4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

Zusammenfassung

Die visuelle Systemfunktion erfordert die Etablierung präziser Gewebe- und Organstrukturen. Im Wirbeltierauge sind strukturelle Defekte eine häufige Ursache für Sehstörungen, aber die Mechanismen der Augenmorphogenese sind noch wenig verstanden. Die Grundorganisation des embryonalen Auges bleibt bei allen Wirbeltieren erhalten, so dass die Live-Bildgebung von Zebrafischembryonen zu einem leistungsstarken Ansatz geworden ist, um die Augenentwicklung unter normalen und pathologischen Bedingungen in Echtzeit direkt zu beobachten. Dynamische Zellprozesse wie Bewegungen, Morphologien, Interaktionen, Teilung und Tod können im Embryo visualisiert werden. Wir haben Methoden zur einheitlichen Markierung subzellulärer Strukturen und zur konfokalen Zeitraffermikroskopie der frühen Augenentwicklung bei Zebrafischen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Erzeugung von gekappter mRNA für die Injektion in den 1-Zell-Zebrafischembryo, zur Montage von Embryonen im optischen Vesikelstadium (~ 12 Stunden nach der Befruchtung, hpf) und zur Durchführung einer mehrdimensionalen Zeitrafferbildgebung der optischen Cup-Morphogenese auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, so dass mehrere Datensätze nacheinander in derselben Bildgebungssitzung erfasst werden. Ein solcher Ansatz liefert Daten, die für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden können, einschließlich Zellverfolgung, Volumenmessungen, dreidimensionalem (3D) Rendering und Visualisierung. Unsere Ansätze ermöglichen es uns, die zellulären und molekularen Mechanismen zu lokalisieren, die die Entwicklung von optischen Bechern vorantreiben, sowohl unter Wildtyp- als auch unter genetischen Mutantenbedingungen. Diese Methoden können direkt von anderen Gruppen angewendet oder angepasst werden, um viele zusätzliche Aspekte der Zebrafischaugenentwicklung zu visualisieren.

Einleitung

Die Entwicklung des Wirbeltierauges beginnt mit der Entstehung oder Evagination der optischen Vesikel aus dem prospektiven Neuroepithel des Gehirns. Die optischen Vesikel durchlaufen dann eine Reihe von Gewebeformänderungen, die sich ausdereckn und dann invaginieren, um den optischen Becher zu erzeugen. Im optischen Becher umhüllen die neurale Netzhaut und das retinale Pigmentepithel, die beide vom Neuroepithel abgeleitet sind, die entstehende Linse, die vom Oberflächenektoderm abgeleitet ist. Der gesamte Prozess erfordert eine komplexe Reihe von Zell- und Gewebebewegungen und molekularen Signalen, die zwischen Neuroepithel-, Ektoderm- und mesenchymalen Zellpopulationen koordiniert werden. Diese ersten Ereignisse legen die Grundstruktur des Auges fest, und spätere Schritte der Augenentwicklung, einschließlich iris- und hornhautbildung, sind Ausarbeitungen zur frühen Organisation. Störungen der frühen Augenentwicklung und Morphogenese liegen zahlreichen Sehstörungen beim Menschen zugrunde, einschließlich Anophthalmie, Mikrophthalmie und Kolobom. Die Entschlüsselung der zellulären und molekularen Mechanismen, die die Morphogenese des optischen Bechers steuern, ist entscheidend für das weitere Verständnis der visuellen Systementwicklung und der pathologischen Bedingungen, die sich ergeben, wenn diese Prozesse schief gehen.

Unser Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieraugen und der Morphogenese entstand aus einer enormen Menge an Arbeit, die von klassischen histologischen Studien bis hin zu embryologischen und genetischen Ansätzen in einer Vielzahl von Modellorganismen wie Maus, Küken, Frosch und^{Fischen reicht 1,2,3,4,5}. Während diese Arbeit molekulare Mechanismen etablierte, die die frühe Augenentwicklung regulieren, gibt es historisch ein schlechtes Verständnis der Morphogenese des Auges: die Entstehung seiner 3D-Struktur. Der Großteil dieser Ergebnisse stammt aus der Bildgebung von abschnittierten Embryonen zu diskreten Zeitpunkten. Während dies ausreicht, um einen Überblick über die Gewebemorphologie in 2 Dimensionen zu geben, ist die Morphogenese ein dynamischer 3D-Prozess. Um festzustellen, wie sich die Form des Gewebes im Laufe der Zeit in 3 Dimensionen verändert, wie sich einzelne Zellen verhalten und wie diese Verhaltensweisen zu Veränderungen der 3D-Gewebeform beitragen, sind verschiedene Ansätze erforderlich.

Eine Lösung, um diese erhebliche Wissenslücke zu schließen, ist die Live-Bildgebung, die eine dynamische Beobachtung von Zellen und Geweben in Echtzeit ermöglicht, während das Organ Gestalt annimmt. Leider ist dies in vielen Modellorganismen aufgrund der Einschränkungen der Embryonalentwicklung nicht ohne weiteres möglich. Zum Beispiel sind Maus- und Kükenembryonen (die sich in utero oder in einer Eierschale entwickeln) nicht leicht zugänglich, und viele lebende Embryonen sind optisch nicht transparent, was zu einer signifikanten Lichtstreuung führt und die Tiefe, in der Bilder aufgenommen werden können, einschränkt. Zebrafische, mit äußerer Entwicklung und transparenten Embryonen, bieten eine einzigartige Gelegenheit, Live-Bildgebung der Augenmorphogenese^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}durchzuführen . Reichlich transgene und mutierte Linien sind ebenfalls verfügbar, sowie Werkzeuge zur Erzeugung neuer Transgene und Mutanten^{20,21,22,23,24}. Darüber hinaus tritt die optische Bechermorphogenese bei Zebrafischen über einen Zeitraum von 12 Stunden (12-24 Stunden nach der Befruchtung, hpf) schnell auf, was die Bildgebung des gesamten Prozesses ermöglicht.

Live-Imaging-Bemühungen wurden durch die Erweiterung und Optimierung der Familie der fluoreszierenden Proteine, die eine genetisch kodierte vitale Markierung subzellulärer Strukturen ermöglichen, sowie verbesserungen und innovationen bei Mikroskopiemethoden beschleunigt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die konfokale Laserscanning-Mikroskopie anstelle anderer aktueller Ansätze zur Bildgebung der Zebrafischembrogenese, einschließlich der konfokalen Spinnscheibenmikroskopie, der selektiven Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM und ihre Varianten) und anderer spezialisierterer Mikroskopiemethoden. Für das sich entwickelnde Zebrafischauge fanden wir heraus, dass die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe nicht ausreichte, um tiefer im Gewebe zu bilden. Obwohl SPIM eine extrem schnelle Bildgebungszeit aufweist und immer weiter verbreitet wird, bleibt der Umgang mit den großen Datensätzen für die Visualisierung und Analyse eine Herausforderung. Im Gegensatz dazu ist die konfokale Laserscanning-Mikroskopie leicht zugänglich, insbesondere für Personen, die keine Erfahrung in der Montage optischer Hardware haben. Wir hoffen, dass die breite Verfügbarkeit der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie unser Protokoll für viele Labore nützlich machen wird.

Hier beschreiben wir unsere Methode zur Erfassung von 4D-Datensätzen der optischen Cup-Morphogenese, unter Verwendung der In-toto-Markierung des Embryos für Membranen und Chromatin sowie eines laserscannenden konfokalen Mikroskops zur Bildaufnahme (schematisiert in Abbildung 1). Die hier verwendeten fluoreszierenden Proteine (EGFP-CAAX und H2A. F/Z-mCherry) wurden ausgewählt, um gewebemarkierungen mit Einzelzellauflösung bereitzustellen. Wir verwenden Datensätze, die mit diesem Protokoll generiert werden, für eine Vielzahl von Bildanalyse- und Visualisierungsfunktionen. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, wenn andere subzelluläre Strukturen gewünscht werden. Zur Visualisierung der Zellform wurde die Plasmamembranmarkierung ausgewählt: Wir verwenden EGFP-CAAX, bei dem die letzten 21 Aminosäuren von H-ras, die als Prenylierungssignalsequenz dienen, mit dem C-Terminus von EGFP¹³verschmolzen sind. Andere plasmamembrangerichtete fluoreszierende Proteine (z. B. Transmembranfusion oder myristoylierte) funktionieren wahrscheinlich genauso gut. Um Kerne zu markieren, haben wir H2A ausgewählt. F/Z-mCherry, bei dem mCherry mit einem Histonprotein¹³verschmolzen ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellteilung einschließlich der mitotischen Spindelorientierung leicht visualisiert werden kann.

