Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Summary

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Abstract

Un controllo affidabile dell'espressione genica nelle cellule di mammifero richiede strumenti con elevato cambiamento di piega, basso rumore e determinate funzioni di trasferimento input-to-output, indipendentemente dal metodo utilizzato. Verso questo obiettivo, i sistemi di espressione genica optogenetica hanno guadagnato molta attenzione negli ultimi dieci anni per il controllo spaziotemporale dei livelli proteici nelle cellule di mammifero. Tuttavia, la maggior parte dei circuiti esistenti che controllano l'espressione genica indotta dalla luce variano in architettura, sono espressi da plasmidi e utilizzano apparecchiature optogenetiche variabili, creando la necessità di esplorare la caratterizzazione e la standardizzazione dei componenti optogenetici in linee cellulari stabili. Qui, lo studio fornisce una pipeline sperimentale di costruzione, integrazione e caratterizzazione di circuiti genici affidabili per il controllo dell'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule di mammifero, utilizzando un circuito optogenetico a feedback negativo come esempio di caso. I protocolli illustrano anche come la standardizzazione delle apparecchiature optogenetiche e dei regimi di luce possa rivelare in modo affidabile le caratteristiche del circuito genico come il rumore di espressione genica e l'entità dell'espressione proteica. Infine, questo documento può essere utile per i laboratori che non hanno familiarità con l'optogenetica che desiderano adottare tale tecnologia. La pipeline qui descritta dovrebbe applicarsi ad altri circuiti optogenetici nelle cellule di mammifero, consentendo una caratterizzazione e un controllo più affidabili e dettagliati dell'espressione genica a livello trascrizionale, proteomico e, infine, fenotipico nelle cellule di mammifero.

Introduction

Analogamente ad altre discipline ingegneristiche, la biologia sintetica mira a standardizzare i protocolli, consentendo di utilizzare strumenti con funzioni altamente riproducibili per esplorare questioni rilevanti per i sistemi ^biologici1,2. Un dominio in biologia sintetica in cui sono stati costruiti molti sistemi di controllo è l'area della regolazione dell'espressione ^genica3,4. Il controllo dell'espressione genica può colpire sia i livelli proteici che la variabilità (rumore o coefficiente di variazione, CV = σ/μ, misurata come deviazione standard rispetto alla media), che sono caratteristiche cellulari cruciali a causa del loro ruolo negli stati cellulari fisiologici e patologici5,6,7,8. Molti sistemi sintetici in grado di controllare i livelli di proteine e il rumore4,9,10,11,12 sono stati progettati, creando opportunità per standardizzare i protocolli tra gli strumenti.

Un nuovo set di strumenti in grado di controllare le reti geniche recentemente emerse è l'optogenetica, che consente l'uso della luce per controllare l'espressione genica13,14,15,16,17. Simili ai loro predecessori chimici, i circuiti genici optogenetici possono essere introdotti in qualsiasi tipo di cellula, dai batteri ai mammiferi, consentendo l'espressione di qualsiasi gene a valle di ^{interesse18,19}. Tuttavia, a causa della rapida generazione di nuovi strumenti optogenetici, sono emersi molti sistemi che variano nell'architettura del circuito genetico, nel meccanismo di espressione (ad esempio, integrazione basata su plasmidi vs virale) e nelle apparecchiature di controllo dell'alimentazione della luce11,16,20,21,22,23,24,25 . Pertanto, questo lascia spazio alla standardizzazione delle caratteristiche optogenetiche come la costruzione e l'ottimizzazione del circuito genico, il metodo di utilizzo del sistema (ad esempio, integrazione vs espressione transitoria), strumenti sperimentali utilizzati per l'induzione e analisi dei risultati.

Per fare progressi nella standardizzazione dei protocolli optogenetici nelle cellule di mammifero, questo protocollo descrive una pipeline sperimentale per ingegnerizzare sistemi optogenetici in cellule di mammifero utilizzando un circuito genico a feedback negativo (NF) integrato nelle cellule HEK293 (linea cellulare del rene embrionale umano) come esempio. NF è un sistema ideale per dimostrare la standardizzazione poiché è altamente abbondante26,27,28 in natura, consentendo di sintonizzare i livelli proteici e di ridurre al minimo il rumore. In breve, NF consente un controllo preciso dell'espressione genica da parte di un repressore riducendo la propria espressione sufficientemente velocemente, limitando così qualsiasi cambiamento lontano da uno stato stazionario. Lo stato stazionario può essere alterato da un induttore che inattiva o elimina il repressore per consentire una maggiore produzione di proteine fino a raggiungere un nuovo stato stazionario per ogni concentrazione di induttore. Recentemente, è stato creato un sistema optogenetico NF ingegnerizzato in grado di produrre una risposta dinamica ampia di espressione genica, mantenere un basso rumore e rispondere agli stimoli luminosi consentendo il potenziale per il controllo dell'espressione genica ^spaziale11. Questi strumenti, noti come sintonizzatori inducibili dalla luce (LITers), sono stati ispirati da sistemi precedenti che consentivano il controllo dell'espressione genica nelle cellule viventi4,10,29,30 e sono stati stabilmente integrati nelle linee cellulari umane per garantire il controllo dell'espressione genica a lungo termine.

Qui, usando il LITer come esempio, viene delineato un protocollo per creare circuiti genici sensibili alla luce, inducendo l'espressione genica con un light plate apparatus (LPA, un hardware di induzione optogenetica)³¹ e analizzare le risposte delle linee cellulari ingegnerizzate e optogeneticamente controllabili a stimoli luminosi personalizzati. Questo protocollo consente agli utenti di utilizzare gli strumenti LITer per qualsiasi gene funzionale che desiderano esplorare. Può anche essere adattato per altri sistemi optogenetici con diverse architetture circuitali (ad esempio, feedback positivo, regolazione negativa, ecc.) integrando i metodi e le apparecchiature optogenetiche descritte di seguito. Simile ad altri protocolli di biologia sintetica, le registrazioni video e i protocolli optogenetici qui delineati possono essere applicati in studi su singole cellule in diverse aree, tra cui, ma non solo, la biologia del cancro, lo sviluppo embrionale e la differenziazione dei tessuti.

