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Biochemistry

फ्लोरेसेंस-आधारित माप फॉस्फेटिडिलसेरीन/फॉस्फेटिलिनोसिटॉल 4-फॉस्फेट एक्सचेंज झिल्ली के बीच

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम फ्लोरोसेंट लिपिड सेंसर और लिपोसोम का उपयोग करके प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या प्रोटीन अर्क और परिवहन फॉस्फेटिडिलसेरीन या फॉस्फेटिलिनोसिटॉल 4-फॉस्फेट इन विट्रो।

Abstract

विकासवादी संरक्षित ऑक्सीस्टेरोल-बाइंडिंग प्रोटीन (OSBP) से संबंधित प्रोटीन (ओआरपी) /OSBP समरूप (Osh) परिवार के कई सदस्यों को हाल ही में खमीर और मानव कोशिकाओं में एक उपन्यास लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन (LTP) समूह का प्रतिनिधित्व करने के लिए पाया गया है । वे फॉस्फेटिडिलसेरीन (पीएस) को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) से पीएस/फॉस्फेटिलिनोसिटॉल 4-फॉस्फेट (पीआई (4) पी) एक्सचेंज साइकिल के जरिए प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) में स्थानांतरित करते हैं । यह खोज कैसे पीएस, जो संकेत प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है की एक बेहतर समझ की अनुमति देता है, पूरे सेल में वितरित किया जाता है और इस प्रक्रिया और फॉस्फोनोसिटाइड (पीआईपी) मेटाबोलिज्म के बीच लिंक की जांच । आणविक स्तर पर विट्रो में इस नए सेलुलर तंत्र की खोज और लक्षण वर्णन में नए फ्लोरेसेंस आधारित प्रोटोकॉल का विकास महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहा है। यह पत्र पीएस या पीआई (4) पी निकालने के लिए प्रोटीन की क्षमता को मापने और कृत्रिम झिल्ली के बीच इन लिपिड को स्थानांतरित करने के लिए दो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिपिड सेंसर, एनबीडी-सी2लैक्ट और एनबीडी-पीएचएफएपीके उत्पादन और उपयोग का वर्णन करता है। सबसे पहले, प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे उत्पादन, लेबल, और इन दोनों निर्माणों के उच्च शुद्धता नमूने प्राप्त करने के लिए । दूसरे, इस कागज बताते है कि कैसे एक फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर के साथ इन सेंसरों का उपयोग करने के लिए निर्धारित है कि क्या एक प्रोटीन लिपोसोम से पीएस या PI (4) पी निकाल सकते हैं, एक मामले के अध्ययन के रूप में Osh6p का उपयोग कर । अंत में, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे सही PS/PI (4) पी विनिमय के काइनेटिक्स को परिभाषित लिपिड संरचना के liposomes के बीच मापने के लिए और फ्लोरेसेंस प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) द्वारा लिपिड हस्तांतरण दरों का निर्धारण करने के लिए एक मानक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर ।

Introduction

विभिन्न झिल्ली के बीच और यूकेरियोटिक कोशिकाओं की झिल्ली के भीतर लिपिड का सटीक वितरण1,2 में गहरा जैविक निहितार्थ है। सेल बायोलॉजी 3 , 4 ,5,6में एलटीपी कैसे कार्य करना एक महत्वपूर्ण मुद्दा है और इस मुद्दे को हल करने में इन विट्रो दृष्टिकोणों का बहुत महत्व है7,8,9,10,11. यहां, एक इन विट्रो,फ्लोरेसेंस-आधारित रणनीति प्रस्तुत की गई है जो यह स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है कि कई ओआरपी/ओश प्रोटीन कोशिका झिल्ली12 के बीच पीएस/पीआई (4) पी विनिमय को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार एलटीपी का एक नया वर्ग बनता है । पीएस एक एनियोनिक ग्लाइसेरोफोस्फोलिपिड है जो यूकेरियोटिक कोशिकाओं 13 , 14,16 में कुल झिल्ली लिपिड का2-10%का प्रतिनिधित्व करता है। यह ईआर और पीएम के बीच एक ढाल के साथ वितरित किया जाता है, जहां यह क्रमशः 17,18, 19, ग्लिसेरोस्फोस्फोक्लिड के5-7%और 30% तक का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, पीएस अनिवार्य रूप से पीएम के साइटोसोलिक पत्रक में केंद्रित है। यह निर्माण और प्रधानमंत्री में पीएस के असमान विभाजन सेलुलर सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं19। पीएस अणुओं के नकारात्मक आवेश के कारण, पीएम का साइटोसोलिक पत्रक अन्य ऑर्गेनेल्स1, 2,19,20के साइटोसोलिक पत्रक की तुलना में बहुत अधिक एनियोनिक है। यह इलेक्ट्रोस्टैटिक बलों के माध्यम से भर्ती को सक्षम बनाता है, इस तरह के myristoylated alanine-अमीर सी-kinase सब्सट्रेट (MARCKS)21,सारकोमा (एसआरसी)22,क्रिस्टन-चूहा सारकोमा वायरल oncogene (K-Ras)23,और रास से संबंधित C3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट 1 (Rac1)24 के रूप में प्रोटीन संकेत है कि सकारात्मक आरोप लगाया अमीनो और एक लिपिड टेल का खिंचाव होता है ।

पीएस को पारंपरिक प्रोटीन किनेज सी द्वारा सी 2 डोमेन25के माध्यम से स्टीरियोसेलेक्टिव तरीके से भी पहचाना जाता है । हालांकि, पीएस ईआर26में संश्लेषित किया जाता है, यह दर्शाता है कि इसे अपनी भूमिका निभाने से पहले प्रधानमंत्री को निर्यात किया जाना चाहिए । यह पता नहीं था कि यह कैसे19 पूरा किया गया था जब तक खोज है कि, खमीर में, Osh6p और Osh7p ईआर से पीएम27को स्थानांतरित पीएस । ये LTPs यूकेरियोट्स में एक विकासवादी संरक्षित परिवार से संबंधित हैं जिनके संस्थापक सदस्य OSBP हैं और इसमें प्रोटीन (मानव में ओआरपी, खमीर में ओश प्रोटीन) एक ओएसबीपी से संबंधित डोमेन (ओआरडी) को एक लिपिड अणु की मेजबानी करने के लिए जेब के साथ एकीकृत करता है। Osh6p और Osh7p केवल एक ओआरडी जिनकी संरचनात्मक सुविधाओं को विशेष रूप से पीएस बांधने और झिल्ली के बीच हस्तांतरण के लिए अनुकूलित कर रहे है से मिलकर बनता है । फिर भी, कैसे इन प्रोटीन दिशात्मक ईआर से प्रधानमंत्री को पीएस स्थानांतरित अस्पष्ट था । Osh6p और Osh7p एक वैकल्पिक लिपिड लिगामेंट12के रूप में PI (4) पी जाल कर सकते हैं । खमीर में, पीआई (4) पी को गोलगी में फॉस्फेटिलिनोसिटोल (पीआई) से संश्लेषित किया जाता है और पीएम क्रमशः पीआई 4-किनेस, पिक1पी और एसटीटी 4पी द्वारा। इसके विपरीत, ईआर झिल्ली में कोई पीआई (4) पी नहीं है, क्योंकि इस लिपिड को Sac1p फॉस्फेट द्वारा पीआई को हाइड्रोलिज किया जाता है। इसलिए, ईआर/गोलगी और ईआर/पीएम इंटरफेस दोनों पर एक पीआई (4) पी ढाल मौजूद है । Osh6p और Osh7p स्थानांतरित पीएस के माध्यम से पीएम को पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज चक्र के माध्यम से पीआई (4) पी ढाल है कि इन दो झिल्ली12के बीच मौजूद है का उपयोग कर ।

एक चक्र के भीतर, Osh6p ईआर से पीएस निकालता है, प्रधानमंत्री पर PI (4) पी के लिए पीएस एक्सचेंज करता है और एक और पीएस अणु निकालने के लिए पीआई (4) पी को ईआर में वापस स्थानांतरित करता है। Osh6p/Osh7p Ist2p28के साथबातचीत, कुछ प्रोटीन है कि कनेक्ट और ईआर झिल्ली और प्रधानमंत्री एक दूसरे के साथ निकटतामें लाने के लिए खमीर29,30,31में ईआर पीएम संपर्क स्थलों बनाने में से एक । इसके अलावा, नकारात्मक आवेशित झिल्ली के साथ Osh6p का संबंध कमजोर हो जाता है जैसे ही प्रोटीन एक अनुरूप परिवर्तन के कारण अपने लिपिड लिगांड में से एक को निकालता है जो इसकी इलेक्ट्रोस्टैटिक विशेषताओं को संशोधित करता है32। यह अपनी झिल्ली को छोटा करके Osh6p को सहायता देता है, जिससे इसकी लिपिड स्थानांतरण गतिविधि की दक्षता बनाए रहती है। Ist2p के लिए बाध्यकारी के साथ संयुक्त, इस तंत्र Osh6p/7p दोनों जल्दी और सही ER/PM इंटरफेस पर लिपिड एक्सचेंज निष्पादित करने के लिए अनुमति दे सकता है । मानव कोशिकाओं में, ORP5 और ORP8 प्रोटीन अलग तंत्र ३३ के माध्यम से ईआर-पीएम संपर्क स्थलों पर पीएस/पीआई(4)पी एक्सचेंज निष्पादित करते हैं । उनके पास एक केंद्रीय ओआरडी है, जो ओश 6पी के समान है, लेकिन सीधे सी-टर्मिनल ट्रांसमेम्ब्रेन सेगमेंट33 के माध्यम से ईआर में लंगर डाले जाते हैं और एन-टर्मिनल प्लेक्सस्ट्रिन होमोलॉजी (पीएच) डोमेन के माध्यम से पीएम में गोदी होती है जो पीआई (4) पी और पीआई (4,5) पी233,34, 35को पहचानती है। ORP5/8 पीएस को स्थानांतरित करने के लिए पीआई (4) पी का उपयोग करें, और यह दिखाया गया है कि ORP5/8 अतिरिक्त रूप से पीएम पीआई (4,5) पी2 स्तरों को विनियमित करते हैं और संभवतः सिग्नलिंग रास्तों को संशोधित करते हैं। बदले में, पीआई (4) पी और पीआई (4,5) पी2 स्तरों में कमी ORP5/ORP8 गतिविधि को कम करती है क्योंकि ये प्रोटीन पीआईपी-निर्भर फैशन में प्रधानमंत्री के साथ संबद्ध होते हैं। असामान्य रूप से उच्च पीएस संश्लेषण, जो लेंज-माजेवस्की सिंड्रोम की ओर जाता है, ORP5/836के माध्यम से PI (4) पी स्तर को प्रभावित करता है। जब दोनों प्रोटीन की गतिविधि अवरुद्ध हो जाती है, तो पीएस पीएम पर कम प्रचुर मात्रा में हो जाता है, जिससे प्रोटीन३७को संकेत देने की ऑन्कोजेनिक क्षमता कम हो जाती है ।

