Diese Methode kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung mit pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (PSC-CMs) können sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (ES/iPS) hergestellt werden. Diese Zellen bieten vielversprechende Quellen für die Modellierung von Herzerkrankungen. Bei Kardiomyopathien ist die Sarkomer-Verkürzung eine der physiologischen Standardbewertungen, die bei erwachsenen Kardiomyozyten zur Untersuchung ihrer Krankheitsphänotypen verwendet werden. Die verfügbaren Methoden sind jedoch nicht geeignet, die Kontraktilität von PSC-CMs zu beurteilen, da diese Zellen unterentwickelte Sarkomere aufweisen, die unter Phasenkontrastmikroskopie unsichtbar sind. Um dieses Problem anzugehen und eine Sarkomerverkürzung mit PSC-CMs durchzuführen, wurden fluoreszierend markierte Sarkomerproteine und fluoreszierende Live-Bildgebung verwendet. Dünne Z-Linien und eine M-Linie befinden sich an beiden Enden bzw. in der Mitte eines Sarkomers. Z-Linienproteine - α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) und Aktin-assoziiertes LIM-Protein (PDLIM3) - und ein M-Linienprotein - Myomesin-2 (Myom2) - wurden mit fluoreszierenden Proteinen markiert. Diese markierten Proteine können aus endogenen Allelen als Knock-Ins oder aus Adeno-assoziierten Viren (AAVs) exprimiert werden. Hier stellen wir die Methoden vor, um maus- und humane pluripotente Stammzellen zu Kardiomyozyten zu differenzieren, AAVs herzustellen und Live-Imaging durchzuführen und zu analysieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempeln für eine gemusterte Kultur von PSC-CMs, die die Analyse der Sarkomerverkürzung mit fluoreszierend markierten Proteinen erleichtert. Zur Beurteilung der Sarkomerverkürzung wurden Zeitrafferbilder der schlagenden Zellen mit einer hohen Bildrate (50-100 Bilder pro Sekunde) unter elektrischer Stimulation (0,5-1 Hz) aufgenommen. Um die Sarkomerlänge im Verlauf der Zellkontraktion zu analysieren, wurden die aufgenommenen Zeitrafferbilder SarcOptiM, einem Plug-in für ImageJ/Fiji, unterzogen. Unsere Strategie bietet eine einfache Plattform für die Untersuchung von Phänotypen von Herzerkrankungen in PSC-CMs.
Einleitung
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und Kardiomyopathie stellt die dritte Ursache für kardiale Todesfälledar 2. Kardiomyopathie ist eine kollektive Gruppe von Krankheiten, die die Herzmuskulatur betreffen. Die jüngsten Entwicklungen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) und die gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen in Richtung Kardiomyozyten (PSC-CMs) haben die Tür für die Untersuchung von Kardiomyozyten mit Patientengenom als In-vitro-Modell der Kardiomyopathie geöffnet. Diese Zellen können verwendet werden, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen zu verstehe....
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Protokoll
1. Differenzierung pluripotenter Stammzellen der Maus
- Pflege von MAUS-ES-Zellen
- Erhaltungsmedium: Mischen Sie 50 ml fetales Rinderserum (FBS), 5 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5 ml nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol mit 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Ergänzung Leukämie-Inhibitor-Faktor (LIF), CHIR-99021 und PD0325901 bei einer Endkonzentration von 1000 U / ml, 1 μM bzw. 3 μM. Sterilisieren Sie das Medium durch einen 0,22 μm Filter.
- FBS-Medium: Mischen Sie 55 ml FBS, 5,5 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5,5 ml Natriumpyruvat und 5,5 ml NEAA bis 500 ml Dulbeccos Modified Eagle ....
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Ergebnisse
Messung der Sarkomerverkürzung mit Knock-in-PSC-CMs-Reporterlinien. Sarcomere-markierte PSC-CMs wurden verwendet, um die Sarkomerverkürzung zu messen. Die Linien exprimieren Myom2-RFP und ACTN2-mCherry aus endogenen Loci. TagRFP wurde in Myom2eingefügt und kodierte M-Proteine, die sich in der M-Linie lokalisieren, während mCherry in ACTN2eingelegt wurde, das α-Actinin kodiert, das auf die Z-Linie18,25.......
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Diskussion
PSC-CMs haben ein großes Potenzial, als In-vitro-Plattform zur Modellierung von Herzerkrankungen und zur Prüfung der Wirkung von Medikamenten genutzt zu werden. Dennoch muss zunächst eine genaue, einheitliche Methode zur Bewertung der Funktionen von PSC-CMs etabliert werden. Die meisten Funktionstests arbeiten mit PSC-CMs, z. B. Elektrophysiologie, Calciumtransient und Stoffwechsel26,und eine der ersten patientenbasierten PSC-CM-Studien war über das Long-QT-Syndrom27
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Offenlegungen
H.U. hat ein Patent im Zusammenhang mit diesem Manuskript angemeldet.
Danksagungen
Wir möchten allen Labormitgliedern in der Abteilung für Regenerative Medizin an der Jichi Medical University für die hilfreiche Diskussion und technische Unterstützung danken. Diese Studie wurde durch die Zuschüsse der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 und JP20bm0804018), die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219) und der Japanese Circulation Society (der Zuschuss für Grundlagenforschung) an H.U.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC) Polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm-Bildgebungsschale mit Polymer-Deckglas (µ-Schale 35 mm, hoch) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (Vektoren; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vektor) | Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | Wir fügten eine IRES-Puromycin-resistente Kassette auf 3' UTR des TNNT2-Locus und mCherry um das Stoppcodon von ACTN2 in der 610B1 hiPSC-Linie ein, nach einer Methode, die an anderer Stelle beschrieben wurde (Anzai, Methods Mol Biol, im Druck) | |
| B-27 Supplement (50X), serumfreies | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus Insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 Supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/&Mikro; L) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochlorid | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Mensch, rekombinant, | R & D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt-Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD-Zeichnungssoftware, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Zentrifugal-Ultrafiltrationseinheit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromätzmittel | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chrommaske beschichtet mit AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Fällungsträger (20 mg/ml Glykogen, 3 M Natriumacetat (pH 5,2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) - hoher Glukosegehalt | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) - hohe Glukose, ohne Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99,5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fötales Rinderserum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Mensch, rekombinant, | R& D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basisch), human, rekombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatine aus Schweinehautpulver | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM Kulturplatten | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Schinken& rsquo; s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-Alanin-L-Glutamin (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbinsäure Natriumsalz | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 Fragment ( LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask Aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskenloses Lithographiewerkzeug | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 &; Mikro; m, PVDF (0,45-&Mikro; m filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Entwickelt in unserer vorherigen Arbeit (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digitale CMOS-Kamera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petrischale | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) | Nippon-Gen | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS)-Elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| Polyethylenimin MAX (MW. 40.000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positiver Fotolackentwickler | Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochlorid | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Rekombinante Mensch/Maus/Ratte Aktivin A Protein | R& D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Rekombinante Trypsin-ähnliche Protease (rTrypsin; Thermo | Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Siliziumwafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Natriumpyruvat (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-Coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Konfokale Spinning-Mikroskopie | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Maus, rekombinant, Lösung (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 Entwickler | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 Entwickler | |
| Tris-EDTA | Nippon Gen | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Mensch, rekombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referenzen
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