Protocol

1. Progettazione del circuito genico

1. Selezionare componenti genetiche da combinare in un singolo circuito genico/plasmide (ad esempio, motivi di sequenza di integrazione del DNA dei ^mammiferi32, elementi sensibili alla ^luce33 o geni ^funzionali34).
2. Utilizzando qualsiasi software di ingegneria genetica e/o clonazione molecolare, memorizzare le sequenze di DNA per un uso e un riferimento successivi, annotare ogni sequenza ed esaminare tutte le caratteristiche necessarie (ad esempio, codoni START, sequenze regolatorie o tradotte)³⁵.
3. Sviluppare o adottare parti in base al progetto generale del circuito ^genico36. Ad esempio, per i repressori optogenetici come nei ^LITers11, fondere una sequenza genica che codifica per un dominio in grado di degradazione inducibile dalla ^luce37,38 o inattivazione della capacità di legame del DNA di un repressore39, adiacente e nel quadro del gene repressore (ad esempio, TetR)⁴.
   1. Per gli attivatori optogenetici, assicurarsi della presenza di un dominio ^attivatore40 che promuova l'espressione genica sul legame del DNA indotto dalla ^luce41. Per l'autoregolazione negativa o positiva, assicurarsi la presenza di un sito di legame regolatorio all'interno o a monte del promotore del gene regolatore (ad esempio, siti tetO all'interno o a monte del promotore che esprime TetR)⁴².
4. Progettare i primer per l'amplificazione della sequenza di DNA o il sequenziamento del plasmide utilizzando il software di clonazione molecolare per ciascun circuito genico.
5. Convalidare i primer computazionalmente per la costruzione di plasmidi attraverso i feasture integrati del software di clonazione molecolare (ad esempio, allineamento delle sequenze).
6. Ordina primer oligonucleotidici dal produttore. I plasmidi costruiti e utilizzati in questo lavoro possono essere trovati nel materiale di supporto ^originale11 insieme ai primer progettati e utilizzati.
7. Diluire i primer a 100 mM di concentrazione di stock in acqua a doppio distillato (_ddH2O).
8. Diluire lo stock di primer da 100 mM a 10 mM di concentrazione per la PCR.
9. Preparare la miscela PCR con 1 μL di primer in avanti, 1 μL di primer inverso, 1 μL di DNA modello per una massa totale di 0,5-500 ng per la genomica o 0,5 pg-5 ng per il DNA plasmidico o virale, 12,5 μL di DNA polimerasi 2x master mix (o il volume che soddisfa il fattore di diluizione del produttore) e 9,5 μL di _ddH2O per un volume totale di reazione di 25 μL.
10. Incubare la miscela PCR in un termociclatore alle impostazioni appropriate a seconda dell'enzima ^scelto43. I cicli di reazione suggeriti includono:
    Fase 1: Un ciclo di 30 s fase iniziale di denaturazione a 95 °C.
    Fase 2: 40 cicli di 5 s di fase di denaturazione a 98 °C.
    Fase 3: Un ciclo di 30 s di fase di ricottura a 65 °C (determinato da primer progettati in precedenza).
    Passo 4: Un ciclo di 1 minuto di estensione a 72 °C (~ 1 kilobase (kb) lunghezza del frammento del modello).
    Fase 5: Un ciclo di un'estensione di 2 minuti a 72 °C.
    Tenere la reazione a 4 °C fino a quando non può essere testata tramite elettroforesi su gel. Questo protocollo varia a seconda dei reagenti utilizzati (ad esempio, polimerasi e tamponi).
11. Ripetere il passaggio 1.9 per amplificare tutti i frammenti da utilizzare in una reazione di assemblaggio del DNA necessaria per collegare i prodotti della PCR lineare in un singolo vettore circolare del DNA.
12. Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% seguito dalla purificazione delle fasce della lunghezza desiderata.
13. Preparare la miscela principale per una reazione di assemblaggio del DNA (Tabella 1).
    NOTA: in questo esempio, il vettore madre viene diviso in due frammenti per aumentare l'efficienza dei passaggi della PCR senza causare modifiche significative al risultato complessivo dell'assemblaggio.
14. Incubare la miscela principale di reazione di assemblaggio del DNA in un termociclatore a 50 °C per 1 ora (se non diversamente specificato nel protocollo del reagente di assemblaggio del DNA) e conservare la reazione a 4 °C per utilizzare il prodotto di reazione per la trasformazione batterica.
15. Impostare la trasformazione batterica (chimica o elettroporazione) utilizzando cellule competenti di E. coli (Escherichia coli) e il corrispondente protocollo di trasformazione batterica. Dopo la trasformazione, utilizzare le piastre di agar batterico Luria-Bertani (LB) contenenti il marcatore di selezione batterica scelto (ad esempio, ampicillina) per placcare la miscela di trasformazione. Incubare le piastre a 37 °C durante la ^notte44.
16. Controllare le piastre il giorno seguente. Per inoculare le colonie, raccogliere le singole colonie dalle piastre e risospese in un brodo LB liquido con il corrispondente marcatore di selezione batterica nei tubi di coltura. Incubare in un incubatore shaker a 37 °C, 300 giri/min durante la notte.
17. Eseguire il protocollo di preparazione del plasmide per estrarre il DNA del plasmide dalla coltura batterica.
18. Convalidare il circuito in due passaggi. In primo luogo, eseguire una digestione di prova utilizzando enzimi di restrizione come verifica grezza per vedere se il prodotto plasmidico approssimativo è stato ottenuto. In secondo luogo, se la digestione del test è superata / confermata, sottoporre il plasmide a un impianto di sequenziamento Sanger (o processo utilizzando l'attrezzatura disponibile) per ottenere la sequenza precisa del DNA per confrontarla successivamente con la sequenza prevista nel software di progettazione.
    1. Per eseguire la digestione di prova, selezionare almeno due enzimi di restrizione che producono almeno due frammenti, in base al software di clonazione molecolare utilizzato. Una volta selezionati gli enzimi, preparare i campioni di prova aggiungendo 1 μL di ciascun enzima, 5 μL del DNA generato e 13 μL di acqua con sali e tamponi appropriati a seconda degli enzimi utilizzati. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora, o come suggerisce il produttore dell'enzima. Eseguire i prodotti di digestione di prova su un gel di agarosio all'1% e determinare se le bande sono corrette.
       NOTA: se le bande sono corrette, procedere alla sequenziazione.
    2. Per eseguire il sequenziamento, generare primer basati sul DNA memorizzato nel software in modo che le regioni di ricottura dei primer siano a circa 500 bp (coppie di basi) di distanza e coprano il frammento di interesse (componente del circuito genico) o il plasmide completo. Diluire i primer con acqua pura priva di nucleasi (_NF-H2O) fino a una concentrazione di 10 mM. Preparare i campioni di sequenziamento aggiungendo 1 μL di 10 ng/μL di DNA, 1 μL di primer e 8 μL di _NF-H2O a un tubo da 0,2 mL. Ripeti questo per ogni primer.
       NOTA: quando i campioni vengono preparati, consegnarli presso l'impianto di sequenziamento e confrontare i risultati con la sequenza plasmidica utilizzando un software di clonazione molecolare.
19. In questa fase, generare circa 100-1000 ng / μL di campione di DNA per integrare i plasmidi contenenti circuiti genici nella linea cellulare appropriata.

2. Ingegneria della linea cellulare stabile

1. Ordinare una linea cellulare di mammiferi progettata per la rapida generazione di sottolinee stabili che garantiscano un'espressione di alto livello della proteina di interesse da un vettore di espressione dei mammiferi. Il tipo di cella e la facilità di ingegnerizzazione della linea cellulare possono essere variabili a seconda di ciò che gli utenti preferiscono o mirano a raggiungere.
   1. Ad esempio, se gli utenti preferiscono l'ingegneria della linea cellulare con passaggi intermedi minimi, ordinare le cellule che contengono un singolo sito di integrazione stabile (ad esempio, FRT) in un locus genomico trascrizionalmente attivo. Se si preferisce un'ingegneria cellulare più sfumata, creare siti di integrazione nelle posizioni preferite utilizzando strumenti di ingegneria genetica come CRISPR / Cas9.
2. Coltiva cellule al 5% di _CO2 in aria umidificata a 37 °C. Regolare le condizioni di crescita in base alle esigenze per il tipo di cella.
3. Trasfettate i circuiti genici progettati sopra nelle cellule desiderate ottenute dai passaggi precedenti per iniziare un processo di generazione stabile della linea cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare una miscela di ^liposomi45 del DNA del circuito genico con una ricombinasi appropriata (ad esempio, Flp-ricombinasi per la ricombinazione Flp-FRT) o attraverso altri metodi come l'elettroporazione.
4. Due giorni dopo la trasfezione, dividere le cellule al 25% di confluenza.
5. Sei ore dopo aver diviso le cellule, iniziare la selezione antibiotica scambiando il supporto con un mezzo fresco contenente 50 μg / mL di antibiotico igromicina (o un altro agente antibiotico corrispondente al gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi scelto durante la costruzione del plasmide).
   NOTA: Ci sono una varietà di geni di resistenza agli antibiotici dei mammiferi utilizzati nella costruzione del circuito genico, ognuno dei quali ha una curva di uccisione diversa. Pertanto, qualunque sia il gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi scelto per la costruzione del circuito, una curva di uccisione adeguata dovrebbe essere studiata nelle cellule di interesse. Questo passaggio garantisce che le cellule contenenti il carico utile del circuito genico siano arricchite mentre quelle senza il sistema vengono uccise.
6. Lasciare che le cellule crescano nel mezzo di selezione degli antibiotici, passare a mezzi freschi ogni 2-3 giorni fino a quando il piatto o il pallone ha qualche dozzina di focolai. Passare colture aderenti quando sono nella fase di log prima che raggiungano la confluenza.
7. Una volta che ci sono abbastanza focolai, tripsinizzare le cellule con 1 ml di tripsina allo 0,25%, EDTA allo 0,1% nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio per diversi minuti. Neutralizzare la tripsina con mezzi freschi e passare tutte le cellule in un contenitore fresco.
8. Una volta che le cellule nel contenitore fresco sono confluenti all'80% -100%, congelale in un mix di 45% di vecchi supporti, 45% di supporti freschi e 10% dmSO. Trasferire le cellule rimanenti in un tubo sterile ed eseguire lo smistamento a singola cellula per isolare le cellule monoclonali in una piastra a 96 pozzetti.
9. Circa 2-3 settimane dopo lo smistamento monoclonale, i pozzetti all'interno della piastra a 96 pozzetti dovrebbero avere focolai. Quando circa il 50% -60% confluisce, dividere le cellule in una piastra a 12 pozzetti.
10. Una volta che la piastra a 12 pozzetti è confluente all'80%-100%, divisa in un pallone T-25 trattato con coltura tissutale. Una volta che le cellule nel pallone T-25 sono confluenti all'80% -100%, congelare le cellule e mantenere un passaggio per la caratterizzazione e il test delle linee cellulari monoclonali.
    1. Caratterizzare le linee cellulari monoclonali mediante microscopia e saggi di citometria a flusso per riportare profili di espressione genica basati sulla produzione di reporter fluorescenti indotti. Verificare la produzione di proteine funzionali tramite l'etichettatura degli anticorpi fluorescenti e il test di immunofluorescenza. Testare l'induzione dell'espressione genica a livello trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Convalidare la sequenza genetica e l'accuratezza dell'integrazione tramite il sequenziamento locale e dell'intero genoma dei cloni.