इसके विपरीत, ORP5 अतिव्यक्तता कैंसर सेल आक्रमण और मेटास्टैटिक प्रक्रियाओं को बढ़ावा देने लगता है38. इस प्रकार, ORP5/8 गतिविधि में परिवर्तन लिपिड होरोस्टेसिस में परिवर्तन के माध्यम से सेलुलर व्यवहार को गंभीर रूप से संशोधित कर सकते हैं । इसके अलावा, ORP5 और ORP8 ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क साइटों पर कब्जा करते हैं और संभवतः पीएस39की आपूर्ति करके कुछ माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को संरक्षित करते हैं। इसके अतिरिक्त, ORP5 पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज४०द्वारा लिपिड बूंदों को पीएस देने के लिए ईआर-लिपिड ड्रॉपलेट संपर्क साइटों को स्थानीयकृत करता है । लिपोसोम्स के बीच पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज गतिविधि को स्थापित करने और विश्लेषण करने के लिए तथा अन्य समूहों द्वारा ओआरपी5/ओआरपी 835 और अन्य एलटीपी12,32 तथा अन्य समूहों द्वारा उपयोग की जाने वाली रणनीति को मापने के लिए तैयार किया गया है। 41. यह फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर, एक मानक एल-फॉर्मेट स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर, और दो फ्लोरोसेंट सेंसर, एनबीडी-सी 2लैक्ट और एनबीडी-पीएचएफएपीके उपयोग पर आधारित है, जो क्रमशः पीएस और पीआई (4) पी का पता लगा सकता है।

NBD-C2लैक्ट ग्लाइकोप्रोटीन, लैक्टाडेरिन के C2 डोमेन से मेल खाता है, जिसे माना जाता पीएस बाध्यकारी साइट के पास एक अद्वितीय सॉल्वेंट-उजागर सिस्टीन शामिल करने के लिए फिर से शामिल किया गया था; एक ध्रुवता-संवेदनशील एनबीडी (7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायज़ोल) फ्लोरोफोर को इस अवशेष(चित्रा 1A) 12से सहसंबद्ध रूप से जोड़ागयाहै । अधिक सटीक होने के लिए, लैक्टाडेरिन (बीओ वृषभ, यूनिप्रोट: Q95114, अवशेष 270-427) के C2 डोमेन को एस्चेरिचिया कोलाईमें ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) के साथ संलयन में व्यक्त करने के लिए एक pGEX-4T3 वेक्टर में क्लोन किया गया था । C2लैक्ट अनुक्रम तो दो विलायक सुलभ सिस्टीन अवशेषों (C270, C427) एलेनिन अवशेषों के साथ और ख्यात पीएस-बाध्यकारी साइट (H352C उत्परिवर्तन) के पास एक क्षेत्र में एक सिस्टीन अवशेषों को पेश करने के लिए जिसे बाद में एन, एन-डाइमेथिल-एन-के साथ लेबल किया जा सकता है (iodoacetyl) -N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल-4-yl) एथिलीन डायमाइन (IANBD) 12। थ्रॉम्बिन के लिए एक क्लीवेज साइट जीएसटी प्रोटीन और सी2 डोमेन के एन-टर्मिनस के बीच मौजूद है। एक बड़ा लाभ यह है कि यह डोमेन चुनिंदा रूप से पीएस को अन्य ज्ञात C2 डोमेन या एनेक्सटिन A542के विपरीत सीए2 +-स्वतंत्र तरीके से पहचानता है। एनबीडी-पीएचएफएपी मानव चार-फॉस्फेट-एडाप्टर प्रोटीन 1 (FAPP1) के पीएच डोमेन से लिया गया है, जिसे एक एकल सॉल्वेंट-उजागर सिस्टीन को शामिल करने के लिए फिर से शामिल किया गया था जिसे पीआई (4) पी बाध्यकारी साइट(चित्रा 1A)43के पास एक एनबीडी समूह के साथ लेबल किया जा सकता है। मानव FAPP प्रोटीन (UniProt: Q9HB20, खंड [1-100]) के पीएच डोमेन के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को जीएसटी टैग के साथ मिलकर व्यक्त किए जाने वाले पीजीईएक्स-4टी3 वेक्टर में क्लोन किया गया है। पीएचएफएपी अनुक्रम को प्रोटीन43के झिल्ली-बाध्यकारी इंटरफेस के भीतर एक अद्वितीय सिस्टीन अवशेष डालने के लिए संशोधित किया गया है। इसके अलावा, प्रोटीज तक पहुंच सुनिश्चित करने के लिए थ्रोम्बिन क्लीवेज साइट और पीएच डोमेन के एन-टर्मिनस के बीच नौ अवशेष लिंकर पेश किया गया है ।

लिपोसोम्स से पीएस निष्कर्षण को मापने के लिए, NBD-C2लैक्ट को फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) से बने लिपोसोम्स के साथ मिलाया जाता है जिसमें पीएस की ट्रेस मात्रा होती है । पीएस के लिए अपनी आत्मीयता के कारण, यह निर्माण लिपोसोम्स को बांधता है, और एनबीडी फ्लोरोफोर को ध्रुवता में बदलाव का अनुभव होता है क्योंकि यह झिल्ली के हाइड्रोफोबिक वातावरण के संपर्क में आता है, जो नीले रंग की पारी और फ्लोरस में वृद्धि को प्रकाश में डालता है । यदि पीएस को एलटीपी की स्टोइचियोमेट्रिक राशि से लगभग पूरी तरह से निकाला जाता है, तो जांच लिपोसोम्स के साथ संबद्ध नहीं होती है, और एनबीडी सिग्नल कम(चित्रा 1B)32है। सिग्नल में यह अंतर यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि क्या एलटीपी(जैसे, Osh6p) पीएस निकालता है। इसी तरह की रणनीति का उपयोग एनबीडी-पीएचएफएपी के साथ पीआई (4) पी निष्कर्षण(चित्रा 1B)को मापने के लिए किया जाताहै,जैसा कि पहले12,32वर्णित है। दो FRET आधारित परख को एलए से एलबी लिपोसोम्स तक पीएस परिवहन को मापने के लिए डिजाइन किया गया था, जो क्रमशः ईआर झिल्ली और प्रधानमंत्री की नकल करते हैं, और (ii) पीआई (4) पी परिवहन रिवर्स दिशा में । ये परख पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज को मापने के लिए एक ही शर्तों(यानी, एक ही बफर, तापमान और लिपिड एकाग्रता) के तहत किया जाताहै । पीएस परिवहन को मापने के लिए, NBD-C2लैक्ट को एल पीसी से बनाएक लिपोसोम के साथ मिलाया जाता है और 5 मोल% पीएस और फ्लोरोसेंट रोडामाइन-लेबल वाले फॉस्फेटिडिलेथेनमाइन (रोड-पीई) के 2 मोल% के साथ डॉप किया जाता है- और एलबी लिपोसोम्स में 5 मोल% पीआई (4) पी शामिल है।

शून्य समय पर, रोड-पीई के साथ FRET एनबीडी फ्लोरेसेंस को क्वेंस करता है। यदि पीएस को एलए से एलबी लिपोसोम्स(उदाहरण के लिए, Osh6p इंजेक्शन पर) ले जाया जाता है, तो एलए से एलबी लिपोसोम्स(चित्रा 1C)तक NBD-C2लैक्ट अणुओं के स्थानांतरण के कारण एक तेजी से डीक्लेंचिंग होती है। सुलभ पीएस की राशि को देखते हुए, NBD-C2Lact प्रयोग12के दौरान एक झिल्ली से बंधे राज्य में अनिवार्य रूप से रहता है । इस प्रकार, एनबीडी सिग्नल की तीव्रता सीधे एलए और एलबी लिपोसोम्स के बीच NBD-C2लैक्ट के वितरण से संबंधित है और यह निर्धारित करने के लिए आसानी से सामान्यीकृत की जा सकती है कि पीएस को कितना स्थानांतरित किया जाता है। विपरीत दिशा में पीआई (4) पी के हस्तांतरण को मापने के लिए, एनबीडी-पीएचएफएपी को एलए और एलबी लिपोसोम्स के साथ मिलाया जाता है; यह देखते हुए कि यह केवल एलबी लिपोसोम्स से बांधता है जिसमें पीआई (4) पी होता है, लेकिन रोड-पी नहीं, इसकी फ्लोरेसेंस अधिक है। यदि पीआई (4) पी को एलए लिपोसोम्स में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो यह इन लिपोसोम्स में स्थानांतरित हो जाता है, और रोड-पी(चित्रा 1 सी)के साथ FRET के कारण संकेत कम हो जाता है। यह निर्धारित करने के लिए सिग्नल को सामान्यीकृत किया जाता है कि पीआई (4) पीको 43स्थानांतरित कितना स्थानांतरित किया जाता है।

