning353072Behälter für die Züchtung sortierter monoklonaler Zellen
FCS ExpressDe Novo Software:N/ASoftware zur Charakterisierung von Durchflusszytometrie-Daten
Fötales Rinderserum, Normal, USDA 500 mLCorning35-010-CVReagenz für die Züchtung von Säugetierzellen
Fisherbrand Petrischalen mit klarem Deckel - erhöhter Grat; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712Ausrüstung für die Züchtung von Bakterien
Gibco  DMEM,Thermo Fisher Scientific11-965-092Reagenz mit hohem Glukosegehalt für die Züchtung von Säugetierzellen
Hs00932330_m1 KRAS-Isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/ml), 20 mLLife Technologies10687-010Reagenz zur Selektion von Zellen mit korrekter Integration von Genschaltkreisen
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890Reagenz für die Umwandlung von RNA in cDNA
Labor-Gefrierschrank -20 ° CVWR76210-392Ausrüstung zur Lagerung von experimentellen Reagenzien
Labor-Gefrierschrank -80 ° CPanasonicMDF-U74VCGerät zur Lagerung von experimentellen Reagenzien
Laborkühlschrank +4 ° CVWR76359-220Ausrüstung zur Lagerung von experimentellen Reagenzien
LB Bouillon (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250GReagenz für die Züchtung von Bakterien
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008Reagemt zur Transfizierung von Genschaltkreisen in Säugetierzellen
MATLAB 2019MathWorksN/ASoftware zur Analyse experimenteller Daten
MethanolAcros Organics413775000Reagenz für Immunfluoreszenzreaktionen
Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen 1,7 mLVWR20170-333Kunststoffbehälter
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman GenexpressionsassayLife Technologies4331182qPCR-Sonde
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCAusrüstung für Bakterien Transformation
NanoDrop Lite SpektralphotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANGerät zur Messung der DNA/RNA-Konzentration
NEB Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase 2x Master MixNEBM0492SReagenz für die PCR von Genschaltkreisfragmenten
NEB10-beta Kompetente E. coli (hohe Effizienz)New England Biolabs (NEB)C3019HBakterienzellen zur Amplifikation von Genschaltkreisen von Interesse
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621LReagenz zum Kombinieren von Genschaltkreisen
Nikon Eclipse Ti-E inverses Mikroskop mit einer DS-Qi2-KameraNikon Instruments Inc.N/AInstrument zur Quantifizierung der Genexpression
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/A-Software zur Charakterisierung von Fluoreszenzmikroskopie-Daten
, OligonukleotidenIDTN/A-Reagenzfür die PCR von Genschaltkreiskomponenten
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Inkubator mit UV und H2O2 SteuerungPanasonicMCO-170AICUVHL-PAGerät für die Züchtung von Säugetierzellen
Paraformaldehyd, 16 % elektronenmikroskopischesReagenzSciences15710-S
PBS, Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144Reagenz für die Zellkultur von Säugetieren, Reagenz für ZF-Inkubationspuffer
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml), 100xFisher Scientific15140-122Reagenz für die Züchtung von Säugetierzellen
primärer ERK-AntikörperCell Signaling Technology4370Sprimärer ERK-Antikörper für Immunfluoreszenz
primärer KRAS-AntikörperSigma-Aldrichprimärer KRAS-Antikörper für Immunfluoreszenz
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Reagenzienkit zur Aufreinigung von Genschaltkreis-Plasmiden
QIAquick Gel-Extraktionskit (50)Qiagen28704Reagenzienkit zur Aufreinigung von Genschaltkreisfragmenten
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137Ausrüstung für qRT-PCR
Relative Quantification AppThermo Fisher ScientificN/ASoftware zur Quantifizierung von RNA/cDNA-Amplificaiton
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Kit zur Extraktion von RNA aus gentechnisch veränderten Säugetierzellen
Sekundärer ERK-AntikörperCell Signaling Technology8889Ssekundärer ERK-Antikörper für Immunfluoreszenz
sekundärer KRAS-AntikörperInvitrogenA11005sekundärer KRAS-Antikörper für Immunfluoreszenz
Serologische Pipets 5,0 mLOlympus Plastics12-102Reagenzien für die Einrichtung einer Vielzahl chemischer Reaktionen
SmartView Pro Imager SystemMajor ScienceUVCI-1200Tool für die Bildgebung korrekter PCR-Banden
SnapGene Viewer (kostenlos) oder SnapGeneSnapGeneN/ASoftware Design und Analyse von DNA-Sequenzen
InkubatorTokai HitINU-TIZTool für die Durchführung von PCR-, Transformations- oder Gelextraktionsreaktionen
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557Reagenz für die PCR von Gen-Schaltkreisfragmenten
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogene Kontrolle (VIC/MGB-Sonde), Primer begrenzt, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR-Sonde
ThermocyclerBio-Rad1851148Werkzeug für PCR-, Transformations- oder Gelextraktionsreaktionen
VisiPlate-24 Schwarze, schwarze 24-Well-Mikroplatte mit klarem Boden, steril und mit Gewebekultur behandeltPerkinElmer1450-605Platte für die Lichtinduktion
Experimente VWR Einweg-Pasteurpipetten, Glas, Borosilikatglaspipette, kurze Spitze, Kapazität=2 mL, Gesamtlänge=14,6 cmVWR14673-010Reagenz für die Säugetierzellkultur
VWR Mini Horizontale Elektrophoresesysteme, Mini10 GelsystemVWR89032-290Ausrüstung für DNA-Gelelektrophorese
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Engineered Zelllinie mit FRT Platz
WH0003845M1

References

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