3. Saggi di induzione dell'apparato a piastre leggere

1. Costruire un dispositivo ^LPA31,46 da utilizzare per l'induzione luminosa di celle ingegnerizzate. In breve, diversi passaggi generali sono cruciali per la creazione di LPA da utilizzare per il controllo dell'espressione genica. Questi includono la stampa 3D di componenti del telaio LPA, la costruzione del circuito stampato, la programmazione del circuito tramite programmatore di microcontrollori, l'assemblaggio dei componenti in un LPA finale, la programmazione della scheda di memoria tramite software IRIS e la calibrazione del dispositivo finito. Per una spiegazione più approfondita, fare riferimento ai riferimenti di cui sopra.
   1. Stampare le parti 3D come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46.
   2. Assemblare il circuito stampato come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46.
   3. Aggiungere il firmware al circuito LPA assemblato utilizzando il programmatore di microcontrollori come descritto in Gerhardt et al. (2016 e 2019) ^31,46.
   4. Combina parti stampate in 3D e il circuito assemblato come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019) ^31,46. Ciò include l'acquisizione della piastra di montaggio, del circuito stampato, del distanziatore a LED (diodi emettitori di luce), dell'adattatore per piastre, di una piastra a 24 pozzetti, di un coperchio della piastra, dei bulloni di montaggio e dei dadi alari e dei componenti impilabili, come mostrato nel video filmato e nella Figura 2.
   5. Per la programmazione della scheda di memoria e la calibrazione del dispositivo, attenersi alla procedura descritta di seguito.
2. Utilizzare il software IRIS disponibile sul sito Web Tabor ^Lab47 per programmare una scheda SD per il Light Plate Apparatus (LPA)³¹ ed esplorare le condizioni di luce appropriate necessarie per iniziare un esperimento optogenetico.
   NOTA: Il software IRIS è un'applicazione web-based per la programmazione dell'hardware elettronico optogenetico, noto come LPA, sviluppato dal Tabor Lab. Il software consente la programmazione dei relativi valori IRIS che controllano i singoli diodi emettitori di luce (LED) in ciascun pozzetto dell'hardware LPA.
3. Scegliere l'opzione a discesa LPA (4 x 6), quindi fare clic sull'approccio di illuminazione appropriato (Stato stazionario, Dinamico, Avanzato).
   NOTA: Per questo manoscritto, tutti i saggi si concentreranno sugli esempi di stato stazionario. Tuttavia, gli esempi di impostazione avanzata possono essere utilizzati per la durata degli impulsi e i regimi del ciclo di lavoro.
4. Scegli se i LED superiori o inferiori saranno illuminati inserendo valori nelle celle corrispondenti ai pozzetti della piastra. Per gli LPA utilizzati in questo lavoro, i LED blu posti in prima posizione sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Ogni LED, una volta programmato, può fornire un'esposizione continua alla luce con un'intensità luminosa costante. Il software IRIS consente di programmare 4096 livelli di intensità.
5. Una volta scelte le posizioni dei LED, immettere i valori di intensità per il contorno sperimentale desiderato. Ad esempio, immettere 8 diverse intensità luminose (o durate di impulso o cicli di lavoro) con tre repliche tecniche per piastra (Tabella 2). G.s. si riferisce alle unità in scala di grigi, i valori di misurazione del livello di intensità luminosa utilizzati per la programmazione LPA nel software IRIS.
   1. Quando si progettano file sperimentali IRIS, tenere presente gli effetti dei bordi dai pozzetti adiacenti sul dispositivo LPA, la tossicità della luce derivante dall'aumento delle intensità di esposizione alla luce blu e la determinazione del tipo di dose-risposta desiderata (ad esempio, monotonica vs non monotona).
   2. Se gli utenti programmano le celle nell'LPA in ordine ascendente/decrescente di un particolare parametro di luce (ad esempio, intensità), i pozzetti possono produrre effetti di bordo della diafonia della luce o persino calore che può influenzare i pozzi adiacenti. Ciò può inavvertitamente influenzare il risultato dei risultati misurati quando gli esperimenti sono completi. Per alleviare questo problema, gli utenti possono implementare una matrice di randomizzazione sul software IRIS per rimescolare le posizioni dei pozzi, riducendo al minimo gli effetti dei bordi. Un esempio è descritto nei risultati rappresentativi riportati di seguito (Figura 4A-B).
   3. Inoltre, è stato scoperto che intensità più elevate di luce blu interferiscono con la crescita e la vitalità ^cellulare48. Pertanto, per mitigare la tossicità della luce, è importante produrre una curva di intensità luminosa, durata dell'impulso o risposta del ciclo di lavoro a seconda della modalità studiata.
      1. Ad esempio, programmare 8 valori di intensità luminosa con tre repliche per piastra da 24 pozzetti, con un intervallo da nessuna luce a un'intensità massima dell'LPA. Quindi, eseguire questi campioni su un citometro a flusso con un gate SSC-FSC o una macchia viva come lo ioduro di propidio per quantificare la sopravvivenza delle cellule della popolazione (cellule viventi rispetto agli eventi totali tra cui cellule morte / detriti cellulari) a ciascun valore di luce.
      2. Quindi, determinare la quantità ideale di sopravvivenza della popolazione per la configurazione sperimentale, poiché qualsiasi stimolo può influire negativamente sulla proliferazione, sull'espressione genica o sulla sopravvivenza (ad esempio, impostando la sopravvivenza cellulare dell'80% come compromesso appropriato). Ad esempio, in questo lavoro, una volta calibrato, l'intensità non superava le unità di 3000 g.s. (~3/4 l'intensità massima del dispositivo LPA). Un esempio di questo è descritto nei Risultati rappresentativi di seguito.
   4. Oltre a limitare i valori di luce a causa della tossicità, gli utenti potrebbero voler limitare i valori di luce per caratterizzare una particolare parte della dose-risposta, come l'intervallo della risposta monotona.
      1. Per raggiungere questo obiettivo, inizialmente eseguire la scansione di un'ampia gamma di intensità luminose, durate di impulsi o cicli di lavoro a seconda della modalità analizzata nel determinare la dose-risposta desiderata (Tabella 2) per restringere il regime di luce di interesse, ad esempio, dove l'espressione genica è correlata positivamente con l'aumento dei valori di luce per una dose-risposta monotona.
      2. Per determinare l'intervallo di luce di interesse, programmare un singolo LPA con un massimo di 24 pozzetti di diversa intensità / durata dell'impulso / ciclo di lavoro / ecc. o più pozzi (ad esempio, 48, 72, 96, ecc.) a seconda che più LPA siano calibrati per fornire quantità di luce equivalenti e procedere con il lavoro di coltura cellulare o i saggi descritti di seguito. Pertanto, iniziare la caratterizzazione di un sistema optogenetico con un ampio intervallo di dosi di stimoli luminosi per determinare l'intervallo che dà l'espressione genica desiderata e successivamente eseguire esperimenti in quell'intervallo di dose raffinato.
      3. Ad esempio, in questo lavoro, una volta che 3000 g.s. unità sono state determinate come soglia per l'intensità della luce tossica; questa soglia è stata utilizzata come limite superiore della luce per i saggi descritti di seguito (ad esempio, immunofluorescenza).
         NOTA: I passaggi precedenti sono indipendenti dalla calibrazione ottica dell'LPA e si riferiscono a una calibrazione a livello molecolare per ciascun sistema optogenetico.
6. Una volta programmati i valori di intensità luminosa appropriati in IRIS, inserire una scheda di memoria con la presa USB 3.0 nell'LPA per scaricare e trasferire i file.
7. Se la calibrazione dell'LPA è ^completa31, procedere al lavoro di coltura cellulare per l'avvio del saggio di induzione della luce. Se la calibrazione non è stata eseguita, calibrare l'LPA utilizzando un metodo di analisi dell'immagine (passaggi 3.7.1-3.7.3) una volta programmato l'LPA con il programmatore del microcontrollore.
   1. Programmare brevemente l'LPA per avere lo stesso livello IRIS descritto da Gerhardt et al. (2016)³¹.
      NOTA: Per la calibrazione, l'LPA è stato programmato per avere un valore di 2000 g.s.
   2. Una volta programmato il dispositivo con la scheda di memoria e premuto il pulsante di ripristino (pulsante fisico sull'LPA), acquisire un'immagine dell'intero dispositivo (ad esempio, imager della stazione gel, dispositivo scanner, ecc.). Per la calibrazione, acquisire due immagini con il dispositivo ruotato di 180°.
   3. Quindi, utilizzare un software open source progettato da Gerhardt et al. (2016) ³¹ per mostrare la variabilità dell'intensità del LED sulla piastra LPA e calcolare i valori di compensazione dei LED per rendere l'intensità uguale tra i pozzi. Un esempio di questo è descritto nei risultati rappresentati di seguito (Figura 3). Una volta completata questa calibrazione, procedere al lavoro di coltura cellulare per l'avvio del saggio di induzione della luce.
8. Ottenere palloni di cellule monoclonali ingegnerizzate dalla sezione precedente per studiare gli effetti di induzione della luce sull'espressione genica.
9. Rimuovere il vecchio supporto dal pallone.
10. Aggiungere 1 mL di tripsina alle cellule e incubare per 5 minuti.
11. Dopo 5 minuti, neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM o altri mezzi desiderati) integrato con le sostanze chimiche necessarie (questo lavoro ha utilizzato 50 μg / mL di igromicina, soluzione di penicillina / streptomicina all'1%, siero bovino fetale al 10%, FBS).
12. Aggiungere ~ 75.000 celle per pozzetto in una piastra nera a 24 pozzetti in un volume totale di 500 μL. Il numero di cellule seminate può variare a seconda della durata dell'esperimento desiderato e del tipo di cellula utilizzata.
    NOTA: Inoltre, si noti che la densità di semina cellulare influisce sul mantenimento della coltura e potenzialmente sulla durata dell'esperimento. Partire da un numero inferiore di cellule per pozzo garantisce una durata temporale più lunga prima che la coltura raggiunga la confluenza. Inoltre, il tipo di componenti optogenetiche integrate nei circuiti genici di interesse influenzerà quando l'espressione genica raggiunge uno stato stazionario e quindi influenzerà la durata degli esperimenti. Altri fattori che possono essere considerati sono i tassi di crescita specifici della linea cellulare, la composizione dei media e gli effetti di crescita condizionali (cioè la luce).
13. Dopo la placcatura, posizionare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di _CO2 per consentire loro di stabilirsi per 2-6 ore.
14. Dopo l'incubazione, trasferire le cellule in un cappuccio di coltura di tessuto, rimuovere il coperchio di plastica e aggiungere una striscia di lamina adesiva nella parte superiore della piastra (Figura 2D). Questo passaggio consente un trasferimento minimo di luce tra i pozzetti, poiché la parte superiore e i lati dei pozzetti sono rivestiti e la luce può ora entrare solo dal fondo del pozzo in cui è posizionato il LED.
15. Posizionare la piastra nelle parti 3D montate dell'LPA. Quindi, coprire la piastra con il coperchio LPA stampato in 3D, che si adatta alle viti del dispositivo su ogni angolo.
16. Collegare il dispositivo alla fonte di alimentazione e premere il pulsante di ripristino sul dispositivo LPA per assicurarsi che vengano applicate le impostazioni dell'esperimento LPA aggiornate.
17. Incubare le cellule all'interno del sistema sperimentale per un periodo di tempo appropriato, a seconda della densità di semina originale, della velocità di crescita specifica della linea cellulare e delle condizioni di crescita. In questo esempio, le linee cellulari sono state indotte per 3 giorni ininterrottamente affinché l'espressione genica raggiungesse uno stato stazionario. Tuttavia, va notato che molti sistemi optogenetici (ad esempio, VVD) possono raggiungere l'espressione genica allo stato stazionario molto prima (ad esempio, 24 ore), e quindi i tempi di induzione sperimentale possono essere ridotti o prolungati secondo necessità.
18. Alla fine dell'esperimento di induzione della luce, utilizzare i campioni per uno dei seguenti quattro saggi per caratterizzare le linee cellulari ingegnerizzate (sezioni 4-7).