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Protocol

1. NBD-C2लैक्ट का शुद्धिकरण

नोट: हालांकि यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया को तोड़ने के लिए सेल बाधित के उपयोग का विवरण देता है, लेकिन इसे अन्य लाइसिस रणनीतियों(उदाहरण के लिए, एक फ्रांसीसी प्रेस) का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। शुद्धिकरण की शुरुआत में, सिस्टीन के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए 2 m डिइयोथरेटोल (डीटीटी) के साथ ताजा डिगैस्ड, फ़िल्टर और पूरक बफर का उपयोग करना अनिवार्य है। हालांकि, प्रोटीन लेबलिंग कदम के लिए, यह पूरी तरह से डीटीटी को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है । किसी भी प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए बर्फ पर या ठंडे कमरे में कई कदम उठाए जाने चाहिए। शुद्धिकरण की प्रगति की जांच करने के लिए 15% एक्रिलामाइड जेल का उपयोग करके सोडियम डॉडिल्सुल्फेट-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में 30 माइक्रोन वॉल्यूम के नमूने एकत्र किए जाने चाहिए। प्रत्येक एलिकोट के साथ पर्याप्त डेनैचिंग लैमडली नमूना बफर मिलाएं, और मिश्रण को 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। विश्लेषण तक ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और स्टोर करें।

  1. एस्चेरिचिया कोलाई में जीएसटी-सी2लैक्ट की अभिव्यक्ति
    1. 18 माइक्रोनल स्टरल पानी के साथ BL21 गोल्ड सक्षम कोशिकाओं के 20 माइक्रोल मिलाएं। फिर, बैक्टीरिया के साथ pGEX-C2लैक्ट प्लाज्मिड (~ 65 एनजी/μL पर) के 2 μL मिश्रण, और उन्हें इलेक्ट्रोपॉशन द्वारा बदलना। ऑटोक्लेव लेनोक्स लिसोजेनी-शोरबा (पौंड) माध्यम (10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन, 5 जी/एल यीस्ट एक्सट्रैक्ट, 5 जी/एल एनएसीएल इन डिओनाइज्ड वॉटर, ग्लूकोज-फ्री) के 150 माइक्रोन के साथ बैक्टीरिया को रीसुस्ट करें। बैक्टीरिया को 2 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें।
    2. एलबी माध्यम के 25 एमएल का टीका, 50 μg/mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक, 125 एमएल बाँझ एर्लेनमेयर फ्लास्क में बैक्टीरियल सस्पेंशन के 150 माइक्रोन के साथ। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में रखें, और बैक्टीरिया को 185 आरपीएम पर आंदोलन के साथ रात भर बढ़ने दें।
    3. 50 μg/mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक एलबी माध्यम के 500 मिलीएल के साथ दो बाँझ 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क भरें, और प्रीकल्चर निलंबन के 5 एमएल जोड़ें। बता दें कि बैक्टीरिया 220 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
    4. समय-समय पर 600 एनएम की तरंगदैर्ध्य (λ) पर निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें। जब ओडी ~ 0.6-0.7 के मूल्य तक पहुंचता है, तो जीएसटी-सी 2लैक्टकी अभिव्यक्ति शुरू करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क में 1 एम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगाल्टोप्यरानोसाइड (आईपीटीजी) के स्टॉक समाधान के 500 माइक्रोल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 185 आरपीएम पर फ्लैक्स हिलाएं।
    5. प्रत्येक फ्लास्क की सामग्री को पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज बोतल में स्थानांतरित करें। सेंट्रलाइज बैक्टीरिया को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4600 × जी पर 30 मिनट के लिए दो बोतलें। सुपरनेट को त्यागें, और प्रत्येक गोली को 50 मिलीलन में ठंडे फॉस्फेट-बफर खारा को फिर से रीसस्ट करें।
    6. प्रत्येक बोतल में निहित बैक्टीरियल सस्पेंशन को 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2300 पर 30 मिनट के लिए दो ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2300 × ग्राम पर सेंट्रलाइजकरें। सुपरनैंट निकालें, और ट्यूबों को स्टोर करें, जिनमें से प्रत्येक में -20 डिग्री सेल्सियस पर एक बैक्टीरियल गोली होती है।
  2. C2 का शुद्धिकरणलैक्ट
    1. बर्फ पर, 50 एमएल ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.4 और 150 एमएल एनएसीएल (इसके बाद टीएन बफर कहा जाता है) वाले बफर के 50 एमएल के साथ दो 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब भरें, पहले झिल्ली वैक्यूम फिल्ट्रेशन द्वारा फ़िल्टर और डिगैस्ड।
    2. प्रत्येक ट्यूब में लाइसिस बफर तैयार करने के लिए, हल्के सोनीशन या भंवर द्वारा टीएन बफर में एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड-फ्री प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल की एक गोली को भंग करें। अन्य एंटीप्रोटीज, (10 माइक्रोन बेस्टैटिन, 1 μg/mL पेपस्टेटिन ए, और 10 माइक्रोन फोमोफोरमिडॉन) जोड़ें। महत्वपूर्ण बात, 2 mM DTT के साथ बफर पूरक।
    3. प्रत्येक ट्यूब में 30 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए लाइसिस बफर के साथ, स्टेप 1.1.6 में तैयार बैक्टीरियल छर्रों वाले दो ट्यूबों को भरें, और धीरे-धीरे 10 मिनट के लिए बर्फ पर छर्रों को डिफ्रॉस्ट करें। प्रत्येक गोली को स्टेनलेस स्टील स्पैटुला से क्रश करें, और उन्हें ट्यूबों को और/या एक पिपेट नियंत्रक और 25 एमएल पिपेट के साथ आगे-पीछे पिपटिंग करके तब तक फिर से खर्च करें जब तक कि एक सजातीय निलंबन प्राप्त न हो जाए ।
    4. जलाशय के अंदर नमूने की 30 एमएल लोड करके और 1.6 बार के दबाव के साथ निरंतर मोड में एक ब्रेकिंग चक्र चलाकर प्रीकूल्ड सेल बाधित (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके लाइसिस करें। एक ही ट्यूब में lysate ले लीजिए, बर्फ पर ट्यूब रखें, और तुरंत आइसोप्रोपैनॉल में तैयार 200 m m m फिनाइलमिथाइलसुल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) के स्टॉक समाधान से 250 माइक्रोल जोड़ें।
    5. इसी प्रक्रिया के बाद दूसरे नमूने को Lyse करें। सेल बाधित को धोने के लिए लाइसिस बफर के शेष का उपयोग करें, और प्रत्येक लाइसेट (~ 30 एमएल) की मात्रा को 50 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करने के लिए धोने को इकट्ठा करें।
    6. प्रत्येक lysate 5 mM MgCl2के साथ पूरक, और डीएनए टुकड़ा करने के लिए DNAse I के 20 μg/mL जोड़ें और इस तरह नमूने की चिपचिपाहट को कम । 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। जेल विश्लेषण के लिए एक नमूना ले लीजिए।
    7. प्रत्येक 50 एमएल lysate को एक प्रीचिल्ड पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें (कुल मिलाकर दो, सामग्री की तालिकादेखें)। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज का उपयोग करके कम से कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 186,000 × ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    8. अपकेंद्रित्र कदम के समानांतर, ग्लूटाथिएक युक्त घोल के 1.4 एमएल को दो 50 एमएल शंकुकेंद्री ट्यूबों में 4% एगरेवर मोतियों को बांटते हैं, प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएम डीटीटी (टीएनडी बफर) के साथ पूरक टीएन बफर के 20 एमएल जोड़ें, 5 मिनट के लिए 1200 × जी पर सेंट्रलाइज करें, और सुपरनांट को त्यागें। इस वाशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं।
    9. बैक्टीरियल lysate के अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट से 30 माइक्रोन का नमूना निकालें, और प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब से सुपरनेट को एक संबंधित 50 एमएल शंकुकेंद्रितीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें साफ मोती होते हैं। जेल विश्लेषण के लिए, टीएनडी बफर के 50 एमएल के साथ अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में से एक में मलबे की गोली को फिर से खर्च करें, और 30 माइक्रोन नमूना एकत्र करें।
    10. एक सजातीय मनका निलंबन प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए एक रोटेटर पर ट्यूब रखें। एक खाली 25 एमएल क्रोमेटोग्राफी कॉलम में मनका निलंबन पूल। मोतियों को डिकेंट होने दें, और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा बफर और अनबाउंड प्रोटीन को हटा दें। विश्लेषण के लिए एल्यूएट से एक नमूना लें।
    11. टीएनडी बफर के 20 एमएल के साथ मोतियों को फिर से खर्च करें, और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा एल्यूएट एकत्र करें। मोतियों को पूरी तरह से धोने के लिए इस कदम को दो बार दोहराएं। एकत्र किए गए एलुएट्स को पूल करें, और आगे के विश्लेषण के लिए 30 माइक्रोन नमूना बनाए रखें।
      नोट: एक छोटी कमी के बाद, मनका निलंबन के ~ 2 एमएल की मात्रा, जिसमें जीएसटी-सी 2लैक्ट संलग्न है, कॉलम के नीचे तलछट।
    12. दो 2 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल बीड सस्पेंशन जोड़ें। 1.970 एमएल की अंतिम मात्रा में टीएनडी बफर के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें। आगे के विश्लेषण (B1 नमूने) के लिए एक ट्यूब से 30 μL नमूना लें। 0.02 यू/μL पर मानव थ्रोम्बिन प्रोटीज समाधान के स्टॉक समाधान से 10 एमसीएम सीएसीएल 2 समाधान और 25 माइक्रोनल जोड़ें।
    13. दो ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक रोटेटर पर रखें ताकि थ्रोम्बिन को C2 लैक्ट डोमेन से जीएसटी टैग को बंद करने की अनुमति दीजा सके। अगले दिन, प्रत्येक ट्यूब में, थ्रोम्बिन कार्रवाई को बाधित करने के लिए मनका निलंबन के साथ 200 mm PMSF समाधान के 10 माइक्रोल मिलाएं।
    14. 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें, और मोतियों को लेने के बिना, प्रत्येक ट्यूब से घुलनशील C2लैक्ट डोमेन शामिल हैं, सुपरनैंट इकट्ठा करें। सुपरनेटैंट्स को 2 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (E1 eluate) में पूल करें जो बर्फ पर रखा जाता है।
    15. मोतियों को फिर से खर्च करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में टीएनडी बफर का 1 एमएल जोड़ें, और उन्हें धोएं; दोहराने कदम 1.2.14। प्रोटीन की अधिकतम मात्रा ठीक करने के लिए तीन बार अधिक इस कदम को अंजाम। हर बार, एकत्र किए गए सुपरनेटेंट को एक नई 2 एमएल ट्यूब (E2, E3, E4, और E5 eluates) में पूल करें, और आगे के विश्लेषण के लिए एक एलिकोट लें। धोने के चरणों के अंत में, मनका निलंबन (aliquot B2) से एक aliquot ले लो।
    16. 15% एक्रिलामाइड जेल पर एसडीएस-पेज सेपरेशन द्वारा शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में एकत्र किए गए 30 माइक्रोन नमूनों का विश्लेषण करें।
    17. चरण1.2.14और 1.2.15 के दौरान एकत्र किए गए सभी सुपरनेटेंट (यानी ~ 10 एमएल) को 10 एमएल क्रोमेटोग्राफी कॉलम में एकत्र करके संभावित दूषित मोतियों को हटा दें। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से एल्यूएट लीजिए, और कॉलम के नीचे मोतियों को बनाए रखें।
    18. 3 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) और 2300 × जीकी अपकेंद्रित्र गति के साथ एक अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई का उपयोग करके सी 2लैक्ट नमूना को केंद्रित करें। प्रोटीन नमूने की मात्रा ~ 1 एमएल होने पर एकाग्रता प्रक्रिया को रोकें।
  3. NBD-C2 की तैयारी और शुद्धिलैक्ट
    1. टीएन बफर के साथ एक डीसल्टिंग कॉलम (सामग्री की तालिकादेखें) को बराबर करें। केंद्रित C2 लैक्ट नमूने के 1 मिलील के साथ कॉलम लोडकरें। नमूना पूरी तरह से जेल बिस्तर में प्रवेश करने के लिए अनुमति दें, कॉलम में हौसले से degassed DTT मुक्त टीएन बफर के १.५ एमएल जोड़ें, और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा एल्यूएट को 2 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें ।
    2. 300 माइक्रोन टीएन बफर की अंतिम मात्रा में एल्यूएट के 50 माइक्रोन को पतला करें, और शुद्ध टीएन बफर का उपयोग करके 230 से 450 एनएम तक एक अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें। 44,920 एम-1.सेमी-1के बराबर एक विलुप्त गुणांक ε पर विचार करते हुए, 280 एनएम पर मापा अवशोषण के आधार पर C2लैक्ट एकाग्रता का निर्धारण करें।
    3. एक NBD फ्लोरोफोर के साथ C2लैक्ट निर्माण लेबल करने के लिए, एन, एन केदस गुना मोलर अतिरिक्त के साथ प्रोटीन मिश्रण -dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल-4-yl) एथिलेंडीमाइन (IANBD बीच) ।
      1. 1 मिलीग्राम आईआईएनबीडी को निर्जल डिमेथाइलफार्मेमाइड (डीएमएफ) में भंग करें, यह ध्यान में रखते हुए कि C2लैक्ट निर्माण को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएमएफ की अंतिम मात्रा प्रोटीन नमूना मात्रा के 5% (v/v) से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
      2. IANBD को भंग करने के लिए DMF (VDMF)की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले फॉर्मूला 1का उपयोग करके प्रोटीन लेबल करने के लिए IANBD (एम, मिलीग्राम में व्यक्त) की आवश्यक राशि की गणना करें ।
        m = 10,000 × सी × वी × मेगावाटIANBD (1)
        जहां सी C2लैक्ट की एकाग्रता चरण १.३.२ में मापा जाता है, वी C2लैक्ट नमूने की मात्रा है, और MWIANBD फ्लोरोफोर (४२० ग्राम/मोल) का आणविक वजन है ।
      3. फॉर्मूले 2 (एम0= 1 के साथ) और 3का उपयोग करके वीडीएमएफ की गणना करें।
        VDMF= (m0/m)× VIANBD (2)
        VIANBD= 0.05 × V (3)
        जहां एम0 एमजी में IANBD पाउडर की मात्रा है, और वीIANBD C2लैक्ट नमूने में जोड़े जाने के लिए IANBD समाधान की मात्रा है।
      4. C2लैक्ट नमूने के लिए ताजा तैयार IANBD समाधान की मात्रा VIANBD जोड़ें, और प्रकाश से संरक्षित थर्मोमिक्सर का उपयोग करके 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 800-900 आरपीएम पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाएं। प्रतिक्रिया बर्फ पर 90 मिनट के लिए आगे बढ़ने दें। इस दौरान 10 एमएल टीएन बफर के साथ सेंट्रलाइज फिल्टर यूनिट (एमडब्ल्यूसीओ= 3 केडीए) को साफ करें।
    4. मुक्त IANBD निष्क्रिय करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए एल-सिस्टीन (10 गुना मोलर अतिरिक्त में IANBD के लिए) जोड़ें।
    5. एनबीडी-सी2लैक्ट समाधान में टीएन बफर के 15 एमएल जोड़ें, और एनबीडी-सी2लैक्ट समाधान को अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई में स्थानांतरित करें। 2300 × ग्रामपर अपकेंद्रित्र द्वारा प्रोटीन से अधिकांश मुफ्त एनबीडी को अलग करने के लिए नमूना को 2 मिलील तक केंद्रित करें। इस वॉशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं। 19,000 में 10 मिनट के लिए 2 एमएल स्नैप-कैप सेंट्रलाइज ट्यूब में नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर × 4 डिग्री सेल्सियस पर, और सुपरनैंट एकत्र करें।
    6. टीएन बफर के 300 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में एल्यूएट के 50 माइक्रोन को पतला करें। एकाग्रता प्रक्रिया के दौरान एकत्र किए गए एल्यूएट का उपयोग करके अवशोषण स्पेक्ट्रम को 230 से 650 एनएम तक रिकॉर्ड करें। λ = 280 और 495 एनएम और विलुप्त होने वाले गुणांक ε = 44,920 एम-1.सेमी -1 (प्रोटीन) और 25,000 एम-1 .सेमी-1(NBD फ्लोरो फ्लोरोफोर) पर अधिकतम अवशोषण का उपयोग करके NBD-C2लैक्ट एकाग्रता का निर्धारण करें।
      नोट: यदि दो एकाग्रता मूल्य एक जैसे हैं, तो यह इंगित करता है कि C2लैक्ट निर्माण NBD समूह के साथ 1:1 अनुपात पर लेबल किया गया है।
    7. यदि एनबीडी-सी 2लैक्ट एकाग्रता एनबीडी अवशोषण के माप से अनुमानित ट्राइप्टोफान (टीआरपी) अवशेषों के अवशोषण से अनुमानित एकाग्रता से अधिक है, तो मुफ्त एनबीडी को हटाने के लिए चरण 1.3.5 दोहराएं।
    8. फ्लैश-फ्रीजिंग के दौरान NBD-C2 लैक्ट निर्माण की रक्षा करने के लिए क्रायो-प्रोटेक्ट करने के लिए 10% (v/v) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिएनमूने में ग्लिसरोल जोड़ें। अंतिम प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    9. 0.5 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 50 माइक्रोल एलिकोट्स प्रोटीन तैयार करें। तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को फ्लैश-फ्रीज करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एनबीडी-पीएचएफएपी का शुद्धिकरण