Bei jedem Live-Imaging-Ansatz müssen Kompromisse zwischen der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit und der Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses, der axialen Auflösung und der Probenkonservierung berücksichtigt werden. Wir haben unsere Methoden optimiert, um die Bildqualität und die Anzahl der Embryonen, die in einem einzigen Durchlauf abgebildet werden können, zu maximieren. Oft besteht das Ziel darin, die optische Cup-Morphogenese in einem homozygoten mutierten Embryo abbilden, der zu Beginn der optischen Cup-Morphogenese und der Nachkommen einer heterozygoten Kreuzung phänotypisch nicht vom Wildtyp zu unterscheiden ist (25% der Embryonen sind der gewünschte Genotyp). Durch die Optimierung und anschließende Multiplexing der Bildaufnahme besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, einen Datensatz eines homozygoten mutierten Embryos zu erfassen.

Die zeitliche Auflösung oder die Art und Weise, wie häufig Volumendaten (Z-Stacks) erfasst werden, ist ein Schlüsselaspekt der Zeitrafferbildgebung. Je nach Verwendungszweck solcher Datensätze gibt es unterschiedliche Anforderungen an die Geschwindigkeit. Ursprünglich wurde dieses Protokoll für die manuelle 4D-Zellverfolgung entwickelt. Die Verfolgung einzelner Zellen innerhalb eines gleichmäßig markierten Gewebes erfordert eine ausreichend hohe zeitliche Auflösung, um die Gewissheit zu schaffen, dass eine Einzelne Zelle im Laufe der Zeit kontinuierlich verfolgt wird. Wir fanden heraus, dass Z-Stapel der Zebrafisch-Optikbechermorphogenese mindestens alle 3,1 minuten über 12 h erworben werden müssen; hier haben wir unsere Erfassung an einem laserscannenden konfokalen Mikroskop so optimiert, dass wir alle 2,5 min Z-Stacks von 4-5 Embryonen erfassen können.

Die Festlegung der Z-Schritt-Größe war ein entscheidender Schritt in der Protokolloptimierung: Für 3D-Rendering und Visualisierung sind isotrope Daten ideal, bei denen die Z-Schritt-Größe gleich der XY-Pixeldimension ist. In der Realität ist es extrem schwierig, solche Zeitrafferdaten mit Live-Proben zu erfassen, da die Bildgebungszeit und das Photobleaching einschränkungen sind. Daher ist die Bestimmung der angemessenen Z-Schrittgröße wichtig für die Rendering- und Visualisierungsanforderungen des Experiments und insbesondere für das X:Y:Z-Voxelverhältnis, das benötigt wird, um die axiale Information zu maximieren und gleichzeitig die Geschwindigkeit beizubehalten und Photobleaching zu verhindern. Für dieses Protokoll wurde ein Voxelverhältnis von 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-Schrittgröße mit einem 40-fach langen Wasserimmersionsobjektiv mit arbeitsabstand) festgelegt. Bei einer Z-Tiefe von 130-140 μm ergeben sich Volumendaten mit geeigneter zeitlicher Auflösung und wenig Photobleaching.

Wie oben besprochen, ist dieses Protokoll spezifisch für die 4D-Bildgebung der Zebrafisch-Optikbechermorphogenese, bei der Embryonen in Toto verwendet werden, die für Plasmamembran und Chromatin markiert sind, und ein laserscannendes konfokales Mikroskop. Das folgende Protokoll kann leicht für eine Vielzahl von Experimenten und Bedürfnissen angepasst werden. Erstens kann in Bezug auf subzelluläre Strukturen jede Struktur abgebildet werden, für die ein lebender Zellmarker existiert. Obwohl der Fokus hier ausschließlich auf der Morphogenese des optischen Bechers liegt, kann die Zeitrafferbildgebung für andere Stadien der Augenentwicklung angepasst werden, z. B. Neurogenese^25,26,^{27,28,29,30,31,32,33}. Für die spätere Entwicklung der Bildgebung muss möglicherweise die Immobilisierung des Embryos (da die spontane Muskelaktivität bei etwa 24 PSF beginnt), die Pigmentierung (die bei etwa 24 PSf zu entstehen beginnt), die Gewebegröße (das Auge wächst während der Neurogenese signifikant an Volumen) und die Bildgebungsgeschwindigkeit (die je nach Geschwindigkeit des interessierenden Prozesses angepasst werden sollte) in Betracht gezogen werden. All diese Überlegungen können leicht verwaltet werden. Das Protokoll ist sehr flexibel; Zusätzlich zu den Details des spezifischen Protokolls gibt es hier allgemeine Prinzipien, die denjenigen helfen, die sich für Live-Bildgebung interessieren, andere Aspekte der Augenentwicklung.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden mit Zebrafischen werden unter Dr. Kristen Kwans Tierprotokoll "Cellular and Molecular Mechanisms of Visual System Development in Zebrafish" behandelt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt.

1. Capped RNA Synthese

1. Generieren Sie die DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription.
   1. Linearisieren Sie die DNA-Vorlage, indem Sie 10 μg DNA in 100 μL Volumen des Reaktionsgemisches verdauen. Eine typische Reaktion wird wie folgt zusammengestellt: 10 μg DNA mit 3 μL Enzym und 10 μL Puffer verdauen, das Reaktionsvolumen mit Wasser auf 100 μL bringen.
      HINWEIS: Eine typische Vorlage für Digest ist ein pCS2-Vektor, z. B. pCS2-EGFP-CAAX oder pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry für die hier beschriebene Membran- und Chromatin-Markierung. In diesem Fall werden die Plasmid-DNAs jeweils mit dem Enzym NotI verdaut. Benutzer sollten vorsichtig mit Sternenaktivität sein; in diesem Fall wird ein High-Fidelity-Enzym empfohlen und ist im Handel erhältlich.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C über Nacht, um sicherzustellen, dass die DNA bis zum Abschluss verdaut wird.
   3. Bereinigen Sie den Restriktions-Digest mit einem PCR-Reinigungskit nach dem Protokoll des Herstellers. Eluiert die DNA mit 30 μL ddH₂O. Lagern Sie die linearisierte DNA bei -20 °C und verwenden Sie sie nach Bedarf.
      HINWEIS: Die Menge der verdauten DNA und das Elutionsvolumen ergeben etwa 0,3 μg / μL; Dies reicht für ~5 Runden In-vitro-Transkription, wobei jede Runde ~2 μg DNA als Vorlage verwendet.
2. In vitro transkribieren CAPPED RNA mit einem In-vitro-Transkriptionskit. Verwenden Sie für pCS2-Vorlagen (wie hier beschrieben) ein SP6-Kit.
   1. Stellen Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktion wie folgt zusammen: Verdauen Sie 2 μg DNA-Vorlage oder bis zu 6 μL mit 2 μL 10x Reaktionspuffer, 10 μL 2x Ribonukleotid-Mix und 2 μL 10x Enzym-Mix.
   2. Bei 37 °C für 2-4 h oder länger inkubieren (längere Zeiten führen zu einem höheren Ertrag). Auf Wunsch kann 1 μL Enzyme Mix nach der Hälfte der Inkubationszeit ergänzt werden.
   3. Verdauen Sie die DNA-Vorlage, indem Sie 1 μL RNase-freie DNase hinzufügen und 15 minuten bei 37 °C inkubieren.
3. Reinigen Sie die capped RNA mit einem RNA-Reinigungskit nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle). Elute mit 100 μL RNase-freiem_H2O.
   HINWEIS: Die Zugabe von β-Mercaptoethanol ist für diese Anwendung nicht erforderlich. Während die in diesem Protokoll beschriebene Methode einfach ist, können alternative Reagenzien auch zur Reinigung von RNA verwendet werden.
4. Die RNA ausfälschen.
   1. 10 μL 3 M RNasefreies NaOAc und 2,5 Volumina (~275 μL) eiskaltes RNasefreies 100% EtOH werden der eluierten RNA zugefügigt.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion bei -20 °C für 15-30 min. 15 Minuten bei hoher Geschwindigkeit bei 4 °C drehen, um die RNA zu pelletieren.
      HINWEIS: Das Pellet sollte an der Wand des Rohres sichtbar sein. Es ist hilfreich zu beachten, wie das Rohr in der Zentrifuge in diesem Schritt ausgerichtet ist, um vorherzusagen, wo sich das Pellet am Ende des Spins befinden soll.
   3. Entfernen Sie EtOH vorsichtig mit einer Spritze und achten Sie darauf, dass das Pellet nicht erhitzt, übertrocknet oder entfernt wird. Das Pellet wird in 20 μL RNase-freiem_{H2O resuspendiert.}
   4. Überprüfen Sie die RNA, um sicherzustellen, dass die Synthese erfolgreich ist. Verwenden Sie 1 μL, um die Konzentration auf einem Spektralphotometer zu bestimmen, und führen Sie 0,5 μL auf einem 1% igen Agarosegel aus, um nach einem oder zwei diskreten Bändern zu suchen, anstatt nach einem Niedermolekularabstrich. Die Ausbeute der In-vitro-Transkriptionsreaktion sollte ~1 μg/μL beträgen.
   5. Aliquot und speichern RNA bei -20 °C oder -80 °C. Die RNA wird erst unmittelbar vor der Injektion verdünnt.