4. Microscopia a fluorescenza di cellule ingegnerizzate indotte dalla luce

1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule nell'LPA dall'incubatore e metterle in una cappa di coltura tissutale.
2. Rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per 1-2 minuti. Ciò impedisce la formazione di condensa sul coperchio di plastica, se posizionato immediatamente sulla piastra.
3. Dopo 1-2 minuti di seduta, rimettere il coperchio di plastica originale sul piatto.
4. Immagine delle cellule con il microscopio a contrasto di fase o a fluorescenza appropriato.
5. A seconda dello strumento, regolare il tempo di esposizione, l'intensità della sorgente luminosa e il guadagno per la visualizzazione delle celle ingegnerizzate. In questo esperimento, sono stati applicati i seguenti parametri: 50 ms per il tempo di esposizione alla sorgente luminosa FITC/GFP (proteina fluorescente verde) e 1-5 ms per il tempo di esposizione a contrasto di fase al 100% di intensità per ciascuno.
   NOTA: Va notato che i tempi di esposizione ottimali, i livelli di guadagno e le intensità delle sorgenti luminose sono spesso derivati empiricamente dall'esperienza di questo lavoro per ridurre al minimo la sovrasaturazione nel reporter di fluorescenza, ridurre al minimo il danno cellulare e acquisire immagini adeguate per l'analisi qualitativa e quantitativa. Quando si determinano i livelli di ciascuno di questi parametri, gli aspetti da tenere a mente includono la massimizzazione dei rapporti segnale-rumore, la minimizzazione della fototossicità, la minimizzazione della sovrasaturazione dei segnali di fluorescenza e l'aumento della capacità di amplificare i deboli segnali di fluorescenza.
   1. Ottimizzare questi parametri grossolanamente ad-hoc; tuttavia, i precedenti valori sperimentali (ad esempio, l'intensità della sorgente luminosa che causa la sovrasaturazione del reporter di fluorescenza) possono guidare le future impostazioni sperimentali, se applicabile. Ad esempio, le impostazioni di guadagno, i tempi di esposizione e i valori iniziali dell'intensità luminosa di un circuito (LITer1.0) o di una configurazione sperimentale (ad esempio, intensità luminosa) possono essere utilizzati come punto di partenza quando si passa a un circuito genico simile ma diverso (LITer2.0)¹¹ o a una diversa modalità di luce (ad esempio, ciclo di lavoro leggero).
6. Semplifica l'imaging delle lastre tramite un modello di coordinate programmato nel software di microscopia consentendo all'intera dimensione della lastra (ad esempio, 24 pozzetti) di avere un'acquisizione automatica delle immagini da più posizioni di immagine per pozzetto.

5. Citometria a flusso di cellule ingegnerizzate indotte dalla luce

1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
2. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per un minuto o due.
3. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
4. Aggiungere 100 μL di tripsina allo 0,25% a ciascun pozzetto, coprire la piastra con un coperchio di plastica e riposizionarla nell'incubatrice.
5. Lasciare le cellule indisturbate nell'incubatrice per 5 minuti.
6. Dopo 5 minuti, rimuovere la piastra e restituirla al cappuccio della coltura del tessuto.
7. Neutralizzare bene ogni tripsinizzato con 400 μL di DMEM.
8. Etichettare un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 ml con filtro cellulare (o tubo citometrico a flusso appropriato che può essere filtrato per rimuovere grandi ciuffi di cellule non completamente tripsinate) con un nome corrispondente a ciascun pozzetto.
9. Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù 6-8 volte per rompere i grumi cellulari e creare campioni unicellulari per la citometria a ^flusso49.
10. Trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto (~500 μL) ai tubi etichettati con il filtro.
11. Portare le cellule allo strumento di citometria a flusso appropriato con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
    NOTA: Il citometro a flusso utilizzato in questo lavoro faceva parte di una struttura centrale situata presso l'ospedale universitario.
12. Creare un gate a dispersione diretta e laterale (FSC e SSC, rispettivamente) per catturare le singole cellule delle dimensioni e della granularità appropriate per escludere detriti e grumi cellulari sul software di citometria a flusso.
13. Una volta impostato il cancello, cattura circa 10.000 celle con il cancello appropriato. Regola questo numero in base alla quantità di dati cellulari che gli utenti stanno cercando. Ripetere per ogni tubo contenente le cellule dell'esperimento.
14. Una volta completato l'esperimento, importare i dati nel software di dati di citometria a flusso disponibile per l'analisi.
15. Creare un gate FSC-SSC (come prima durante l'acquisizione) e applicarlo a ciascun batch di dati sperimentali. Un pozzo di riferimento della popolazione cellulare non indotta viene utilizzato per creare questo gate in questo manoscritto, ma esistono altre metriche per la creazione di gate, come le porte basate sulla densità.
16. Con le condizioni sperimentali chiuse con un gate FSC-SSC, tracciare i dati della citometria a flusso come istogrammi o rappresentare in altri modi per illustrare i modelli di espressione ottenuti. In questo esperimento, la fluorescenza è stata catturata dai canali GFP/FITC o PE/TexasRed.

6. Estrazione dell'RNA e PCR quantitativa dei componenti del circuito genico

1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
2. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per un minuto o due.
3. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
4. Procedere all'estrazione dell'RNA dalle cellule utilizzando l'apposito kit di estrazione dell'RNA.
5. Una volta completata l'estrazione dell'RNA, eseguire una reazione di trascrizione inversa di ciascun campione (Tabella 3).
6. Inoltre, eseguire la PCR quantitativa di ciascun campione (Tabella 4). Utilizzare una DNA polimerasi e un protocollo associato per impostare le reazioni PCR. Per questo passaggio, impostare una reazione multiplexata con un gene di pulizia e un gene di interesse o creare reazioni separate. In questo esempio, sono stati sondati i livelli di GFP, KRAS e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). Dopo aver completato l'esperimento qRT-PCR, procedere con l'analisi tramite il software disponibile per illustrare il cambiamento di piega del circuito genico a livello di RNA.