नोट: पीएचएफएपी का उत्पादन और लेबल करने की प्रक्रिया एनबीडी-सी2लैक्ट के समान है, जब तक कि चरण 1.3.4 में एक अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई में NBD-C2लैक्ट समाधान का हस्तांतरण न हो जाए। इस चरण के बाद से, नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. एकाग्रता कदम के बाद, आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी प्रदर्शन करने से पहले 1 दिन से अधिक नहीं के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर NBD-PHFAPP के 2 ml रखें । आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी से पहले, सत्यापित करें कि ट्यूब के नीचे कोई नारंगी जमा (एकाग्रता के दौरान एकत्रीकरण) नहीं है। यदि ऐसा है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 540,× ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र करें, और आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी द्वारा सुपरनेट को शुद्ध करें।
    नोट: आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी क्रॉसलिंक्ड डेक्सट्रान-एक्रिलैमाइड कोपॉलिमर (सामग्री की तालिकादेखें), पहले टीएनडी बफर के साथ समतुल्य, एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करके (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पैक किए गए कॉलम पर किया जाता है। कॉलम प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर का उपयोग किया गया था, और एनबीएड-पीएचएफएपी निर्माण के उन्मूलन के बाद कॉलम निकास पर λ = 280 (प्रोटीन) और ४८० एनएम (एनबीडी) पर अवशोषण की रिकॉर्डिंग की गई थी ।
    1. कॉलम पर 2 एमएल इंजेक्शन लूप में लोड किए गए एनबीडी-पीएचएफएपी नमूने को इंजेक्ट करें, और तुरंत एल्यूएट के 2.5 एमएल अंश एकत्र करें।
  2. 15% एसडीएस-पेज जेल पर 280 और 480 एनएम पर पाए गए मुख्य चोटी के अनुरूप सभी अंशों का विश्लेषण करें। जेल पर हीटिंग और लोड होने से पहले 15 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अंश का 25 माइक्रोन नमूना मिलाएं।
    नोट: एक मुख्य चोटी, जो एक साथ λ = 280 और 480 एनएम पर पता चला है, एक बार कॉलम के माध्यम से ~ 150 एमएल बफर की मात्रा पारित हो जाती है।
  3. उन अंशों को पूल करें जिनमें विशेष रूप से एनबीडी-पीएचएफएपी प्रोटीन (~ 12.2 केडीए) होता है, और 10% (v/v) की अंतिम एकाग्रता पर ग्लिसरोल जोड़ें। 2300 × जीकी अपकेंद्रित्र गति का उपयोग करके 1 मिलियन की अंतिम मात्रा में 3 केडीए के MWCO के साथ एक सेंट्रलफ्यूगल फिल्टर यूनिट का उपयोग करके नमूना केंद्रित करें।
  4. एलिकोट तैयार करें, और NBD-C2 लैक्ट के लिए वर्णित एक अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्डकरें। λ = 280 एनएम पर मापा अवशोषण के आधार पर प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक विलुप्त गुणांक ε = 29,450एम-1 .सेमी-1 का उपयोग करें।