2. Mikroinjektion von 1-Zell-Zebrafischembryonen

HINWEIS: Injizieren Sie 200-300 pg pro RNA, um eine ubiquitäre Expression von Chromatin und Zellmembranen während der gesamten optischen Cup-Morphogenese zu erhalten. 5-10 μL der RNA-Verdünnung vorbereiten und 2,5-5 μL/Nadel laden; Planen Sie für den Fall, dass die Nadel bricht, extra ein.

1. Vorbereitungen für Injektionen im Voraus.
   1. Bereiten Sie eine Spritzgussformform vor, um die Ausrichtung und Orientierung von 1-Zell-Embryonen für die Mikroinjektion zu erleichtern. 2% Agarose in E3 (Standard-Embryomedium) schmelzen und in eine Petrischale gießen. Schwimmen Sie das Spritzgusswerkzeug (siehe Materialtabelle)vorsichtig auf die Oberseite der heißen Agarose, um den Abdruck der Tröge in der Agarose zu erzeugen, wenn sie erstarrt. Sobald die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Spritzgusswerkzeug.
      HINWEIS: Spritzgussschalen können mehrere Monate lang verwendet werden; in E3 abdecken und bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
   2. Ziehen Sie Mikroinjektionsnadeln. Ziehen Sie Glaskapillaren zu einer langen Verjüngung, um Mikroinjektionsnadeln mit einer Nadelziehmaschine herzustellen. Programmieren Sie die Maschine spezifisch für die Art der verwendeten Kapillaren. Für 1,0 x 0,78 mm Borosilikatkapillaren verwenden Sie folgendes Programm: Wärme = 546 °C, Zug = 130, Geschwindigkeit = 70, Zeit = 90 (Abbildung 2F). Lagern Sie die Nadeln in einer Petrischale und befestigen Sie sie mit Modelliermasse.
      HINWEIS: Das Zugrezept variiert je nach Maschine und Filament, und neue Filamente sollten immer kalibriert werden. Jede Zugrunde erzeugt zwei Nadeln (Abbildung 2G); Tun Sie dies mehrmals, um genügend Nadeln im Falle von versehentlichen Brüchen und zukünftigen Experimenten zu produzieren.
   3. Verdünnen Sie die verschlossene RNA zur Injektion. Verdünnen Sie sowohl EGFP-CAAX als auch H2A-mCherry RNAs auf 200-300 ng/μL Konzentration mit RNase-freiem_H2O und 1 μL Phenolrot in einem Gesamtvolumen von 5 μL (Endkonzentration von Phenolrot beträgt 0,1%). Streichen Sie die Mischung und drehen Sie sie kurz herunter, um das Gesamtvolumen zu sammeln. Bewahren Sie die verdünnte RNA vor der Injektion auf Eis auf.
2. Injektion von 1-Zell-Embryonen
   1. Sobald die Fische zu brüten beginnen, lassen Sie ~ 15-20 Minuten ein, um sicherzustellen, dass die Eier befruchtet werden. Während dieser Zeit laden Sie die Nadel mit 2,5-5 μL der RNA-Verdünnung mit einer P10- und P10-Mikroladerspitze zurück.
   2. Kalibrieren Sie die Nadel mit einem Okularabsehen (ein Mikrometer-Kalibrierungsschieber ist ebenfalls ausreichend), um das Volumen des Tröpfchens (Volumen einer Kugel = (4/3) * pi * Radius ^3) zu messen. Stellen Sie die Injektionszeit und den Druck so ein, dass das Injektionsvolumen 1 nL beträgt (Abbildung 2I).
   3. Mit einer Walzen-/Transferpipette Eier vorsichtig in das Spritzgießwerkzeug laden (Abbildung 2J). Wenn hilfreich, verwenden Sie eine Zette, um Embryonen so zu rollen, dass die einzelne Zelle entweder vor oder während der Injektion sichtbar ist. Es ist die Präferenz des Benutzers, einen Mikromanipulator zu verwenden.
   4. Injizieren Sie Embryonen im 1-Zell-Stadium und zielen Sie auf die Zelle und nicht auf das Eigelb ab (Abbildung 2M). Dadurch wird eine einheitliche Kennzeichnung des sich entwickelnden Embryos sichergestellt.
3. Heben Sie die Embryonen auf das gewünschte Stadium (vor 12 HPF, gemäß Standardinszenierung³⁴). Injizierte Embryonen haben eine verzögerte Entwicklung, also heben Sie sie auf eine etwas höhere Temperatur (29,0-29,5 ° C), um Zeit aufzubringen. Überprüfen Sie am Nachmittag die Embryonen und entfernen Sie die toten Embryonen, um die Gesundheit der Kupplung zu erhalten.

3. Montage von Zebrafischembryonen im optischen Vesikelstadium für die Zeitraffer-Bildgebung

1. Bereiten Sie vor der Montage 1,6% schmelzarme Agarose in E3 vor. Wenn Sie mehrere bildgebende Experimente planen, bereiten Sie ~ 20 ml schmelzarme Agarose vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Schmelzen Sie diese am Tag der Embryomontage, um ein frisches Aliquot (1-5 ml) in einem Rohr zu erzeugen, das vor der Montage in einen 42 ° C-Wärmeblock gelegt werden kann.
2. Screenen Sie Embryonen für eine erfolgreiche Injektion und die Gesamthelligkeit der Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop vor der Montage. Eine ideale Probe hat eine starke EGFP- und mCherry-Fluoreszenz und befindet sich im richtigen Entwicklungsstadium (Abbildung 3B - B'').
   1. Screenen Sie Embryonen mit einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Sie Embryonen, die sowohl EGFP- als auch mCherry-Fluoreszenz stark exprimieren, für die Montage aus.
   2. Wählen Sie Embryonen aus, die 11 HPF sind. Zählen Sie somites, um die Embryonen richtig zu^{inszenieren 34}; bei 11 HPF sollte es 3 Somites geben, und bei 12 HPf gibt es 6 Somites.
      HINWEIS: Durch die Montage von Embryonen vor 12 hpf (bei 11 hpf) werden die Proben zu Beginn des Zeitraffers angemessen bei 12 hpf inszeniert.
3. Dekahorionieren Sie Embryonen vor dem Montieren. Tun Sie dies entweder manuell mit einer feinen Zette oder chemisch mit Pronase (2 mg / ml). Bei so jungen Embryonen ist es wichtig, dass die Dehorionierung in einer mit Agar beschichteten Schale durchgeführt wird und dass embryonen nicht mit der Luft-Wasser-Schnittstelle in Kontakt treten.
4. Saugen Sie mit einer Glasrollenpipette einen Embryo auf und werfen Sie so viel E3 wie möglich aus, so dass der Embryo an der Spitze der Pasteur-Pipette aus Glas sitzt.
5. Lassen Sie den Embryo aus dem Wärmeblock in die Agaroseröhre fallen. Lassen Sie es für einige Sekunden in die Agarose sinken, saugen Sie dann zuerst etwas Agarose und dann den Embryo auf, um sicherzustellen, dass der Embryo an der Spitze der Pipette bleibt (Abbildung 3C - C').
6. Stellen Sie eine Glasbodenschale für die Bildgebung unter ein Sezierfernrohr. Werfen Sie den Embryo und die Agarose in ein Agarose-Tröpfchen in der Glasbodenschale aus. Verwenden Sie eine Zette, um sich sehr schnell zu orientieren, so dass der Embryo dorsal ist (Oberseite des Kopfes auf dem Glasboden). Lassen Sie das Agarose-Tröpfchen aushärten (Abbildung 3D - D'). Dieser Schritt muss schnell, aber sorgfältig durchgeführt werden, da Embryonen in diesem Stadium zerbrechlich sind. Beschädigte Embryonen überleben den Zeitraffer-Bildgebungsprozess nicht.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Embryonen für dieses Experiment konsequent auszurichten. Bei der Durchführung des Zeitraffers müssen die Embryonen in das zugewiesene Sichtfeld passen und gleichzeitig zusätzlichen Platz für das Wachstum des optischen Vesikels beibehalten. Eine optimale Orientierung besteht darin, die vordere hintere Achse aller Embryonen "vertikal" oder entlang 12 und 6 Uhr auf einem Zifferblatt auszurichten (Abbildung 3G).
7. Montieren Sie zwischen 10-12 Embryonen, was mehr als doppelt so viele sind, die abgebildet werden, so dass die besten Proben ausgewählt werden können, sobald sie auf dem Konfokalen ausgewertet wurden (Abbildung 3E - E'). Die Proben werden auf Alter, Gleichmäßigkeit der fluoreszierenden Markierung und Präzision der Montageorientierung untersucht.
8. Nach der Montage der Embryonen pipetten Sie mehr Agarose, um den Boden der Schale vollständig zu bedecken, wodurch alle separaten Agarosetröpfchen in einer einzigen großen Agarosescheibe eingeschlossen werden (Abbildung 3F - F'). Eine ausreichende Menge an Agarose sorgt dafür, dass sich die einzelnen Embryotröpfchen oder die gesamte Bandscheibe nicht vom Boden der Schale anheben und außer Sichtweite schweben.
9. Nach dem Härten überlagern Sie die Agarose mit E3, um die Proben für die Dauer des Zeitraffer-Bildgebungsexperiments hydratisiert zu halten (ein Problem, abhängig von der Feuchtigkeit des Gebäudes und in der Umgebung).
   HINWEIS: Tricain ist für diese spezifischen Zeitraffer-Bildgebungsexperimente nicht erforderlich, da diese Embryonen ausreichend jung sind; Wenn dies jedoch gewünscht wird und wenn mit älteren Embryonenstadien gearbeitet wird, kann Tricain in die Agarose selbst gegeben und in den Medien überlagert werden.
10. Zeichnen Sie auf Papier eine Karte der Embryonen, um sie während der Zeitrafferaufstellung leicht nachschlagen zu können. Dies ist entscheidend, um die Position später mit dem Genotyp jeder Probe in Verbindung zu bringen.