7. Immunofluorescenza dei componenti del circuito genico

1. Utilizzare un bagno di ghiaccio o un congelatore per raffreddare il metanolo.
2. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
3. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per 1-2 minuti.
4. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
5. Aggiungere 100 μL di tripsina allo 0,25% a ciascun pozzetto, coprire la piastra con un coperchio di plastica e riposizionarla nell'incubatrice.
6. Lasciare le cellule indisturbate nell'incubatrice per 5 minuti.
7. Dopo 5 minuti, rimuovere la piastra e restituirla al cappuccio della coltura del tessuto.
8. Neutralizzare bene ogni tripsinizzato con 400 μL di DMEM.
9. Etichettare i tubi mini-centrifuga con i nomi corrispondenti a ciascun pozzetto.
10. Utilizzare una pipetta P1000 e pipetta il contenuto di ciascun pozzetto su e giù 6-8 volte per rompere i grumi cellulari.
11. Trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto (~500 μL) ai tubi etichettati.
12. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
13. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
14. Risospesso le cellule (utilizzare una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari) in 750-1000 μL di paraformaldeide al 4% (diluita in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS).
15. Lasciare riposare le celle per 15 minuti a temperatura ambiente.
16. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL di PBS. Pipetta su e giù più volte.
17. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
18. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
19. Risospesciare le celle (utilizzare una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari) in 750-1000 μL di metanolo ghiacciato.
20. Lasciare riposare le celle per 30 minuti sul ghiaccio o in un congelatore a -20 °C.
21. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL di PBS. Pipetta su e giù più volte.
22. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
23. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
24. A seconda del tipo di anticorpi utilizzati, modificare il protocollo da questo punto in avanti. Seguire i passaggi 7.24.1-7.24.14 o 7.24.15-7.24.22.
    1. Se si utilizza un anticorpo primario e secondario, risospesciare le cellule utilizzando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpo primario. In questo caso, è stata effettuata una diluizione di 1:800 per gli anticorpi di riserva, tra cui l'anticorpo KRAS o l'anticorpo ERK, ed è stato permesso di rimanere seduto per 1 ora a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono stati diluiti in un tampone di incubazione costituito da 1x PBS con 0,5 g di BSA.
       NOTA: Determinare empiricamente l'esatta diluizione dell'anticorpo creando una curva standard di diluizioni anticorpali rispetto all'antigene di interesse.
    2. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi marcati.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    4. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    5. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
    6. Risospese le cellule usando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpi secondari. In questo caso, le cellule sono state risospese in anticorpi secondari da 100 μL ad una diluizione di 1:800 per l'anticorpo KRAS o 1:2000 per l'anticorpo ERK e lasciate riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Simile agli anticorpi primari, diluire gli anticorpi secondari nel tampone di incubazione come descritto sopra. Determinare le diluizioni degli anticorpi secondari sulla base dei risultati empirici di una curva standard.
    7. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi etichettati.
    8. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    9. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    10. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
    11. Risospesciare le celle usando una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 500 μL di PBS.
    12. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo (~500 μL) ai tubi etichettati con filtri.
    13. Portare le cellule a strumenti di citometria a flusso appropriati con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
        NOTA: Va notato che avere diversi controlli è importante per progredire con la misurazione della citometria a flusso e l'analisi dell'espressione genica delle cellule ingegnerizzate. Ad esempio, avere cellule completamente non macchiate, cellule colorate con solo anticorpi primari e cellule colorate con anticorpi secondari da soli può essere utile per confrontare i risultati con i segnali di fondo degli anticorpi.
    14. Successivamente, procedere con l'analisi come descritto nella sezione 5.
    15. Se si utilizza solo un anticorpo primario, risospesare le cellule utilizzando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpo primario marcato. Determinare la diluizione anticorpale appropriata e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Determinare empiricamente la diluizione anticorpale dalla curva standard.
    16. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi marcati.
    17. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    18. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    19. Risospesciare le celle usando una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 500 μL di PBS.
    20. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo (~500 μL) in tubi etichettati con filtri.
    21. Portare le cellule a strumenti di citometria a flusso appropriati con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
        NOTA: Va notato che avere diversi controlli è importante per progredire con la misurazione della citometria a flusso e l'analisi dell'espressione genica delle cellule ingegnerizzate. Avere cellule completamente non macchiate e cellule macchiate con anticorpi primari da soli sono utili per confrontare i risultati con i segnali di fondo degli anticorpi.
    22. Da questo punto, procedere con l'analisi come descritto nella sezione 5.

Representative Results

L'assemblaggio del circuito genico e la generazione di linee cellulari stabili all'interno di questo articolo erano basati su cellule HEK-293 modificate commerciali contenenti un sito FRT trascrizionalmente attivo e singolo stabile (Figura 1). I circuiti genici sono stati costruiti in vettori che avevano siti FRT all'interno del plasmide, consentendo l'integrazione Flp-FRT nel genoma cellulare HEK-293. Questo approccio non è limitato alle cellule Flp-In, poiché i siti FRT possono essere aggiunti a qualsiasi linea cellulare di interesse in qualsiasi parte del genoma utilizzando la tecnologia di modifica del DNA come CRISPR / ^Cas950.

Una volta costruite e convalidate le linee cellulari appropriate per il corretto inserimento, i software LPA e IRIS sono stati scelti come protocollo standardizzato per l'induzione luminosa dell'espressione ^genica31,51. Il sistema LPA consente di programmare 24 pozzetti per l'induzione di cellule di mammifero in più condizioni sperimentali a seconda dell'intensità luminosa, della durata dell'impulso e del ciclo di lavoro (Figura 2). All'interno di questo articolo, sono state prioritarie l'intensità della luce spazialmente uniforme, la durata dell'impulso e il ciclo di lavoro. Tuttavia, i ricercatori possono utilizzare il software IRIS e l'LPA per una programmazione più avanzata dei modelli di onde luminose temporali.

Un aspetto cruciale dell'LPA da affrontare prima di iniziare gli esperimenti è la calibrazione ottica che può essere eseguita per dispositivi singoli o multipli. Il metodo di analisi delle immagini descritto in ^precedenza31 utilizzato per la calibrazione richiede un'immagine dell'intero LPA con tutti i LED di interesse accesi, che possono essere acquisiti da una varietà di ^fonti52, incluso un imager gel. Qui, uno scanner per computer è stato utilizzato per l'acquisizione di immagini (Figura 3A). Una volta acquisita l'immagine, il software open source creato da Gerhardt et al. (2016)³¹ è stato utilizzato per calcolare i valori di compensazione per ciascun LED per garantire che ogni LPA emetta la stessa intensità a un determinato valore in scala di grigi. Il software sottrae il segnale di sfondo, soglie l'immagine in una categoria binaria e calcola l'intensità dei pixel (Figura 3B). Dalla calibrazione è stata riscontrata una variazione minima tra i LED, con un CV di 0,04 tra 96 pozzetti (o 4 piastre calibrate, Figura 3C). Infine, utilizzando il software di calibrazione è stata dimostrata la variazione del LED per posizione (Figura 3D) e creato una regolazione in scala di grigi (Figura 3E) in modo che ogni LED sia normalizzato alla stessa intensità.

Oltre alla calibrazione, altri aspetti importanti dell'utilizzo dell'LPA includono l'integrazione di diversi controlli nella pipeline sperimentale che possono ridurre al minimo gli errori sistemici limitando variabili confondenti come gli effetti di tossicità della luce e le limitazioni di progettazione basate su materiali sperimentali. Ad esempio, la Figura 4 illustra due diverse configurazioni per la programmazione di diverse intensità luminose nei pozzetti LPA. Il primo sottopannello della Figura 4A mostra un'organizzazione ascendente dell'intensità luminosa. Ciò può facilitare la programmazione e l'analisi dei dati, ma può produrre effetti di bordo in cui la riga inferiore dell'LPA ha la più alta intensità luminosa e può potenzialmente causare calore indesiderato e induzione di luce nei pozzi vicini. Allo stesso modo, nel secondo sottopannello della Figura 4A, una matrice di randomizzazione è stata applicata al software IRIS, creando varie intensità luminose in posizioni casuali. Ciò può ridurre al minimo le influenze sistemiche degli effetti edge. Una matrice decodificata (Figura 4B) viene creata con il software IRIS, che può quindi essere utilizzata per determinare le condizioni sperimentali dopo il completamento dell'esperimento e durante l'analisi. Simile alla randomizzazione dei pozzi, gli utenti dovrebbero anche essere consapevoli degli effetti di tossicità della luce che possono verificarsi (luce blu all'interno di questo lavoro). Nella Figura 4C, due diverse intensità luminose utilizzate per l'induzione del circuito genico sono mostrate con la stessa porta FSC-SSC basata sulla popolazione non indotta di cellule ingegnerizzate. Pertanto, gli utenti dovrebbero eseguire una dose-risposta sulla modalità di interesse della luce (ad esempio, impulso, ciclo di lavoro, ecc.) per determinare gli effetti di tossicità della luce che possono verificarsi nella fascia alta dell'esposizione (Figura 4D). Qui, l'aumento dei livelli di luce blu ha causato detriti cellulari dose-dipendenti, cellule morte e grumi rispetto alle cellule non stimolate. Pertanto, l'intensità luminosa continua era limitata a circa 3/4 dell'intensità massima LPA (~ 3000 g.s. unità).