3. पीएस और पीआई (4) पी निष्कर्षण या स्थानांतरण परख के लिए लिपोसोम की तैयारी

नोट: कमरे के तापमान पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। सावधानी के साथ कार्बनिक सॉल्वैंट्स, रोटावापोर और तरल नाइट्रोजन को संभालें।

  1. ताजा, फ़िल्टर, और degassed 50 mM 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) - 1- piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (KOH), पीएच 7.4, 120 m पोटेशियम एसीटेट (एचके) बफर तैयार करें।
  2. प्रत्येक प्रकार के लिपोसोम के लिए, स्टॉक समाधानों से विभिन्न लिपिड की सटीक मात्रा लें, और उन्हें 25 एमएल नाशपाती के आकार के ग्लास फ्लास्क(टेबल 1)में मिलाएं। प्रत्येक मिश्रण की मात्रा को 1 एमएल में समायोजित करने के लिए शुद्ध क्लोरोफॉर्म जोड़ें। लिपोसोम नाम के साथ प्रत्येक फ्लास्क लेबल। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ रोड-पीई के साथ लिपिड मिश्रण युक्त फ्लैक्स लपेटें।
  3. फ्लास्क को रोटरी वाष्पीकरण पर रखें। लिपिड को वैक्यूम के नीचे और 500 आरपीएम की रोटेशन गति से कम से कम 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं। लिपिड फिल्मों के लिए जिसमें पीआई (4) पी होता है, कोमल रोटेशन के तहत 5 मिनट के लिए 32-34 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को प्रीवार्म करें, सॉल्वेंट को हटाने के लिए फ्लास्क में वैक्यूम बनाने से पहले अन्य लिपिड के साथ PI (4) पी को ठीक से मिलाएं, जो फ्लास्क वॉल पर सूखे लिपिड की एक फिल्म को पीछे छोड़ देंगे ।
  4. वाष्पीकरण से फ्लास्क डिस्कनेक्ट करें, और सॉल्वेंट के किसी भी शेष निशान को हटाने के लिए इसे 45 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष में रखें। एचके बफर के 2 एमएल के साथ फ्लास्क भरें, और समाधान में कुछ 4 मिमी व्यास वाले ग्लास मोती जोड़ें। लिपिड को फिर से रीसुस्ट करने और 4 एमएम की लिपिड एकाग्रता के साथ मल्टीलैमलर लिपिड वेसिकल्स (एमएलवी) तैयार करने के लिए 2 मिनट के लिए फ्लास्क को धीरे से भंवर दें। 1.5 एमएल स्क्रू-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एमएलवी के 0.5 एमएल एलिकोट्स तैयार करें।
  5. फ्रीज-गल ट्यूब5x (तरल नाइट्रोजन और एक पानी स्नान का उपयोग करके क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस पर)। लिपोसोम को बाहर निकालें या उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार एमएलवी से लिपोसोम(यानी, बड़े यूनिलैमलर वेसिकल्स) तैयार करने के लिए एक मिनी एक्सट्रूडर का उपयोग करें। 200 एनएम व्यास के समान बेलनाकार छिद्रों के साथ पॉली कार्बोनेट फिल्टर का उपयोग करें।
  7. प्रत्येक प्रकार के लिपोसोम को तैयार करने के लिए, MLVs के संबंधित निलंबन के कम से कम 250 माइक्रोन को बाहर निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर और अंधेरे में अगर उनमें रोड-पीई होता है तो एक्सट्रूडेड लिपोसोम को स्टोर करें। 2 दिन के अंदर लिपोसोम्स का इस्तेमाल करें।
लिपिड संरचना (मोल/मोल) लिपिड
लिपोसोम नाम डीओपीसी
(25 मिलीग्राम/एमएल)		 चबूतरे
(10 मिलीग्राम/एमएल)		 16:0 Liss रोड-पीई
(1 मिलीग्राम/एमएल)		 C16:0/C16:0-PI (4) पी
(1 मिलीग्राम/एमएल)
निष्कर्षण परख लिपोसोम 2 मोल% पीएस पीसी/पीएस 98/2 247 माइक्रोल 12.5 माइक्रोल
लिपोसोम 2 मोल% पीआई (4) पी पीसी/पीआई (4) पी 98/2 247 माइक्रोल 153 माइक्रोल
पीसी लिपोसोम पीसी 100 252 माइक्रोल
परिवहन परख एलए  पीसी/पीएस/रोड-पीई 93/5/2 234 माइक्रोल 31.4 माइक्रोन 200 माइक्रोल
पी एस के बिना एलए पीसी/रोड-पीई 98/2 247 माइक्रोल 200 माइक्रोल
एलबी  पीसी/पीआई (4) पी 95/5 237 माइक्रोल 383 माइक्रोल
पीआई (4) पी के बिना एलबी पीसी 100 252 माइक्रोल
एलए-ईक्यू पीसी/पीएस/PI (4) पी/रोड-पी 93/2.5/2.5/2 234 माइक्रोल 15.7 माइक्रोन 200 माइक्रोल 191 माइक्रोल
एलबी-ईक्यू पीसी/पीएस/पीआई (4) पी 95/2.5/2.5 239 माइक्रोल 15.7 माइक्रोन 191 माइक्रोल

तालिका 1: लिपिड स्टॉक समाधानों की मात्रा लिपिसोम तैयारी के लिए मिश्रित की जानी चाहिए। संक्षिप्त रूप: पीएस = फॉस्फेटिडिलसेरीन; पीसी = फॉस्फेटिडिलकोलिन; पीआई (4) पी = फॉस्फेटिलिनोसिटोल 4-फॉस्फेट; रोड-पीई = रोडामाइन-लेबल वाले फॉस्फेटिडिलथेनथेनमाइन; DOPC = डाइयोलोफॉस्फेटिलकोलिन; चबूतरे = 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-ग्लिसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन; 16:0 Liss रोड-पीई = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-फॉस्फोएथेनोलामाइन-एन-(लिस्समीन रोडामाइन बी सल्फोनिल) ।

4. पीएस या पीआई (4) पी निष्कर्षण का माप

नोट: माप एक काले ९६ अच्छी तरह से थाली और मोनोक्रोमेटर से लैस एक फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर का उपयोग कर आयोजित किया जाना चाहिए: फ्लोरेसेंस उत्तेजन के लिए एक और उत्सर्जन के लिए एक, एक चर बैंडविड्थ के साथ ।

  1. 1 एमएमएम एमजीसीएल2 (एचकेएम बफर) के साथ ताजा, फ़िल्टर और डिगैस्ड एचके बफर तैयार करें। 2 मोल% पीएस या 2 मोल% पीआई (4) पी (4 एमएम अंतिम लिपिड एकाग्रता, तालिका 1देखें) के साथ शुद्ध पीसी लिपोसोम और पीसी लिपोसोम तैयार करें।
    नोट: पूरे प्रयोग में कमरे के तापमान पर निकाले गए लिपोसोम्स के निलंबन से भरे ट्यूबों को रखें, और प्रोटीन को बर्फ पर रखें। इसके अतिरिक्त, लिपिड सेंसर को प्रकाश से बचाएं।
  2. पीएस निष्कर्षण परख के लिए, एक अच्छी तरह से, 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में NBD-C2लैक्ट (250 एनएम अंतिम एकाग्रता) के साथ 2 मोल% पीएस (80 माइक्रोन अंतिम लिपिड एकाग्रता, 0.8 माइक्रोन सुलभ पीएस एकाग्रता) वाले लिपोसोम मिलाएं। एक सकारात्मक नियंत्रण या ब्याज के प्रोटीन के रूप में 3 μM LTP (Osh6p) के साथ मिश्रित लिपोसोम (80 माइक्रोन, 2 मोल% पीएस) और NBD-C2लैक्ट (250 एनएम) की एक ही मात्रा के साथ एक दूसरे अच्छी तरह से भरें।
    नोट: 5 मिनट का एक इनक्यूबेशन समय Osh6p लिपिड निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
  3. शुद्ध पीसी लिपोसोम (80 माइक्रोन) के साथ मिश्रित NBD-C2लैक्ट (250 एनएम) के साथ एक तिहाई अच्छी तरह से भरें। केवल शुद्ध पीसी लिपोसोम (80 माइक्रोन) के साथ एक चौथाई अच्छी तरह से भरें। चार कुओं की तीन अतिरिक्त श्रृंखला तैयार करने के लिए कदम 4.2-4.3 दोहराएं।
  4. प्रत्येक कुएं के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर 490 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) पर 505 से 650 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) तक एक एनबीडी स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें। प्रत्येक श्रृंखला के लिए, अन्य स्पेक्ट्रा से केवल लिपोसोम के साथ दर्ज स्पेक्ट्रम को घटाएं।
    नोट: एफ और एफअधिकतम क्रमशः एलएलपी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पीएस युक्त लिपोसोम्स के साथ मापा गया 536 एनएम पर तीव्रता के अनुरूप है, जबकि एफ0 शुद्ध पीसी लिपोसोम के साथ एक ही तरंग दैर्ध्य पर तीव्रता है। प्रत्येक श्रृंखला के लिए, प्रोटीन द्वारा निकाले जाने वाले सुलभ पीएस का प्रतिशत निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके दिया जाता है।
    100 × (1-(एफ-एफ0)/(एफमैक्स-एफ0)))(4)
  5. पीआई (4) पी निष्कर्षण परख के लिए, 2 मोल% पीआई (4) पी के साथ लीपोसोम तैयार करें, और एनबीडी-पीएचएफएपी जांच के साथ माप करें। नियंत्रण प्रयोग करें और निष्कर्षण प्रतिशत को उसी तरह निर्धारित करें जैसे ऊपर वर्णित है।
    नोट: लिपोसोम और प्रोटीन एकाग्रता पीएस निष्कर्षण परख में उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान हैं।