4. Konfokale Zeitraffer mit mehreren Positionen mit einem laserscanning konfokalen Mikroskop

HINWEIS: Dieses Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll wurde für die Verwendung mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop entwickelt, das mit einer Software des Herstellers ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Dieses System ist mit einem Piezo-Z-Stage-Gerät ausgestattet, das eine schnelle Erfassung von Z-Stacks ermöglicht. Die in diesem Protokoll verwendeten Laserlinien sind ein 488-nm-Argon-Ionen-Laser und ein DPSS-561-nm-Laser. Der 561-nm-Laser eignet sich gut für die Abbildung des mCherry-Fluorophors: Er ist nahe genug am Höhepunkt der mCherry-Anregung (587 nm) und gut versorgt.

1. Richten Sie das Konfokal ein.
   1. Schalten Sie das Konfokal ein und melden Sie sich am Desktop-Computer an.
   2. Installieren Sie den Piezo-Z-Stufeneinsatz (Abbildung 4B), und starten Sie dann die Erfassungssoftware.
   3. Schalten Sie in der Software im Erfassungsmodus die Laser 488 und 561 über das Dropdown-Menü ein (Abbildung 4F). Das Aufwärmen der Laser dauert mehrere Minuten, daher wird dieser Schritt frühzeitig durchgeführt, um Zeit zu sparen.
      HINWEIS: Die Erfassungsparameter lauten wie folgt: Aktivieren Sie die Felder Z-Stack, Zeitreiheund Position. Stellen Sie die Bildgröße auf 512 (X) x 384 (Y), die Scangeschwindigkeit auf 9, den Scanmodus auf bidirektional, den Zoom auf 0,7, das Loch auf 60,2 (1,63 luftige Einheiten ~ = 1,6 μm-Abschnitt) und das Z-Intervall auf 2,1 μm ein. Dies ergibt eine Bildgröße von 303,6 μm x 227,7 μm und eine Pixelgröße von 0,59 μm. Die Laser 488 und 561 sollten geprüft und derselben Spur zugeordnet werden; Der EGFP-Erfassungsbereich beträgt 494-545 nm und der mCherry-Erfassungsbereich 598-679(Abbildung 4F).
   4. Beschichten Sie den Boden der Glasschale großzügig mit einem Tauchmedium, das dem Brechungsindex des Wassers entspricht, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden (Abbildung 4C). Wählen Sie das 40-fache Wasserobjektiv und tragen Sie einen kleinen Tropfen Tauchmedium auf das Objektiv auf (Abbildung 4D). Befestigen Sie die Glasbodenschale im Bühneneinsatz, tragen Sie E3 auf, um die Embryonen über Nacht feucht zu halten, und verwenden Sie dann Modelliermasse, um den Kunststoffdeckel über der Schüssel zu versiegeln (Abbildung 4E). Erhöhen Sie das Ziel, kontaktiere mit dem Gericht zu treten.
2. Screenen Sie Proben und bereiten Sie sich auf den Zeitraffer vor.
   1. Wechseln Sie von der Registerkarte Erfassung zur Registerkarte Suchen und klicken Sie auf das Glühbirnensymbol, um das Durchlicht einzuschalten. Mit dem durchgelassenen Licht lokalisieren Sie die erste Probe mit dem Joystick: Bewegen Sie die Probe mit dem Auge zuerst in den Lichtstrahl, verwenden Sie dann die Okulare in die Mitte und fokussieren Sie sich auf ein optisches Vesikel.
   2. Kehren Sie zur Registerkarte Erfassung zurück. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollkästchen Z-Stack, Zeitreiheund Positionen aktiviert sind und die Laser für die Verwendung aufgewärmt sind.
   3. Legen Sie die Bildgröße auf 512 (X) x 384 (Y), die Scangeschwindigkeit auf 9, den Scanmodus auf bidirektional und den Zoom auf 0,7 fest.
   4. Unter der Überschrift Kanäle weisen Sie zunächst die Laser 488 und 561 Power 2.0 und Gain 550 zu (dies kann später angepasst werden). Stellen Sie das Loch auf 60,2 (1,63 Airy Units ~= 1,6 μm Abschnitt) ein.
   5. Beginnen Sie mit dem Scannen mit der Schaltfläche Kontinuierlich. Suchen Sie mit dem Feinfokusknopf die Probe in der Z-Achse und positionieren Sie die X-Y-Achse im Rahmen. Stoppen Sie den Scanvorgang.
   6. Klicken Sie unter der Überschrift Positionen auf Hinzufügen, um die XYZ-Informationen zur ersten Probe zu speichern (Abbildung 4F). Tun Sie dies nur für Samples, die mit einem Zeitraffer angezeigt werden sollen. Wählen Sie Proben aufgrund ihrer starken Fluoreszenz und optimalen Montage aus.
   7. Wechseln Sie zur Registerkarte Suchen, wechseln Sie zum nächsten Beispiel, und wiederholen Sie die Schritte 4.2.5-4.2.6, wobei Sie bei der Auswahl der Beispiele selektiv vorgehen.
3. Schließen Sie die Probenpositionen ab, weisen Sie den Z-Bereich zu, und starten Sie dann den Zeitraffer. Sobald alle Proben ausgewählt sind (es ist möglich, 4-5 Proben innerhalb des Gesamtzeitintervalls von 2,5 Minuten abbilden) und die Positionen gespeichert sind, gehen Sie jede Probe durch und passen Sie die XYZ-Position innerhalb des Betrachtungsrahmens an.
   1. Markieren Sie die erste Position und klicken Sie auf Move To. Richten Sie beim kontinuierlichen Scannen das optische Vesikel innerhalb des Rahmens aus. Lassen Sie viel Platz in den vorderen und distalen Regionen relativ zum optischen Vesikel und zum Gehirn.
   2. Weisen Sie als Nächstes die ersten und letzten Z-Slices zu, indem Sie Set First und Set Last auswählen, während Sie sich mit dem Feinfokusknopf durch die Z-Richtung bewegen. Halten Sie eine Gesamtscheibenzahl von ~ 63 aufrecht, da dies das Wachstum des optischen Bechers berücksichtigt. Bieten Sie zusätzlichen Platz auf der ventralen Seite des optischen Vesikels, um Raum für Wachstum zu schaffen.
   3. Sobald die ersten und letzten Z-Slices festgelegt wurden, klicken Sie auf die C-Schaltfläche, um zur Mitte des Z-Stacks zu wechseln. Passen Sie die Laserleistung und -verstärkung für beide Laser an. Wenn möglich, halten Sie die Laserleistung unter 5 und verwenden Sie bei Bedarf eine höhere Verstärkung. Stoppen Sie den Scanvorgang. Aktualisieren Sie die Positionsinformationen, indem Sie auf Aktualisierenklicken.
   4. Wechseln Sie zur nächsten Position, indem Sie auf Position 2klicken. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1-4.3.3 für jede zugewiesene Position. Die Laserleistung und -verstärkung sollte so eingestellt werden, dass alle Proben ausreichend ausgeleuchtet sind.
   5. Sobald sowohl die Positionsinformationen als auch die Lasereinstellungen abgeschlossen sind, weisen Sie Zeitreiheneinstellungen zu. Weisen Sie unter der Überschrift Zeitreihen 2,5 min und Zyklen 300 zu(Abbildung 4F). Die Anzahl der Zyklen wird so berechnet, dass der Zeitraffer über die 24-PSF-Stufe hinausgeht, wenn die Entwicklung des optischen Bechers abgeschlossen ist.
   6. Um den Zeitraffer zu starten, klicken Sie auf Start. Überwachen Sie den ersten vollständigen Zyklus: Verwenden Sie einen Timer, um sicherzustellen, dass ein vollständiger Zyklus (Abbildung aller Positionen) weniger als 2,5 Minuten beträgt, und überprüfen Sie, ob jede Position korrekt aussieht. Das Mikroskop läuft unabhängig über Nacht und muss nicht überwacht werden.
      HINWEIS: Obwohl der konfokale Raum temperaturgesteuert ist, beträgt die Raumtemperatur 20-25 °C. Wenn die Geräte laufen und die Laser scannen, scheint die Temperatur auf der Bühne näher an 28,5 ° C zu liegen, da die Embryonalentwicklung mit dieser erwarteten Geschwindigkeit fortschreitet, wie visuell mit morphologischen Landmarken untersucht.
   7. Mit diesen Einstellungen dauert der Zeitraffer 12,5 h. Speichern Sie die Datei, sobald der Zeitraffer abgeschlossen ist. Es ist groß (~ 40 GB) und kann nach dem Speichern mit der Erfassungssoftware in einzelne Positionen aufgeteilt werden.