Una volta impostata l'attrezzatura adeguata, l'espressione genica è stata quindi indotta in circuiti genici LITer ingegnerizzati tramite microscopia a fluorescenza (Figura 5). Le cellule sono state indotte a diverse durate dell'impulso luminoso sull'LPA, che ha dato una leggera dose-risposta di espressione genica a livello di popolazione. Le cellule all'interno di questo lavoro sono state fotografate per l'espressione GFP utilizzando 50 ms per il tempo di esposizione della sorgente luminosa FITC / GFP e per l'imaging del campo luminoso utilizzando 1-5 ms per il tempo di esposizione a contrasto di fase. Data la robustezza di questo protocollo di ingegneria della linea cellulare, qualsiasi marcatore di fluorescenza potrebbe essere utilizzato al posto della GFP. Le cellule possono essere indotte con più regimi di luce e produrre una vasta gamma di risposte (Figura 5). Quest'ultimo è utile per controllare ulteriormente l'espressione di geni funzionali (ad esempio, KRAS (G12V) oncogene nel lavoro ^originale53).

Immediatamente dopo la microscopia a fluorescenza, le cellule potrebbero essere analizzate in una varietà di protocolli sperimentali, tra cui citometria a flusso, qRT-PCR e immunofluorescenza. In questo lavoro, la citometria a flusso è stata eseguita come prima procedura di convalida ed eseguita seguendo i metodi sopra descritti (Figura 6). Simile alla microscopia, le cellule sono state indotte a diversi valori di lunghezza dell'impulso e hanno mostrato una dose-risposta dell'espressione genica di oltre quattro volte il cambiamento da stati non indotti a livello di popolazione (Figura 6A-B). Allo stesso modo, la riduzione del rumore di espressione genica può essere dimostrata confrontando vari valori di intensità luminosa (Figura 6C-D) per il sistema LITer rispetto a un sistema di regolazione positiva (nessun feedback) come il VVD / ^LightOn54. Quando si confronta il LITer con il sistema VVD, il feedback negativo raggiunge una riduzione del rumore di espressione genica di oltre cinque volte. Le stesse cellule preindotte fotografate al microscopio potrebbero anche essere analizzate tramite qRT-PCR (Figura 7). Simile alla citometria a flusso, le cellule LITer ingegnerizzate potrebbero esprimere i livelli di RNA in modo dose-responsivo (oltre 10 volte l'induzione da stati non indotti), corrispondendo alla dose-risposta dei livelli proteici quantificati dall'espressione di GFP sulla citometria a flusso. I dati della microscopia a fluorescenza e della citometria a flusso menzionati possono essere calibrati utilizzando cellule non fluorescenti, cellule fluorescenti che esprimono costitutivamente e perle di convalida fluorescenti a 6-8 picchi (ad esempio, perle verdi a canale FL1, fluorescenti). Ognuno di questi componenti può consentire la normalizzazione dell'espressione genica in un singolo esperimento. Tuttavia, questi fattori possono anche consentire la normalizzazione di circuiti e cellule ingegnerizzate attraverso diverse piastre sperimentali, condizioni sperimentali e giorni per consentire il confronto e la standardizzazione dei dati di espressione genica.

Infine, i circuiti genici LITer possono essere ingegnerizzati per esprimere geni funzionali, come il KRAS (G12V, Figura 8). La versatilità di questa pipeline consente agli utenti di utilizzare l'architettura LITer con l'ingegneria cellulare per qualsiasi gene funzionale di interesse, eventualmente incorporando architetture aggiuntive come il feedback positivo. Il LITer ha mostrato quantità crescenti di luce blu che hanno portato ad un aumento dei livelli di uscita del circuito genico (livelli di proteina KRAS (G12V)) e, di conseguenza, livelli di ERK fosforilati, entrambi i quali possono essere quantificati tramite saggi di immunofluorescenza.

Frammento	Rapporto	Dimensione (bp)	Concentrazione di peso del frammento di DNA (ng/μL)	Concentrazione molare del frammento di DNA (fmol/μL)	Volume (μL)	Massa molare del DNA risultante (fmol)
Frammento di vettore madre 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Frammento di vettore madre 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gene di interesse	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Totale					10.00	105.87

Tabella 1: Calcolo della miscela principale della reazione di assemblaggio del DNA (fase 1.13). Le colonne 2 e 3 si basano sulla dimensione dei frammenti di DNA assemblati e sulla concentrazione di questi frammenti dopo l'amplificazione PCR e l'estrazione del gel di agarosio (fase 1.11). La cella inferiore della ^4a colonna (volume totale della reazione) può essere modificata; tuttavia, si consiglia il volume indicato. Le celle non ombreggiate vengono generate automaticamente.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tabella 2: Programmazione IRIS delle intensità luminose (g.s.) per l'esperimento di induzione della luce in una piastra a 24 pozzetti con tre repliche (fase 3.4). Distribuzione di intensità luminose comprese tra 0 e 3000 g.s. G.s.-unità in scala di grigi. Questo può essere randomizzato dal software IRIS secondo necessità.

	Esempio 1	Esempio 2	Esempio 3
Volume master mix della trascrittasi inversa (μL)	4.00	4.00	4.00
Modello di RNA (1000 ng) Volume (μL)	2.00	3.00	4.00
NF-H20 Volume (μL)	14.00	13.00	12.00
Volume totale (μL)	20.00	20.00	20.00

Tabella 3: Calcolo del mix principale di trascrizione inversa (fase 6.5). Il volume totale raccomandato per la reazione è di 20 μL e i suoi componenti sono il master mix dell'enzima trascrittasi inversa (qui: 5x), il modello di RNA e l'acqua priva di nucleasi. In questo esempio, le concentrazioni di RNA dei campioni 1, 2 e 3 sono rispettivamente 500, 333 e 250 ng/μL.

	Esempio 1	Esempio 2	Esempio 1 & 2 Multiplexed
Volume della sonda GFP (μL)	1	-----	1
Volume della sonda GAPDH (μL)	------	1	1
Volume master mix della DNA polimerasi (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) Volume (μL)	2	2	2
NF-H20 Volume (μL)	7	7	7
Volume totale (μL)	20	20	20

Tabella 4: Calcolo quantitativo della miscela master PCR (fase 6.6). Il volume totale raccomandato per la reazione è di 20 μL e i suoi componenti sono il master mix dell'enzima DNA polimerasi (qui: 2x), sonde GFP e/o GAPDH, cDNA (100 ng totali) e acqua priva di nucleasi (_NF-H20).