5. पीएस परिवहन का वास्तविक समय माप

नोट: तापमान नियंत्रित सेल धारक और चुंबकीय उभारक से लैस एक मानक फ्लोरीमीटर (90 डिग्री प्रारूप) का उपयोग लिपिड ट्रांसफर काइनेटिक्स रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। डेटा को सही ढंग से प्राप्त करने के लिए, एक ही तापमान पर नमूने को स्थायी रूप से बनाए रखना महत्वपूर्ण है (प्रोटीन(जैसे,खमीर या मानव) की उत्पत्ति के आधार पर 25 और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच सेट करें) और इसे लगातार हलचल करने के लिए। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक बेलनाकार क्वार्ट्ज सेल में निहित 600 माइक्रोल नमूने में लिपिड परिवहन के माप के लिए है।

  1. हौसले से degassed और फ़िल्टर एचकेएम बफर तैयार करें। कमरे के तापमान पर बाहर निकाले गए लिपोसोम युक्त ट्यूब रखें। एल्यूमीनियम पन्नी में रोड-पीई के साथ लिपोसोम युक्त ट्यूबों को लपेटें, और/या किसी भी फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए उन्हें एक अपारदर्शी बॉक्स में स्टोर करें ।
  2. λ = 460 एनएम (एक छोटी बैंडविड्थ (1-3 एनएम) पर और λ = 530 एनएम (एक बड़े बैंडविड्थ (≥ 10 एनएम) पर क्रमशः उत्तेजन और उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर को समायोजित करें। 1 एस के ≤ एक समय संकल्प के साथ 25 मिनट पर अधिग्रहण समय निर्धारित करें।
  3. क्वार्ट्ज क्यूवेट में, एलए लिपोसोम सस्पेंशन के 30 माइक्रोन और प्रीवार्मेड एचकेएम बफर में NBD-C2लैक्ट स्टॉक समाधान की मात्रा को 570 माइक्रोन नमूना तैयार करने के लिए पतला करें जिसमें 200 μM कुल लिपिड और 250 एनएम एनबीडी-सी 2लैक्टशामिल हैं। एक छोटा सा चुंबकीय सरगर्मी बार जोड़ें, और फ्लोरोमीटर धारक में क्यूवेट की स्थिति।
  4. एक बार जब नमूना थर्मल रूप से समतुल्य (3-5 मिनट के बाद) हो जाता है, तो माप को ट्रिगर करें। 1 मिनट के बाद, नमूने में एलबी लिपोसोम सस्पेंशन (200 माइक्रोन कुल लिपिड की अंतिम एकाग्रता) के 30 माइक्रोन जोड़ें। 3 मिनट के बाद, नमूने में एलटीपी इंजेक्ट करें ताकि एलटीपी की अंतिम एकाग्रता 200 एनएम हो, और शेष 21 मिनट के लिए सिग्नल प्राप्त कर सके।
  5. एनबीडी सिग्नल को सामान्य बनाने के लिए एक समानांतर प्रयोग करें। एचकेएम बफर (570 माइक्रोन की अंतिम मात्रा) में 250 एनएम एनबीडी-सी2लैक्ट के साथ एलए-ईक्यू लिपोसोम सस्पेंशन का 30 माइक्रोन मिक्स कर लें। 1 मिनट के बाद, एलबी-ईक्यू लिपोसोम निलंबन के 30 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    नोट: एलए-ईक्यू और एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स की लिपिड संरचना स्थानांतरण परख में उपयोग किए जाने वाले एलए और एलबी लिपोसोम के समान हैं, सिवाय इसके कि उनमें से प्रत्येक में 2.5 मोल% पीएस और 2.5 मोल% पीआई (4) पी शामिल हैं। नतीजतन, एनबीडी सिग्नल जिसे मापा जाता है, जिसे एफईक्यूके रूप में जाना जाता है, उस संकेत से मेल खाता है जिसे मापा जाना चाहिए यदि पीएस को स्थानांतरण प्रक्रिया द्वारा एलए और एलबी लिपोसोम्स के बीच पूरी तरह से बराबरी की जानी चाहिए।
  6. समय के साथ एल ए से एलबी लिपोसोम्स में स्थानांतरित पीएस (माइक्रोन में) की मात्रा निर्धारित करने के लिए ब्याज कीएलटीपी के साथ मापा गतिज घटता परिवर्तित करें। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके वक्र के प्रत्येक डेटा बिंदु (एफ) को सामान्य करें।
    एफनॉर्म = (एफ-एफ0)/(एफईक्यू-एफ0)(5)
    जिसमें एफ0 एक एलटीपी के अलावा से ठीक पहले एनबीडी सिग्नल से मेल खाती है, और एफईक्यू चरण 5.5 में मापा गया सिग्नल है।
    नोट: एलए से एलबी लिपोसोम्स में स्थानांतरित पीएस (μM में) की मात्रा 2.5 × एफनॉर्मसे मेल खाती है, यह देखते हुए कि संतुलन उस स्थिति से मेल खाता है जहां एक आधा सुलभ पी एसयूएस अणुओं से मेल खाता है, एलए लिपोसोम्स के बाहरी पत्रक में निहित,(यानी,0.5 × 200 माइक्रोन कुल लिपिड) के 5 मोल% के अनुरूप एलबी लिपोसोम्स में स्थानांतरित कर दिया गया है।

6. पीआई (4) पी परिवहन का वास्तविक समय माप

  1. फ्लोरीमीटर (उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, बैंडविड्थ, अधिग्रहण समय, समय संकल्प) सेट करें जैसा कि पीएस हस्तांतरण परख के लिए किया जाता है। इसी तरह, एक ही तापमान पर लगातार सरगर्मी के तहत प्रयोगों को करने के लिए एक ही बफर, क्यूवेट और लिपोसोम का उपयोग करें।
  2. क्यूवेट में, 570 माइक्रोन (200 माइक्रोन कुल लिपिड, 250 एनएम एनबीडी-एफएचएपी) की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रीवार्मेड एचकेएम बफर के साथ एलबी लिपोसोम सस्पेंशन और एनबीडी-पीएचएफएपी के 30 माइक्रोनमिलाएं। एक बार जब नमूने का थर्मल संतुलन पहुंच जाता है, तो माप शुरू करें, और 1 मिनट के बाद, एलए लिपोसोम निलंबन के 30 माइक्रोन इंजेक्ट करें। 3 मिनट के बाद, ब्याज की एलटीपी (200 एनएम की अंतिम एकाग्रता) इंजेक्ट करें, और सिग्नल रिकॉर्ड करें।
  3. एनबीडी सिग्नल को सामान्य करने के लिए दूसरा प्रयोग करें। एचकेएम बफर के 570 माइक्रोन में 250 एनएम एनबीडी-पीएचएफएपी के साथ एलबी-ईक्यू लिपोसोम सस्पेंशन का 30 माइक्रोन मिक्स करें। 1 मिनट के बाद, एलए-ईक्यू लिपोसोम निलंबन के 30 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    नोट: यहां, NBD संकेत, एफEqके रूप में संदर्भित, एक है जो अगर PI (4) पी पूरी तरह से एलए और एलबी लिपोसोम्स के बीच तुल्य था मापा जाना चाहिए से मेल खाती है ।
  4. समय के साथ एलबी से एलए लिपोसोम में स्थानांतरित पीआई (4) पी (μM में) की मात्रा निर्धारित करने के लिए गतिज घटता परिवर्तित करें। प्रत्येक डेटा बिंदु (एफ) को फॉर्मूला 5 का उपयोग करके सामान्यीकृत किया जाता है जिसमें एफ0 एलटीपी के अलावा से पहले एनबीडी सिग्नल से मेल खाता है, और एफईक्यू चरण 6.3 में मापा गया संकेत है।
    नोट: एलबी से एलए लिपोसोम्स में स्थानांतरित पीआई (4) पी (μM में) की राशि 2.5 × एफनॉर्मसे मेल खाती है, यह देखते हुए कि संतुलन उस स्थिति से मेल खाता है जहां एलबी लिपोसोम्स के बाहरी पत्रक में निहित पीआई (4) पी का आधा हिस्सा(यानी, 0.5 × 5 माइक्रोनएम) एलए लिपोसोम्स में स्थानांतरित किया गया है।