Ergebnisse

Injektion von fluoreszierenden RNAs ermöglicht subzelluläre Markierung
RNAs, die die Plasmamembran und Histone der Zelle kennzeichnen, werden injiziert, um die einzelnen Zellmorphologien und -bewegungen zu erfassen, die der optischen Bechermorphogenese zugrunde liegen. Abbildung 2 zeigt jeden Schritt des Prozesses der Mikroinjektion von Zebrafischembryonen im 1-Zell-Stadium. Kurz gesagt, Zebrafische werden gepaart (Abbildung 2E), und Embryonen werden gesammelt und in die Spritzgussform geladen (Abbildung 2J). Eine Mikroinjektionsnadel wird verfüllt (Abbildung 2H), und Embryonen werden direkt in die einzelne Zelle injiziert (Abbildung 2K-M), was notwendig ist, um eine einheitliche Kennzeichnung zu erhalten (Abbildung 2M, Abbildung 4I-I''', Film1). Neben der gleichmäßigen Markierung wird eine robuste Fluoreszenz beobachtet und die Entwicklung verläuft ungestört (Abbildung 3B-B'').

Effektive Montage ist für Zeitraffer-Bildgebung OCM von 12-24 HPf unerlässlich
Um die optische Bechermorphogenese abbilden zu können, die über einen längeren Zeitraum auftritt, ist es wichtig, sowohl ideale Embryonen auszuwählen als auch jede Probe während der Einbettung richtig zu positionieren. Abbildung 3 zeigt eine detaillierte Darstellung der erfolgreichen Montage von 11 hpf-Embryonen. Injizierte Embryonen werden zunächst auf ausreichende Fluoreszenz untersucht (Abbildung 3B',B'',F'',F'''). Einzelne Embryonen werden in Agarose getaucht (Abbildung 3C, C ') und dorsal in einen einzelnen Tropfen Agarose montiert ( Abbildung3D,D'). Alle Proben sind in einer Sammelscheibe aus Agarose montiert (Abbildung 3E-F'). Wenn die Embryonen korrekt, ausreichend fluoreszierend und ausreichend montiert sind (Abbildung 3G), bleiben die Proben während des Zeitraffers im Bildrahmen, so dass das gesamte Organ abgebildet werden kann (Abbildung 4G-G'',I-I''', Film1). Wenn keiner dieser Schritte ausgeführt wird, führt dies zu einem montierten Embryo, der keine optimale Probe für die Zeitrafferbildgebung ist. Die geringste Variation des Rotationsgrades wird sich dramatisch auf die Richtung des Embryowachstums während des Zeitraffers auswirken. Suboptimale Rotationen sind in Abbildung 3dargestellt, einschließlich eines überdrehten Embryos (Abbildung 3I), der zu einem hinteren Zeitraffer führt, und eines unterrotierten Embryos (Abbildung 3J), bei dem nur das vorderste Gewebe beobachtet werden kann. Zusätzlich zur richtigen Rotation während der Montage ergeben Proben, die in Bezug auf die Ausrichtung des Rahmens montiert werden, eher einen erfolgreichen Zeitraffer (Abbildung 4G-G'', I-I''', Film 1). Optimale Proben sind solche, die vertikal auf der Schüssel ausgerichtet sind, wobei die vordere hintere Achse mit 12 und 6 Uhr auf einem Zifferblatt ausgerichtet ist (Abbildung 3G). Suboptimale Stichproben sind solche, die nicht auf dieser Achse ausgerichtet sind, z. B. horizontale oder diagonale(Abbildung 3H). Diese Proben wachsen im Laufe des Zeitraffers aus dem Bildrahmen heraus und können nicht für weitere Analysen verwendet werden (Abbildung 4H-H'', J-J''').

Erfassung eines Zeitrafferdatensatzes, der für zukünftige Analysen geeignet ist
Embryonen, die genau injiziert, aufgezogen und montiert werden, sorgen für erfolgreiche konfokale Bildproben. Abbildung 4 zeigt eine optimale Probe für den Zeitraffer: Es gibt sogar Fluoreszenz, und die Probe ist 12 HPF. Der z-Stack für die Bildgebung ist so zugeordnet, dass die erste Scheibe nur dorsal zum optischen Vesikel ist, während die letzte Scheibe mehrere Scheiben jenseits der ventralen Grenze des 12 HPF optischen Vesikels hinterlässt (Abbildung 4G-G''). Diese Verzerrung zur ventralen Seite bietet überschüssigen Raum für gewebewachstum in ventraler Richtung. Diese Faktoren führen, wenn sie erfüllt sind, zu einem optimalen Zeitraffer (Abbildung 4I-I''', Film 1). Eine suboptimale Probe hat eine Mosaik- oder Dim-Fluoreszenz, hat sich bereits über 12 HPF entwickelt (wenn die optische Bechermorphogenese im Gange ist) oder ist schlecht im Z-Stack oder im XY-Rahmen positioniert (Abbildung 4H-H''). Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, erfasst der Zeitraffer nicht mehr das gesamte 3D-Volumen des Gewebes, während es sich entwickelt, und kann nicht für weitere Analysen verwendet werden (Abbildung 4J-J''').