Figura 1: Progettazione di circuiti e ingegneria cellulare. (A) Strumenti di ingegneria cellulare, tra cui circuito genico sintetico LITer con siti di integrazione FRT, enzima ricombinasi (Flp ricombinasi) per l'integrazione del circuito, farmaco utilizzato per la selezione di cloni genetici appropriati e linea cellulare di interesse utilizzata per la creazione di linee cellulari di mammiferi optogenetiche desiderate. (B) I sistemi genetici ingegnerizzati possono essere integrati in uno specifico sito FRT contenente locus all'interno del genoma umano. Questi loci genomici possono quindi esprimere specifici geni di resistenza agli antibiotici o fluorescenti reporter per la selezione di cassette genetiche correttamente integrate. L'integrazione del circuito genico può essere avviata con l'uso di ricombinasi che riconoscono siti specifici all'interno della cassetta genetica originale. Questo introduce un nuovo gene di selezione della resistenza ai farmaci che può garantire la generazione di cellule correttamente ingegnerizzate con il circuito genico desiderato. Nella parte inferiore del pannello B c'è l'architettura del circuito genico per il sistema di feedback optogenetico negativo, LITer2.0. Questo circuito è composto da una proteina TetR auto-repressiva fusa con un dominio light-oxygen-voltage-sensing (LOV2), una sequenza linker P2A che consente un trascritto multicistronico e GFP. Quando viene applicata la luce blu, la sequenza TIP si apre dal dominio LOV2, inibendo la proteina TetR e consentendo una trascrizione aumentata e dose-reattiva sia del TetR che del reporter GFP. La proteina TetR inibita non è in grado di legarsi e reprimere nel sito operatore del DNA, aumentando così la trascrizione. Questo feedback negativo mantiene basso il rumore di espressione genica e consente un cambiamento elevato dell'espressione genica. FRT - flip recognition target, HygR - resistenza all'igromicina, LacZ - β-galattosidasi, ZeoR - resistenza alla zeocina, T - TetR, proteina repressore tetraciclina, D2ir è un promotore a base di CMV con siti TwtO, LOV2 è dominio di rilevamento della tensione di ossigeno leggero, TIP è peptide inibitore del tet che inibisce la proteina TetR. Questa cifra è stata modificata da Guinn e Balázsi (2020)⁵⁵. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Programmazione sperimentale LPA. (A) Gli esperimenti possono essere programmati utilizzando gli strumenti elencati sul sito web del laboratorio ^Tabor47 con flessibilità per la programmazione LPA a stato stazionario, dinamica o ^avanzata31. Inoltre, i file elettronici possono essere salvati per un uso futuro per repliche tecniche o induzione sperimentale di linee cellulari alternative. (B) Dispositivo LPA con componenti principali visualizzati dall'alto e dal lato (C). (D) Immagini di lastre sigillate con lamina che risiedono su LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - diodo emettitore di luce. Elementi di questa figura sono stati modificati da Guinn (2019)¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Taratura dell'apparato a piastre luminose. (A) Immagine rappresentativa di LPA per LED impostati su 2000 g.s. basata sul software IRIS. (B) Immagine dal pannello (A) con sfondo sottratto e soglia utilizzata per binarizzare l'immagine per calcolare l'intensità dei pixel di ciascun LED. (C) Istogramma delle intensità dei pixel (determinate dall'analisi delle immagini MATLAB) di 96 LED (4 piastre LPA) impostate sullo stesso valore software IRIS (ad esempio, 2000 g.s.). La linea rossa rappresenta l'intensità media dei pixel del LED e cv nel pannello rappresenta il coefficiente di variazione per i 96 pozzi. (D) Mappa di calore che mostra le intensità LED dell'immagine LPA nel pannello (A) normalizzate al LED di massima intensità. (E) Mappa termica del valore di calibrazione determinata per l'immagine LPA nel pannello (A) per creare una produzione di uguale intensità per ciascun LED quando programmato per l'LPA. LPA - Light Plate Apparatus, LED - diodo emettitore di luce, CV - coefficiente di variazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Randomizzazione degli effetti di LPA e tossicità della luce. (A) Immagine rappresentativa di due configurazioni LED LPA programmabili impostate da 25 a 4000 g.s, basate sul software IRIS. È più probabile che la prima configurazione consenta l'attraversamento di errori sistematici come gli effetti di bordo del calore e della luce (ad esempio, la riga inferiore dell'LPA che interessa la ^2a riga più bassa). La seconda immagine randomizza la posizione delle intensità, riducendo così al minimo l'errore sistematico (bias) causato dagli effetti dei bordi. (B) Matrice che mostra la posizione di randomizzazione per le intensità luminose nell'LPA mostrato nel pannello (A), che può essere utilizzato per determinare i risultati dipendenti dall'intensità di un dato esperimento. (C) Dati di citometria a flusso per due diverse intensità luminose (1250 e 4000 g.s.) per 3 giorni di induzione ad illuminazione continua. Il cancello nero si basa su cellule non indotte. (D) Grafico a barre che mostra i dati della citometria a flusso come il pannello (C) ma per un'ampia gamma di intensità luminose. LPA - Light Plate Apparatus, FSC - forward scatter, SSC - side scatter, g.s. - valore di intensità luminosa misurato in scala di grigi. Le cellule ^LITer11 hanno avuto una diminuzione dose-responsiva della sopravvivenza cellulare che era statisticamente significativa utilizzando il test ANOVA a 1 coda con un valore p di 0,0022. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative al microscopio di linee cellulari optogenetiche ingegnerizzate. Le cellule sono state fotografate su un microscopio invertito con una fotocamera (14 bit) per acquisire il contrasto di fase e l'imaging a fluorescenza. Le cellule sono state esposte per 5 ms per il contrasto di fase (Pannello A, immagine rappresentativa del campo luminoso) e 50 ms per l'acquisizione GFP/FITC (Pannello B) al 100% di intensità della sorgente luminosa. Le celle possono essere fotografate in vari punti temporali a seconda dell'acquisizione dello stato stazionario desiderato o della risposta dinamica, portando a uno stato stazionario. Le cellule qui rappresentano una titolazione della durata dell'impulso a intensità fissa (1000 g.s.) che va da nessuna esposizione alla luce a 3 giorni di esposizione alla luce. L'unità g.s rappresenta un valore di intensità luminosa misurato in scala di grigi. Questa cifra è stata modificata da Guinn (2019)¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Citometria a flusso di linee cellulari optogenetiche ingegnerizzate. Le cellule sono state analizzate su un citometro a flusso BD LSRFortessa, con circa 10.000 cellule raccolte all'interno di un gate SSC-FSC (side scatter-forward scatter). Le celle sono state poi analizzate con il software FCS Express. Istogramma o grafici a dispersione potrebbero essere generati per quantificare l'espressione del gene di interesse (ad esempio, GFP). (A) Celle ingegnerizzate tracciate su assi SSC-FSC per il gating all'interno della linea nera. (B) Cellule LITer rappresentative indotte con durata variabile di impulsi luminosi a 1000 g.s. fino a 72 h di induzione, illustrando la dose-risposta dell'espressione genica. (C) Dati rappresentativi dose-risposta per la titolazione dell'intensità luminosa confrontando il circuito genico LITer (sistema basato su TIP) rispetto al sistema VVD o ^LightOn40, che è un sistema di regolazione positiva senza feedback. (D) Istogramma corrispondente al sistema VVD, che illustra una distribuzione più ampia (e quindi un rumore di espressione genica più elevato) rispetto al sistema LITer. CV è il coefficiente di variazione, una metrica per il rumore di espressione genica. FSC - forward scatter, SSC - side scatter, FITC - fluoresceina isotiocianato, g.s. - valore di intensità luminosa misurato in scala di grigi. Questa cifra è stata modificata da Guinn (2019)¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: PCR quantitativa in tempo reale di linee cellulari optogenetiche ingegnerizzate. Dati rappresentativi che mostrano che più livelli di espressione genica possono essere indotti e quantificati usando la luce come stimolo. L'unità Rq rappresenta la quantificazione relativa del cambiamento di piega dell'espressione rispetto al controllo. Le cellule ^LITer11 hanno avuto un aumento dose-responsivo dell'espressione dell'RNA che è stato statisticamente significativo utilizzando il test ANOVA a 1 coda con un valore p di 0,0352 e 0,0477 per i livelli di GFP e KRAS, rispettivamente. Questa cifra è stata modificata da Guinn (2019)¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immunofluorescenza di linee cellulari optogenetiche ingegnerizzate. Dati rappresentativi che mostrano stime a livello proteico basate sull'immunofluorescenza. (A) Livelli proteici di KRAS(G12V) e (B) livelli proteici di fosforilato-ERK, che il circuito genico LITer induce in base all'aumento delle quantità di luce direttamente e indirettamente, rispettivamente. I dati mostrati nelle barre sono valori medi, le barre di errore sono deviazione standard (n = 3). U.A. - unità arbitrarie, g.s. - valore di intensità luminosa misurato in scala di grigi. Le cellule ^LITer11 hanno avuto un aumento dose-responsivo dei livelli proteici che è stato statisticamente significativo utilizzando il test ANOVA a 1 coda con un valore p di 2,79E-04 e 0,016 per i livelli di KRAS e fosforilato-ERK, rispettivamente. Questa cifra è stata modificata da Guinn (2019)¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I lettori di questo articolo possono ottenere informazioni sui passaggi vitali per caratterizzare i circuiti genici optogenetici (così come altri sistemi di espressione genica), tra cui 1) progettazione, costruzione e convalida del circuito genico; 2) ingegneria cellulare per l'introduzione di circuiti genici in linee cellulari stabili (ad esempio, ricombinazione Flp-FRT); 3) induzione delle celle ingegnerizzate con una piattaforma light-based come l'LPA; 4) caratterizzazione iniziale di saggi di induzione della luce mediante microscopia a fluorescenza; e 5) caratterizzazione finale dell'espressione genica con una varietà di saggi, tra cui citometria a flusso, PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) o saggi di immunofluorescenza.