7. काइनेटिक्स वक्र्स का विश्लेषण

  1. यह निर्धारित करें कि एलटीपी किस गति से कुशल है, यह निर्धारित करके कि यह एलटीपी अपने इंजेक्शन के बाद पहले कुछ सेकंड में लिपिड को एक लिपिसोम आबादी से दूसरे में स्थानांतरित करता है।
    1. ढलान प्राप्त करने के लिए स्थानांतरण काइनेटिक्स के पहले डेटा बिंदुओं का रैखिक प्रतिगमन करें। प्रति प्रोटीन प्रति प्रोटीन प्रति समय इकाई (न्यूनतम या एस) स्थानांतरित लिपिड अणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में एलटीपी एकाग्रता द्वारा ढलान मूल्य को विभाजित करें।

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Representative Results

Figure 1
चित्रा 1:फ्लोरोसेंट लिपिड सेंसर और इन विट्रो परख का विवरण। (A)बीबीडी-सी2लैक्ट और एनबीडी-पीएचएफएपी के त्रि-आयामी मॉडल गोजातीय लैक्टाडेरिन (पीडीबी आईडी: 3बीएन648)के सी 2 डोमेन की क्रिस्टल संरचना और मानव FAPP1 प्रोटीन के पीएच डोमेन की एनएमआर संरचना (पीडीबी आईडी: 2KCJ46)के आधार पर। एक एन, एन'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1,3-डायजोल-4-yl) ethylenediamine moiety, मैन्युअल रूप से और ऊर्जावान रूप से कम से कम बनाया गया, C352 (NBD-C2लैक्ट)और C13 (NBD-PHFAPP)अवशेषों (क्षेत्रों के रूप में प्रतिनिधित्व, हरे रंग में कार्बन के साथ, नीले रंग में नाइट्रोजन, लाल में ऑक्सीजन, पीले रंग में सल्फर, और सफेद में हाइड्रोजन) के थिओल समारोह पर ग्राफ्ट किया गया था। प्रत्येक जांच की लिपिड-बाध्यकारी साइट की सतह नीले रंग में रंगी हुई थी। (ख)निष्कर्षण परखता है । पीएस एक्सट्रैक्ट परख में पीसी/पीएस लिपोसोम्स (98/2 मोल/मोल) को २५० एनएम NBD-C2लैक्टके साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । निष्कर्षण के अभाव में, जांच दृढ़ता से लिपोसोम्स के लिए बाध्य है, जिसके परिणामस्वरूप NBD फ्लोरेसेंस का नीला बदलाव और इसकी उत्सर्जन तीव्रता में वृद्धि हुई है । यदि पीएस निष्कर्षण एक एलटीपी(जैसे, Osh6p) की उपस्थिति में हुआ, जांच लिपोसोम्स से अलग हो गई, और इसकी फ्लोरेसेंस कम थी। पीआई (4) पी निष्कर्षण परख में, लिपोसोम्स को 2 मोल% पीआई (4) पी के साथ डॉप किया गया था, और 250 एनएम NBD-PHFAPP का उपयोग किया गया था। (ग)FRET आधारित लिपिड परिवहन परख । पीएस ट्रांसपोर्ट परख में पीसी/पीएस/रोड-पीई लिपोसोम्स (93/5/2 मोल/मोल, एलए)को २५० एनएम NBD-C2लैक्टके साथ इनक्यूबेटेड किया गया । पीसी लिपोसोम्स (एलबी),5 मोल% पीआई (4) पी के साथ डॉप्ड या नहीं, और ओश 6पी को क्रमशः टी = 1 मिनट और टी = 4 मिनट में क्रमिक रूप से जोड़ा गया था। यदि पीएस परिवहन होता है, तो यह एलए से एलबी लिपोसोम्स तक NBD-C2लैक्ट के स्थानांतरण के अनुरूप एनबीडी सिग्नल का एक डीक्विंग प्रकाश में आता है । पीआई (4) पी परिवहन परख में, एलबी लिपोसोम्स 5 मोल% पीआई (4) पी के साथ 250 एनएम NBD-PHFAPPके साथ इनक्यूबेटेड थे। पीसी लिपोसोम्स (एलए)5 मोल% पीएस के साथ डॉप्ड या नहीं जोड़े गए। यदि पीआई (4) पी परिवहन होता है, तो एलबी से एलए लिपोसोम्स तक एनबीडी-पीएचएफएपी के स्थानांतरण के कारण एनबीडी सिग्नल की शमन होती है। संक्षिप्त नाम: NBD = 7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल फ्लोरोफोर; एनएमआर = परमाणु चुंबकीय अनुनाद; FAPP1 = चार-फॉस्फेट-एडाप्टर प्रोटीन 1; पीडीबी = प्रोटीन डेटा बैंक; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरीन; पीसी = फॉस्फेटिडिलकोलिन; एलटीपी = लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन; Osh6p = ऑक्सीस्टेरोल-बाइंडिंग प्रोटीन (OSBP) 6 प्रोटीन का समरूप; पीआई (4) पी = फॉस्फेटिलिनोसिटोल 4-फॉस्फेट; FRET = फ्लोरेसेंस प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण; रोड-पीई = रोडामाइन-लेबल वाले फॉस्फेटिडिलथेनथेनमाइन; एलएक लिपोसोम्स = पीसी से बना लिपोसोम्स, 2 मोल% रोड-पीई के साथ डॉप्ड, और 5 मोल% पीएस युक्त या नहीं; एलबी लिपोसोम्स = लिपोसोम्स में शामिल 5 मोल% PI (4) P. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2A सी 2 लैक्ट के शुद्धिकरण के लिए अग्रणी विभिन्न चरणों के उत्पादों का एक एसडीएस-पेज विश्लेषणदिखाताहै। लेन 1 जीएसटी-सी2लैक्ट (~44.8 केडीए) को व्यक्त करने वाले lysed बैक्टीरिया के प्रोटीन प्रोफाइल को दर्शाता है, जबकि लेन 2 और 3 क्रमशः अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के बाद सुपरनैंट और बैक्टीरियल मलबे के प्रोटीन प्रोफाइल दिखाते हैं । इन लेनों की तुलना से पता चलता है कि जीएसटी-सी2लैक्ट को सुपरनैंट में बरामद किया गया है और इस तरह ग्लूटाथिएक से जुड़े एगरेग मोतियों का उपयोग करके अलग-थलग किया जा सकता है। लेन 4 और 5 मोतियों और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा बरामद धोता के साथ इनक्यूबेशन के बाद सुपरनिटेंट के प्रोटीन प्रोफाइल दिखाते हैं, जबकि लेन 6 प्रोटीन की प्रोफाइल दिखाता है जो मोतियों पर बनाए रखा गया है । इन गलियों के विश्लेषण से पता चलता है कि मोतियों से लगभग सभी जीएसटी-सी2लैक्ट बरामद किए गए हैं।

लेन 8-12 थ्रोम्बिन उपचार के बाद मोतियों की लगातार धोती के माध्यम से बरामद सुपरनेटेंट में C2लैक्ट (~ 17.9 केडीए) के अनुरूप एक प्रमुख बैंड की उपस्थिति दिखाते हैं। लेन 13 इंगित करता है कि जीएसटी (~ 26.9 केडीए) के साथ-साथ गैर-क्लीव्ड जीएसटी-सी 2लैक्ट,इस उपचार के बाद मोतियों के लिए बाध्य रहा। इन गलियों की तुलना इंगित करता है कि दरार प्रक्रिया, हालांकि १००% कुशल नहीं है, C2Lact है कि तो फ्लोरोसेंटी लेबल था उपज था । चित्रा 2B NBD के साथ लेबल C2लैक्ट के एक पराबैंगनी (यूवी) दिखाई अवशोषण स्पेक्ट्रम दिखाता है । चूंकि निर्माण 100% शुद्ध है, इन परिणामों से पुष्टि होती है कि सभी C2लैक्ट अणुओं को 280 एनएम (टीआरपी) और 495 एनएम (एनबीडी) पर मापा गया ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर एक NBD समूह के साथ लेबल किया गया था। NBD-C2लैक्ट की शुद्धता और इसकी फ्लोरेसेंस का निर्धारण एसडीएस-पेज विश्लेषण(चित्रा 2C)द्वारा किया गया था।

Figure 2
चित्र 2:NBD-C2लैक्ट शुद्धिकरण। (A)SDS-PAGE विश्लेषण लेबलिंग से पहले शुद्धिकरण प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में प्रोटीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एरोहेड अकेले जीएसटी (ग्रे एरोहेड) के C2लैक्ट डोमेन (लाल एरोहेड), और जीएसटी-सी 2 लैक्ट निर्माण (ब्लैक एरोहेड) की स्थिति का संकेतदेते हैं। (ख) एनबीडी-सी 2लैक्टका यूवी-विजिबल अवशोषण स्पेक्ट्रम । (ग) शुद्ध NBD-C2Lactका एसडीएस-पेज विश्लेषण । पहली छवि को बिना धुंधला किए यूवी रोशनी के तहत अधिग्रहीत किया गया था और NBD-C2लैक्ट निर्माण की उपस्थिति का पता चलता है क्योंकि यह फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करता है। दूसरी छवि प्रोटीन धुंधला प्रक्रिया के बाद एक ही जेल दिखाती है (सामग्री की तालिकादेखें)। संक्षिप्त नाम: NBD = 7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल फ्लोरोफोर; NBD-C2लैक्ट = N, N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1,3-डायजोल-4-yl) गोजातीय लैक्टाडेरिन (पीडीबी आईडी: 3बीएन648)के C2 डोमेन के पुनर्जंमित संस्करण के C352 अवशेषों के थिओल फ़ंक्शन से जुड़े एथिलेंडाइमाइन मोइसिटी); पीडीबी = प्रोटीन डेटा बैंक; SDS-पेज = सोडियम डॉडेकाइल्सुल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस; जीएसटी = ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफर; मेगावाट = आणविक वजन आकार मार्कर; यूवी = पराबैंगनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3 Osh6p का उपयोग कर पीएस और पीआई (4) पी निष्कर्षण परख से परिणाम दिखाता है । जब केवल 2 मोल% पीएस युक्त लिपोसोम्स के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है, तो एनबीडी-सी2लैक्ट का फ्लोरेसेंस अधिकतम था क्योंकि एनबीडी फ्लोरोफोर झिल्ली(यानी, एक हाइड्रोफोबिक संदर्भ) में डाला गया था, यह दर्शाता है कि सेंसर झिल्ली से बंधा हुआ था। Osh6p की उपस्थिति में, फ्लोरेसेंस कम था और शुद्ध पीसी लिपोसोम (चित्रा 3 ए)के साथ मापा गया था। 536 एनएम पर तीव्रता मूल्यों के सामान्यीकरण ने संकेत दिया कि सुलभ पीएस का ~ 75% निकाला गया था। दूसरी परख में एनबीडी-पीएचएफएपी को लिपोसोम्स के साथ मिलाया गया जिसमें 2 मोल% पीआई (4) पी शामिल थी । NBD संकेत Osh6p के बिना उच्च था, लेकिन कम जब Osh6p मौजूद था और है कि PI (4) पी मुक्त liposomes(चित्रा 3B)के साथ मापा के समान था । तीव्रता के विश्लेषण से पता चला है कि एलटीपी द्वारा ~ 100% सुलभ पीआई (4) पी निकाली गई थी।