Abbildung 1: Workflow der 4D-Zeitrafferbildgebung der Zebrafisch-Optikbechermorphogenese. (A) Um subzelluläre Strukturen von Interesse fluoreszierend zu kennzeichnen, synthetisieren Sie die entsprechenden gedeckelten mRNAs. (B) Mikroinjekt mRNA(s) in Zebrafischembryonen im 1-Zell-Stadium. (C) Embryonen werden dorsal oder kopfab unten für ein invertiertes konfokales Mikroskop im optischen Vesikelstadium, ~ 11 h nach der Befruchtung oder 3 Somite-Stadium montiert. (D) Mehrere Embryonen können während einer einzigen Zeitraffer-Bildgebungssitzung sequenziell abgebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Eine visuelle Anleitung für die Mikroinjektion von 1-Zellen-Zebrafischembryonen. (A) Gegenstände, die in einem Injektionsset (im Uhrzeigersinn) enthalten sind: mittelgroße Box, die das gesamte Kit mit Einweg-Nitrilhandschuhen aufnehmen kann; eine Schale mit Mikroinjektionsnadeln; Zette; ein Aliquot von Mineralöl und zerschnittene Quadrate von Parafilm; Microloading-Spitzen; verdünnte RNA auf Eis; Agarose Spritzgussform; Marker; Walze/Transferpipette; und P10-Pipette. (B) Mikroinjektions-Setup: ein Seziermikroskop neben einem Pico-Injektor, der an eine externe Druckgasquelle angeschlossen ist. Ein Fußpedal und ein Mikromanipulator sind am Pico-Injektor befestigt. Der Mikromanipulator ist mit einem Nadelhalter ausgestattet und über dem Mikroskopstand positioniert. (C) Ein Agarose-Spritzgusswerkzeug mit sechs Rillenreihen mit einem 90-Grad-Winkel auf der einen Seite und einem 45-Grad-Winkel auf der anderen Seite. (D) Die Pico-Injektor-Frontplatte. Die Druckanzeige zeigt 7,8 PSI an; Dies kann mit dem Knopf mit der Bezeichnung P_injecteingestellt werden. Darunter befinden sich Drucktasten, um den Druck zur Injektion manuell auszulösen, die Injektionszeit zu ändern oder die Flüssigkeit in der Nadel zu löschen, zu füllen oder zu halten. Die Injektionszeit ist auf 08 eingestellt (entspricht 8 x 10 msec). Ein Ausgangsschlauch ist mit dem_P-Ausgang verbunden und an der Injektionsnadel befestigt. Der Druckmessgerät-Quellenschalter ist bei der Einstellung des Injektionsdrucks auf P_inject eingestellt und kann auf_P-Balance umgeschaltet werden, um den Basaldruck einzustellen, der auf die Nadel ausgeübt wird, wenn keine Injektionen durchgeführt werden. Der_{P-Balance-Regler} befindet sich neben dem_{P-Injektionsregler.} Der Netzschalter leuchtet, um anzuzeigen, dass das Gerät eingeschaltet ist. (E) Erwachsene Zebrafische werden in kleinen Brutbecken gepaart, die ein verschachteltes Becken mit einem Maschenboden enthalten, der erwachsene Fische von befruchteten Eiern trennt und eine einfache Sammlung ermöglicht. Der Wasserstand wird gesenkt, um flache Wasserbedingungen nachzuahmen, und Tankteiler werden entfernt, um das Paarungsverhalten zu initiieren. (F) Die Mikropipette (Nadel) Abzieher-Frontplatte: enthält ein Display, das die spezifischen Bedingungen zum Ziehen von Nadeln anzeigt. Die Druckeinstellung ist P = 500, gefolgt von dem datum und der Uhrzeit der letzten Bearbeitung des Programms, der Programmnummer, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 und TIME = 90. (G) Eine Glaskapillare wird in den Mikropipettenabzieher (Nadelzieher) eingeführt und an Ort und Stelle befestigt. Jeder programmierte Zuglauf ergibt zwei lange konische Nadeln (rote Pfeilspitzen). (H) Die RNA-Verdünnung wird in eine Nadel zurückgeladen; Der phenolrote Farbstoff ermöglicht eine einfache Visualisierung der Lösung. (I) Nach dem Brechen der Nadelspitze wird der Bolus der RNA mit einem Okular absehen auf dem Sezierfernrohr gemessen. Für dieses Stereomikroskop entsprechen bei 30-facher Gesamtvergrößerung 6 Hash-Markierungen 1 nL Volumen. (J) Befruchtete Eier werden in das Agarose-Spritzgusswerkzeug geladen und mit einer Rollenpipette entlang der Tröge der Form verteilt. (K) Das Spritzgießwerkzeug, das einzellige Embryonen enthält, wird unter dem Mikroskop positioniert und die Embryonen werden nacheinander injiziert. (L) Die Injektionsnadel wird in jeden Embryo eingeführt, der auf die einzelne Zelle abzielt. (M) Einmal in der Zelle, wird das Fußpedal verwendet, um eine regulierte Druckmenge und die Freisetzung von 1 nL RNA in die Zelle des Embryos auszulösen (wie durch Phenolrot visualisiert). Maßstabsbalken: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Eine visuelle Anleitung für die Montage von Embryonen für die Bildgebung. (A) Montageaufstellung (von links nach rechts): ein auf 42 °C programmierter Wärmeblock, Heizrohre aus schmelzarmer Agarose; eine Rollenpipette; ein Paar Zangen; eine mit Agarose überzogene Schale mit enthorionierten Embryonen; und ein sezierendes Stereomikroskop, das mit einer Halogen-Metalldampf-Leuchtstofflampe verbunden ist. (B,B',B'') Ein 11-PSF-Embryo, der mit EGFP-CAAX mRNA und mCherry-H2A mRNA injiziert wurde, gezeigt unter Hellfeld-, GFP-Fluoreszenz bzw. mCherry-Fluoreszenz. (C,C') Eine Glaspastpipette mit Agarose und einem Embryo, der in der Spitze sitzt; C' ist eine vergrößerte Ansicht. (D,D') Ein Embryo, der in einem Tröpfchen niedrigschmelziger Agarose auf einer Glasbodenschale montiert ist, sowohl vom Mikroskopstadium als auch durch die Okulare des Mikroskops aus gesehen. (E,E')12 Embryonen, die in einzelnen Tröpfchen schmelzarmer Agarose auf einer Glasbodenschale montiert sind, sowohl vom Mikroskopstadium als auch durch die Okulare des Mikroskops aus gesehen. (F,F',F'',F''') Alle montierten Embryonen werden mit einer vollständigen Schicht Agarose überlagert, um den Boden der Schale zu füllen, sowohl vom Stadium des Mikroskops als auch von den im Hellfeld gezeigten Mikroskopokularen aus gesehen; F'' GFP-Fluoreszenz; und F''' mCherry Fluoreszenz. (G) Eine optimale Probe bei 12 HPF wird dorsal montiert und vertikal in Übereinstimmung mit 12 und 6 Uhr mit beiden optischen Vesikeln in der gleichen Ebene ausgerichtet. (H) Eine suboptimale Probe: Obwohl dorsal montierte und optische Vesikel in Einer Ebene miteinander sind, ist diese Probe auf einer diagonalen Achse ausgerichtet und wächst im Verlauf der Entwicklung aus der Rahmengröße heraus. (I) Eine suboptimale Probe: Diese Probe ist überdreht und keine dorsale Montierung, wodurch der vordere Teil des optischen Vesikels nicht im Zeitraffer erfasst wird. (J) Eine suboptimale Probe: Diese Probe ist unterrotiert und keine dorsale Montierung, wodurch der hintere Teil des optischen Vesikels im Zeitraffer nicht erfasst wird. Gepunktete Linien zeigen jedes optische Vesikel an. Maßstabsstäbe: B = 0,1 mm; D' = 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einrichten eines Zeitraffers mit mehreren Positionen und potenziellen Ergebnissen. (Ein) Laserscanning konfokales Mikroskop. (B) Piezo-Z-Bühneneinsatz. (C) Der Boden einer Glasbodenschale mit embryonen eingebetteten Embryonen ist mit einem Tauchmedium beschichtet, das dem Brechungsindex von Wasser entspricht. (D) Auf das 40-fach-W-Objektiv (langer Arbeitsabstand) wird ein Tropfen Tauchmedium gelegt. (E) Die Schale wird mit dem Bühneneinsatz an Ort und Stelle gehalten, E3 wird auf die Agaroseschicht aufgesetzt und der Deckel wird mit Modelliermasse gesichert. (F) Einstellungen der Erfassungssoftware: Die gewünschten Laserlinien werden über das Dropdown-Menü aktiviert. Für Embryonen, die mit EGFP-CAAX RNA und H2A-mCherry RNA injiziert werden, werden die Laser Argon und DPSS 561-10 eingeschaltet. Die rote Markierung zeigt an, dass sich der Argon-Laser erwärmt. Um die Probe über dem Objektiv zu lokalisieren, wird das durchgelassene Licht über das Mikroskop-Bedienfeld eingeschaltet. Sowohl EGFP als auch mCherry sind Track 1 zugeordnet (für simultane Bildgebung) und die Reichweite jedes Detektors wird eingestellt. Hier ist der EGFP-Bereich auf 494-545 nm und der mCherry-Bereich auf 598-679 nm eingestellt. Unter dem Kanäle Menü, Laserleistung kann eingestellt werden. Nachdem sich die Laser erwärmt haben, kann die Leistung auf bis zu 5,0 erhöht und die Verstärkung (Master) eingestellt werden. Das Loch ist auf 60,2 eingestellt, was 1,63 Airy Units oder 1,6 μm Abschnitt entspricht. Unter dem Erwerb -Menü ist die Bildgröße auf 512 x 384 eingestellt, die Scangeschwindigkeit beträgt 9,0, die Mittelung ist bidirektional und der Zoom ist auf 0,7 eingestellt. Unter dem Z-Stapel Menü werden die erste und letzte Position in der Z-Achse eingestellt, während das Konfokal gescannt wird. Das Intervall (Schrittgröße) ist auf 2,1 μm eingestellt. Bei der Auswahl der ersten und letzten Z-Position wird im Allgemeinen eine Standardanzahl von 63 Slices beibehalten; Dies trägt dem Gesamtwachstum des Auges Rechnung. Die Option "Piezo verwenden" ist ausgewählt. Unter dem Positionen wird jede ausgewählte Position einschließlich einer zugewiesenen Nummer und der X-, Y- und Z-Position aufgelistet. Es gibt zusätzliche Schaltflächen, um die Anzahl der zu bildende Embryonen (separate Positionen) zu steuern, einschließlich Hinzufügen, Aktualisieren oder Entfernen. Unter dem Zeitreihe -Menü wird der Zyklus auf 300 (die Anzahl der Z-Stacks, die erfasst werden) und das Intervall (Zeitschritt) auf 2,5 min eingestellt. Sobald die Einstellungen abgeschlossen sind, wird die Zeitraffererfassung durch Drücken von Start gestartet. Die Software zeigt das Segment des Z-Stacks, den Zyklus und die Position, die gerade gescannt wird. Wenn der Zeitraffer abgeschlossen ist, wird die Datei gespeichert, indem Sie auf das Diskettensymbol im Bilder und Dokumente Gremium. (G-J) Zellmembranen (green) sind mit EGFP-CAAX und Zellkernen (Chromatin, magenta) sind mit H2A-mCherry RNAs gekennzeichnet. (G,G',G'') Ein Beispiel für das Setzen des ersten und letzten Z-Slices für eine optimal montierte Probe. Die erste Z-Scheibe (an der dorsalen Seite) geht auf Kosten des dorsalen Ektoderms, während die letzte Z-Scheibe (an der ventralen Seite) weit unter dem optischen Vesikel liegt, um ihr Wachstum in ventraler Richtung aufzunehmen. (H,H',H'') Ein Beispiel für das Festlegen des ersten und letzten Z-Slices einer suboptimalen Probe. Die Probe hat eine schwache mCherry-Fluoreszenz und ist diagonal montiert, so dass es unwahrscheinlich ist, dass der sich entwickelnde optische Becher für die Dauer des Zeitraffers im Rahmen bleibt. (ICH,ICH',ICH'',ICH''') Ein Beispiel für einen Zeitraffer aus einer optimalen Probe. Einzelne Slice-Bilder aus der Mitte des Z-Stacks werden aus dem gesamten 63 Slice-Volume zu 4 Zeitpunkten (T-Wert) aufgenommen. Br, Gehirn; NR, neuronale Netzhaut; RPE, retinale pigmentiertes Epithel; Le, Objektiv. (J,J',J'',J''') Ein Beispiel für einen Zeitraffer aus einer suboptimalen Stichprobe. In diesem Fall bewegte sich die Probe aus der Z-Ebene und nur ein schräger Teil des vorderen optischen Bechers wurde erfasst. Maßstabsbalken: G, I = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Film 1: Zeitraffer der optischen Tassenmorphogenese in einem optimalen Wildtyp-Embryo. Eine dorsale Ansicht eines Wildtyp-Embryos, der mit EGFP-CAAX (Plasmamembranen, grün)und H2A markiert ist. F/Z-mCherry (Chromatin, Magenta). Der Zeitraffer ist von ~12-24 hpf und enthält einen einzelnen konfokalen Abschnitt aus einem ganzen 4D-Datensatz. Das Zeitintervall beträgt 2,5 Minuten zwischen Z-Stacks und wird mit 22,5 Bildern pro Sekunde angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die In-toto-Markierung und 4D-Zeitrafferbildgebung der optischen Cup-Morphogenese. Wir durchlaufen den Prozess der Erzeugung von Capped RNA, die fluoreszierende Proteine kodiert, um verschiedene subzelluläre Kompartimente zu markieren. Injektion von Zebrafisch-1-Zellen-Embryonen; Einbettung von 11 HPF-Embryonen in Agarose für die multiplexierte Bildgebung; und Erwerb von 4D-Datensätzen mehrerer Embryonen für die Dauer der optischen Cup-Morphogenese (12-24 HPF).