Inoltre, i metodi sopra descritti sono altamente modulari per essenzialmente qualsiasi architettura di circuiti genici che esprimono geni di interesse, con le principali potenziali modifiche del protocollo nella fase di costruzione del circuito e i saggi condotti. Nel caso della costruzione di circuiti genici, la flessibilità della clonazione molecolare consente a qualsiasi gene di interesse di essere scambiato o co-espresso con un marcatore di fluorescenza con piccole modifiche ai protocolli di progettazione o assemblaggio del primer. Inoltre, mentre le procedure qui descritte si concentrano principalmente su un progetto di circuito genico NF per un controllo preciso (a basso rumore) dell'espressione genica, altre architetture come la regolazione positiva o il feedback positivo (PF) possono essere implementate per ottenere diverse caratteristiche come il cambiamento ad alta piega o il rumore ad alta espressione genica, ^{rispettivamente56,57} . L'utilizzo di una varietà di architetture di circuiti genici (ad esempio, PF, NF, ecc.) può consentire ai ricercatori di esplorare diverse questioni biologiche come i ruoli che le grandezze del livello proteico e il rumore svolgono nella resistenza ai farmaci o nelle ^metastasi58. I protocolli qui elencati si concentrano anche su vari modi di quantificazione dell'espressione genica, ma qualsiasi numero di saggi funzionali (ad esempio, motilità cellulare, guarigione delle ferite, proliferazione, ecc.) può essere aggiunto dopo l'acquisizione al microscopio con poco o nessun effetto sui metodi precedenti. Ciò è particolarmente rilevante per gli studi su singole cellule in cui l'optogenetica può utilizzare l'induzione spaziotemporale per studiare comportamenti come la dinamica di espressione pulsatile59.

A complemento della modularità del metodo, la risoluzione dei problemi è un'altra caratteristica importante di ciascun protocollo principale. Per la costruzione di circuiti, le principali differenze risiedono nella progettazione appropriata del primer specifico del circuito, mentre i metodi successivi come l'assemblaggio e l'amplificazione del plasmide tramite crescita batterica sono più standardizzati e in genere includono le proprie estese procedure di risoluzione dei problemi. L'ingegneria cellulare può essere modificata con curve di titolazione del farmaco a seconda della linea cellulare utilizzata. Inoltre, se si utilizza una linea cellulare commerciale, è possibile ottenere guide alla risoluzione dei problemi direttamente dal produttore della linea cellulare. Inoltre, gli effetti di luce non intenzionali sono importanti da quantificare sulle linee cellulari ingegnerizzate. Ad esempio, a causa degli effetti fototossici della luce a 470 nm, è necessario creare una curva di intensità luminosa per indagare l'induzione di morte o danno in una popolazione. Una volta testata una varietà di valori di luce, gli utenti possono creare un gate FSC-SSC o utilizzare un metodo come la colorazione dello ioduro di propidio per quantificare le cellule morte / danneggiate e, quindi, servire come strumento per determinare intervalli di luce appropriati da utilizzare sperimentalmente.

Per la risoluzione dei problemi LPA, i LED possono produrre effetti di bordo di luce e diafonia termica con pozzi adiacenti. Ad esempio, i pozzi ad alta intensità possono causare una certa induzione nei pozzi adiacenti se c'è una tenuta impropria o un grande gradiente di calore / luce tra i pozzi. Questi effetti possono essere massimi se l'LPA è programmato in un ordine particolare (ad esempio, ascendente/discendente) di un parametro di luce. Per combattere questo, il software IRIS consente agli utenti di utilizzare una matrice di randomizzazione per randomizzare le intensità del pozzo e quindi ridurre l'errore sistematico. Per la risoluzione dei problemi relativi alla microscopia a fluorescenza, il tempo di esposizione, le impostazioni di guadagno (controllo della sensibilità della fotocamera) e l'intensità della sorgente luminosa sono i parametri principali che possono essere regolati. La regolazione di questi parametri può consentire una produzione ottimale dell'immagine e rapporti segnale-rumore ideali, oltre a evitare sovrasaturazione e fototossicità.

Per la risoluzione dei problemi della citometria a flusso, le tensioni del tubo del fotomoltiplicatore e il gating cellulare sono gli aspetti principali che possono essere regolati. La messa a punto di questi parametri può consentire confronti ideali tra condizioni sperimentali e campioni di controllo, una corretta acquisizione del segnale per segnali di fluorescenza deboli o forti ed esclusione di detriti cellulari o popolazioni cellulari indesiderate. Va notato che le tensioni della citometria a flusso sono idealmente mantenute costanti tra gli esperimenti per consentire confronti adeguati. Inoltre, per i sistemi optogenetici che richiedono più uscite di fluorescenza (ad esempio, FITC e PE), gli utenti dovranno essere consapevoli della compensazione della fluorescenza data la diafonia tra i fluorofori. In tali scenari, i controlli sono cruciali per determinare i segnali di fluorescenza corretti. I controlli che saranno necessari per gli utenti includono perline fluorescenti, cellule colorate con il marcatore di interesse o cellule che esprimono costitutivamente la proteina di fluorescenza che può essere utilizzata per creare una matrice di compensazione nel software di citometria a flusso di interesse. Inoltre, sia che si utilizzi un marcatore di fluorescenza o più, tutti gli utenti dovrebbero misurare regolarmente i segnali di fluorescenza di ciascun marcatore per le cellule non fluorescenti, che producono segnali di autofluorescenza / sfondo. La risoluzione dei problemi qRT-PCR include quantità variabili di cDNA e design della sonda, che sono spesso specifici del progetto. Infine, per la risoluzione dei problemi di immunofluorescenza, le concentrazioni di anticorpi sono la variabile più grande per la quantificazione del saggio, che richiede la determinazione ottimale della concentrazione.

Un aspetto della risoluzione dei problemi che è rilevante per la maggior parte dei metodi di cui sopra è l'effetto di isolamento dell'uso di una piastra sigillata con celle coperte di lamina. Questo metodo può impedire lo scambio di gas di anidride carbonica necessario per la corretta crescita di varie linee cellulari. Da precedenti esperienze sperimentali, questo non è stato un ostacolo significativo alla crescita cellulare per un esperimento di 3-5 giorni utilizzando le linee cellulari ingegnerizzate all'interno di questo manoscritto, ma può diventare importante per altre linee cellulari o durate sperimentali. Per affrontare questa preoccupazione, un adattamento implementato con le piastre sigillate include l'uso di mezzi indipendenti dall'anidride carbonica, che non ha influenzato la crescita delle cellule utilizzate in questo studio. Va notato per altri saggi o linee cellulari in cui il metabolismo, i livelli di pH e le densità cellulari sono importanti, possono essere necessari altri interventi come cambiare mezzi o nutrienti più frequentemente.

I limiti dei metodi qui delineati risiedono nel circuito genico utilizzato, nella precisione della tecnologia optogenetica e nell'interfaccia LPA con altre apparecchiature come i microscopi a fluorescenza. La tecnologia qui descritta è conveniente, veloce da costruire e facile da ^{convalidare46} per le popolazioni di cellule optogeneticamente ingegnerizzate. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni spaziali, come l'incapacità di controllare singole celle senza modifiche alla configurazione dell'induzione della luce, come l'utilizzo di dispositivi a specchio digitale (DMD), con benefici recentemente dimostrati nelle cellule ^viventi60,61. Inoltre, i metodi qui descritti sono limitati nel monitoraggio delle cellule vive durante la stimolazione optogenetica, consentendo solo l'acquisizione dei dati del punto finale dell'intero corso temporale sperimentale.

Nonostante questi limiti, i metodi optogenetici qui descritti sono complementari alla tecnologia esistente come le DMD, che hanno la flessibilità di controllare singole cellule in tempo reale ma sono limitate dal numero di campioni che si possono stimolare. Inoltre, i metodi di ingegneria della linea cellulare stabile discussi qui contrastano i metodi di biologia sintetica esistenti che spesso caratterizzano i sistemi genetici ingegnerizzati tramite trasfezioni transitorie. Gli approcci di trasfezione transitoria sono intrinsecamente più rumorosi a causa della maggiore variazione del numero di copie del circuito genico tra le cellule. Al contrario, i metodi qui presentati coinvolgono varianti di cellule monoclonali, ognuna contenente una copia del circuito genico. Linee cellulari stabili consentono di esplorare aspetti cellulari come la variazione dell'espressione genica, gli effetti a livello proteico sui paesaggi fenotipici e i metodi a singola cellula con maggiore precisione poiché vi è una maggiore sicurezza che ogni cellula sia identica alle sue vicine.

Il lavoro qui dimostra una piattaforma per la progettazione di qualsiasi circuito genico optogenetico genomicamente integrato di interesse, inducendo tali sistemi con strumenti sperimentali affidabili e caratterizzandoli con una varietà di espressione genica e saggi funzionali / fenotipici in modo standardizzato. I futuri miglioramenti di questi protocolli potrebbero includere l'integrazione di questi metodi con il tracciamento delle cellule vive utilizzando altre tecnologie optogenetiche come le DMD, che consentiranno il controllo spaziotemporale dell'espressione genica e delle applicazioni funzionali a livello di singola cellula. Tali progressi consentiranno l'utilizzo della luce per produrre il modello di espressione genica di interesse nelle singole cellule, stabilire dinamiche di trascrizione / traduzione, quantificare i livelli di proteine e studiare il loro ruolo in diversi processi biologici, tra cui migrazione cellulare, proliferazione, metastasi e differenziazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site