Mit diesen informationsreichen Datensätzen lassen sich unzählige Fragen beantworten. 4D-Daten können auf vielfältige Weise visualisiert und quantitativ analysiert werden. Obwohl außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls, schließen wir hier einige unserer Ziele und Standardanwendungen als Beispiel für die Arten von Dingen ein, die erreicht werden können. Natürlich werden quantitative Bildanalysemethoden ständig weiterentwickelt und es können sowohl handelsübliche als auch kundenspezifische Werkzeuge verwendet werden. Wenn man solche Methoden noch nicht verwendet hat, sollte man bereit sein, einige Optimierungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass die erworbenen Datensätze für den quantitativen Analyseansatz der Wahl geeignet sind.

Die Visualisierung und quantitative Auswertung der 4D-Datensätze kann aufgrund der Größe der Dateien eine Herausforderung darstellen. Die Erfassungssoftware kann verwendet werden, um die Datensätze in einzelne Embryonen zu trennen, und ImageJ / Fiji kann verwendet werden, um konfokale Dateien von kommerziellen Formaten in Standard-TIF-Stacks zu konvertieren, in denen jeder Zeitpunkt als separate Datei gespeichert wird. Dadurch werden die Dateigrößen verringert und die Dateiformate standardisiert. Einzelne optische Schnitte aus jedem Zeitpunkt können mit ImageJ/Fiji als 2D (XY) Zeitraffer zusammengesetzt werden, was eine schnelle 2D-Visualisierung und Auswertung der Daten ermöglicht. Film 1 ist ein Beispiel dafür: ein einzelner optischer Abschnitt im Laufe der Zeit, der als Zeitraffer der in Abbildung 4I– I'''gezeigten optimalen Probe zusammengesetzt wurde. Von dort aus verwenden wir für die 3D- und 4D-Visualisierung häufig FluoRender^35,36, das frei verfügbar ist, aber spezifische Grafikkartenanforderungen hat. Mit FluoRender kann man 3D-gerenderte Daten in jeder Achse drehen, den Datensatz im Laufe der Zeit in 4D visualisieren, Cutaways in jeder Ebene generieren und die Drehungen und Visualisierungen als Film oder eine Reihe von TIF-Bildern speichern.

In Bezug auf die quantitative Analyse gibt es zahlreiche Fragen zu beantworten. Wir haben software intern entwickelt, um unsere eigenen spezifischen Ziele zu unterstützen, das Zellverhalten zu verstehen, das der optischen Cup-Morphogenese zugrunde liegt. Unser Programm, LongTracker, verwendet das Kernsignal als Proxy für die Position, um Zellen¹³zu verfolgen. Mit diesen Daten können wir bestimmen, wann, wo und wie sich Zellen bewegen; wie schnell und wie weit sich Zellen bewegen; und wie häufig sich Zellen teilen. Zusätzlich zu unserer eigenen Software gibt es mehrere kommerziell erhältliche und maßgeschneiderte Optionen für die 4D-Zellverfolgung. Wir haben auch das Programm LongAxis entwickelt, um Zellsegmentierung durchzuführen und die Zellform und -organisation innerhalb der neuronalen Netzhaut zu quantifizieren³⁷. Die in LongAxis eingegebenen Datensätze sind jedoch einzelne Z-Stacks, die mit hoher Auflösung aufgenommen werden. Eine anhaltende Herausforderung bestand darin, Zeitraffer-Datensätze mit einer ausreichend hohen Auflösung zu generieren, dass Zellen mit Zuversicht segmentiert und ihre Morphologie extrapoliert werden können. Eine Alternative ist die mosaikartige (spärliche) Markierung mit einem photokonvertierbaren Fluorophor wie Kaede zur direkten Visualisierung der Zellform, wie wir und andere im sich entwickelnden Auge^8,11,13durchgeführt haben . Dies vereinfacht das Problem der Zellsegmentierung, und Zellform und -größe können durch 3D-Rendering in FluoRender leicht quantifiziert werden.

Jeder Schritt dieses Protokolls wurde speziell für unsere Zwecke optimiert. Die Spezifität dieses Protokolls führt zu mehreren Einschränkungen: Das Protokoll, wie geschrieben, ist nicht für die Abbildung anderer Aspekte der Zebrafischaugenentwicklung (wie retinale Neurogenese), anderer Augenstrukturen, anderer Entwicklungsstadien oder anderer subzellulärer Kompartimente optimiert. Die Ausrichtung der Einbettung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und die Etiketten sind alle so konzipiert, dass wir unsere biologischen Fragen beantworten können. Um beispielsweise die retinale Neurogenese abbilden zu können, ist die dorsale Orientierung des Embryos, wie hier beschrieben, möglicherweise nicht möglich, bestimmte Merkmale von Interesse zu visualisieren, und die Geschwindigkeit der Bildgebung ist möglicherweise nicht angemessen. Viele Aspekte des Protokolls können für eine Vielzahl von Bedürfnissen angepasst und modifiziert werden, abhängig von den spezifischen Interessen und Zielen. Erstens macht die Verwendung von RNA-Injektionen den Markierungsprozess sehr flexibel. Fluoreszierende Proteinfusionskonstrukte können verwendet werden, um subzelluläre Strukturen von Interesse zu kennzeichnen, und die RNA-Injektionsmenge kann variiert werden, um die Markierung zu optimieren. Basierend auf unserer Arbeit mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Kaede scheinen RNA-Injektionen einen Translationsschub zu unterstützen, der um 12 hpf^11,13vorbei ist. Ein hoher Anteil an fluoreszierender Proteinexpression durch RNA-Injektion könnte photobleaching bekämpfen, aber ein solcher Ansatz unterstützt keine anhaltende Expression der fluoreszierenden Markierung von Interesse. Wenn eine anhaltende Expression erforderlich ist, z. B. bei der Bildgebung von Embryonen in späteren Stadien, sind transgene Linien eine Option, und die Konstruktion neuer Linien in Zebrafischen ist einfach²⁴.

Als nächstes kann das Protokoll für spätere Entwicklungsstadien angepasst werden. Da Pigmente die Bildgebung in späteren Stadien behindern können, können Embryonen mit Phenylthiourea (PTU) behandelt werden, um die Pigmentbildung zu hemmen, oder genetische Mutanten für die Pigmentsynthese können verwendet werden. Um ein Zucken des Embryos zu verhindern, kann Tricain zu den Agarose- und Embryomedien-Overlay-Lösungen hinzugefügt werden, und der Prozent der Agarose kann bei Bedarf angepasst werden. Wenn das Auge wächst, kann es notwendig sein, die Montageausrichtung zu ändern. Hier montieren wir Embryonen dorsal, aber in späteren Stadien kann es sinnvoller sein, je nach Struktur seitlich oder anterior zu montieren. Da unterschiedliche Prozesse über unterschiedliche räumliche und zeitliche Skalen ablaufen, kann man auch den Z-Schritt und den Zeitschritt der Bildaufnahme optimieren. Diese Merkmale können wirklich nur empirisch für die Bedürfnisse jedes Labors bestimmt werden.

Schließlich wurde dieses Protokoll speziell für ein laserscannendes konfokales Mikroskop entwickelt, bei dem Embryonen in einem relativ hohen Prozentsatz an Agarose in einem frühen Stadium der Augenentwicklung eingebettet sind. Wenn man während der Augenentwicklung zu verschiedenen Zeiten oder an verschiedenen Orten bildgebung, muss dieses Protokoll für den interessierenden Prozess angepasst werden. Derzeit sind viele verschiedene Bildgebungsansätze möglich, weitere werden von Optikern entwickelt. Jeder Ansatz bringt seine eigenen Herausforderungen mit sich, von verschiedenen Möglichkeiten, Embryonen für die Bildgebung einzubetten und zu montieren, bis hin zu unterschiedlichen Dateigrößen und Formaten. Wir skizzieren in der Einleitung Überlegungen, um den Optimierungsprozess zu leiten, bei dem maximale räumliche und zeitliche Auflösung mit Photobleaching, Phototoxizität und immensen Dateigrößen ausgeglichen werden. Wir hoffen, dass diese allgemeinen Prinzipien zusätzlich zu den oben beschriebenen praktischen Informationen anderen helfen werden, Zeitraffer-Bildgebungsansätze zu etablieren, um die vielen offenen Fragen in der Augenentwicklung zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Delta TPG Schale 0,17 mm klar	Bioptechs	0420041500C	Deckglasboden für optische Kompatibilität
Einweg-Pasteur-Pipetten	VWR	14672-608	Gesamtlänge 14,6 cm (53/4")
Dumont #5, #55 oder #5SF Pinzette	Fine Science Tools	11254-20	Für Modell #5: gerade Spitze, 0,05 x 0,01 mm Spitze, Inox, 11 cm lang
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter	P-97
Immersol W	Carl Zeiss Mikroskopie	4449690000000	Immersionsflüssigkeit für Wasseremissionsobjektive, halogenfrei, niedrig fluoresziert
Mikrospritzguss Mold	Adaptive Science Tools	TU-1	Sechs Rampen, eine um 90 Grad und eine um 45 Grad abgeschrägte Seite.
Microloader Spitzen	Eppendorf	930001007	Microloader, Spitze zum Befüllen von Glasmikrokapillaren, 0,5 – 20 & micro; L
mMessage mMachine SP6 Transkriptionskit	Invitrogen	AM1340	enthält SP6 Enzymmix, 10X Reaktionspuffer, 2XNTP⁄ CAP-Lösung, GTP-Lösung, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammoniumacetat-Stopplösung, Lithiumchlorid-Fällungslösung und Gel-Ladepuffer und werden alle bei – 20 °C. Nukleasefreies Wasser kann bei jeder Temperatur gelagert werden.
Nikon SMZ645 Stereomikroskop	Nikon	SMZ645	für die Injektion von Embryonen (siehe Abb. 2B)
NotI-HF Enzym	NEB	R3189S	wird mit Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50081	feine Auflösung, Low Melt Agarose
Objektiv LD "C-Apochromat" 40x/1,1 W Korr M27	Carl Zeiss Mikroskopie	421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereomikroskop	Olympus	SZX2-ZB16	für das Screening, Einbetten von Embryonen (siehe Abb. 3A)
Phenolrotlösung	Sigma-Aldrich	P0290	0,5% in DPBS, steril filtriert, Endotoxin getestet, Zellkultur getestet
Pico-Liter Mikroinjektor	Harvard Apparatur	PLI-100	Femtoliter- bis Mikroliter-Injektionen; digitale Anzeigen für Injektionszahl, -zeit und -druck; Enthält 5 Drücke, einschließlich Injizieren, Ausbalancieren, Klären, Füllen und Halten
Pipettenpumpe Pipettierer	SP Bel-Art	F37898	passt in eine Einweg-Pasteurpipette, enthält ein Rändelrad an der Seite zum Ansaugen oder Dispensieren und einen Kolben zum schnellen Entleeren
Premium-Dünnwandkapillaren aus Borosilikatglas	Warner Instruments	G100T-4	1,0 x 0,78 mm
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106	enthält QIAquick Spin-Säulen, Puffer, Sammelröhrchen (2 ml)
RNase-freies H2O	Invitrogen	AM9906	DNase-frei, molekularbiologisch, RNase-frei
RNeasy Mini Kit Qiagen		74104	enthält RNeasy Mini Spin Säulen, Sammelröhrchen (1,5 ml und 2 ml), RNasefreie Reagenzien und Puffer
Tischaufsatz Z PIEZO WSB 500	Carl Zeiss Mikroskopie	432339-9000-000
Tischeinsatz Z PIEZO WSB Universal	Carl Zeiss Mikroskopie	432339-9030-000
Zeiss LSM 880 mit Airyscan	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	inverses Axio Observer Mikroskop
Zen Black 2.3 SP1 Software	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Zeiss Efficient Navigation (ZEN) steuert alle Lichtmikroskop-Systeme von Zeiss