Figure 3
चित्र 3:निष्कर्षण परखता है। (A)NBD-C2लैक्ट (250 एनएम) के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा को लिपोसोम्स (80 माइक्रोन, 2 मोल% पीएस) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 460 एनएम पर उत्तेजन पर मापा जाता है। संदर्भ स्पेक्ट्रा को शुद्ध पीसी लिपोसोम्स के साथ दर्ज किया गया था या NBD-C2लैक्ट (बाएं पैनल) के साथ नहीं। कई स्पेक्ट्रा कुओं की विभिन्न श्रृंखलाओं से दर्ज किए गए थे, जो अकेले डीओपीसी लिपोसोम्स से पृष्ठभूमि बिखरने के संकेत को घटाकर सही किए गए थे और औसत (एन = 4, ± एसईएम) । निकाले गए सुलभ पीएस का प्रतिशत इंगित किया गया है (सही पैनल)। (ख)एनबीडी-पीएचएफएपी (250 एनएम) का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा लिपोसोम्स (80 माइक्रोन, 2 मोल% पीआई (4) पी) के साथ मिलाया गया 3 माइक्रोन Osh6p की अनुपस्थिति या उपस्थिति में। सेंसर की उपस्थिति और अनुपस्थिति में पीसी लिपोसोम्स के साथ दर्ज संदर्भ स्पेक्ट्रा (बाएं पैनल) दिखाए जाते हैं। कई स्पेक्ट्रा कुओं की विभिन्न श्रृंखलाओं से दर्ज किए गए थे, जो अकेले डीओपीसी लिपोसोम्स से पृष्ठभूमि बिखरने के संकेत को घटाकर सही किए गए थे और औसत (एन = 4, ± एसईएम) । निकाले गए सुलभ पीआई (4) पी का प्रतिशत इंगित किया गया है (सही पैनल)। संक्षिप्त नाम: NBD = 7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल फ्लोरोफोर; NBD-C2लैक्ट = N, N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1,3-डायजोल-4-yl) गोजातीय लैक्टाडेरिन (पीडीबी आईडी: 3बीएन648)के C2 डोमेन के पुनर्जंमित संस्करण के C352 अवशेषों के थिओल फ़ंक्शन से जुड़े एथिलेंडाइमाइन मोइसिटी); पीडीबी = प्रोटीन डेटा बैंक; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरीन; पीसी = फॉस्फेटिडिलकोलिन; DOPC = डाइयोलोफॉस्फेटिलकोलिन; Osh6p = ऑक्सीस्टेरोल-बाइंडिंग प्रोटीन (OSBP) 6 प्रोटीन का समरूप; पीआई (4) पी = फॉस्फेटिलिनोसिटोल 4-फॉस्फेट; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; a.u. = मनमाने ढंग से इकाइयों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4A एक LTP के रूप में Osh6p का उपयोग कर एक पीएस हस्तांतरण परख से विशिष्ट परिणाम दिखाता है । समय शून्य, NBD-C2लैक्ट को एलए लिपोसोम्स के साथ मिलाया गया था जिसमें 5 मोल% 16:0/18:1-पीएस (चबूतरे) और 2 मोल% रोड-पीई 30 डिग्री सेल्सियस पर एचकेएम बफर के 570 माइक्रोन की मात्रा में होते हैं। के रूप में जांच एलएक liposomes के लिए बाध्य, इसके संकेत इन liposomes में मौजूद रोड-पीई के साथ FRET के कारण बुझा दिया गया था । एक मिनट के बाद, रोड-पीई-फ्री एलबी लिपोसोम्स (30 माइक्रोन) जोड़े गए; यह केवल इस दूसरी liposome आबादी और/या एक कमजोर पड़ने प्रभाव द्वारा प्रकाश प्रसार के कारण संकेत में एक मामूली परिवर्तन प्रकाश में लाना की उंमीद थी । एलबी लिपोसोम्स के जोड़ के बाद सिग्नल की तीव्रता एफ0से मेल खाती है । रिएक्शन मिक्स में प्रोटीन के 200 एनएम को पतला करने के लिए ओश 6पी (आमतौर पर 40 एनएम) के स्टॉक समाधान के कुछ μL के इंजेक्शन ने फ्लोरोफोर के डीवंचन के कारण एनबीडी सिग्नल में धीमी वृद्धि की क्योंकि पीएस को एलए से एलबी लिपोसोम्स तक ले जाया गया, जिससे एनबीडी-सी 2लैक्टके ट्रांसलेशन को बढ़ावा दिया गया।

जब एलबी लिपोसोम्स में 5 मोल% पीआई (4) पी शामिल थी, तो डीक्वेंचिंग बहुत तेज थी, क्योंकि पीएस को एलटीपी (सेकंड कर्व) द्वारा पीआई (4) पी के साथ पीएस के काउंटरएक्सचेंज के कारण ओश 6पी द्वारा एलबी लिपोसोम्स में अधिक तेजी से स्थानांतरित किया गया था। तीसरा वक्र एक प्रयोग से मेल खाता है जिसमें NBD-C2लैक्ट को एलए-ईक्यू और एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स की बराबर मात्रा के साथ मिलाया गया था । संकेत एफ 0 से अधिक था और एक ऐसी स्थिति से मेल खाती थी जहां जांच समान रूप से एलए और एलबी लिपोसोम्स के लिए बाध्य थी, इस प्रकार एक ऐसी स्थिति को दर्शाती है जहां पीएस लिपोसोम्स की दो आबादी के बीच पूरीतरह से समतुल्य था । एफEq प्रयोग के अंतिम 5 मिनट में मापा संकेत के मूल्य औसत से गणना की गई थी ।

Figure 4
चित्रा 4:Osh6p और संदर्भ वक्र के साथ मापा ठेठ पीएस परिवहन काइनेटिक्स। (A)पीआई (4) पी (200 माइक्रोन कुल लिपिड) और ओश 6पी (200 एनएम) से रहित एलबी लिपोसोम्स को एक क्यूवेट में क्रमिक रूप से जोड़ा गया था NBD-C2लैक्ट (250 एनएम) और एलए लिपोसोम्स (200 माइक्रोन) को 5 मोल% पीएस और 2 मोल% रोड-पीई (बाएं वक्र) के साथ डॉप किया गया। यही प्रयोग एलबी लिपोसोम्स के साथ किया गया था, जिसमें 5 मोल% पीआई (4) पी (मिडिल कर्व) था। एफईक्यूनिर्धारित करने के लिए, NBD-C2लैक्ट (250 एनएम) को एलए-ईक्यू लिपोसोम्स के साथ प्रीमिक्स किया गया था; फिर, एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स (दाएं वक्र) जोड़े गए। (ख)औसत पीएस परिवहन घटता है के साथ या PI (4) पी (मतलब है ± SEM, n= 3) के साथ या बिना एलबी लिपोसोम का उपयोग कर किया कई माप के सामान्यीकरण के बाद निर्धारित घटता है । (ग) प्रारंभिक पीएस हस्तांतरण दरें (मतलब ± एसईएम, एन = 3) । संक्षिप्त नाम: NBD = 7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल फ्लोरोफोर; NBD-C2लैक्ट = N, N'-dimethyl-N-(thioacetyl)-N'-(7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1,3-डायजोल-4-yl) गोजातीय लैक्टाडेरिन (पीडीबी आईडी: 3बीएन648)के C2 डोमेन के पुनर्जंमित संस्करण के C352 अवशेषों के थिओल फ़ंक्शन से जुड़े एथिलेंडाइमाइन मोइसिटी); पीडीबी = प्रोटीन डेटा बैंक; पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरीन; Osh6p = ऑक्सीस्टेरोल-बाइंडिंग प्रोटीन (OSBP) 6 प्रोटीन का समरूप; पीआई (4) पी = फॉस्फेटिलिनोसिटोल 4-फॉस्फेट; रोड-पीई = रोडामाइन-लेबल वाले फॉस्फेटिडिलथेनथेनमाइन; एलएक लिपोसोम्स = फॉस्फेटिडिलकोलिन से बना लिपोसोम्स, 2 मोल% रोड-पीई के साथ डॉप्ड, और जिसमें 5 मोल% पीएस होता है या नहीं; एलबी लिपोसोम्स = लिपोसोम्स में शामिल 5 मोल% पीआई (4)P; एफ = फ्लोरेसेंस; एफ0 = Osh6p के अलावा से पहले NBD के अनुरूप फ्लोरेसेंस; एफEq = फ्लोरेसेंस संकेत अगर पीएस पूरी तरह से एक हस्तांतरण प्रक्रिया द्वारा एलए और एलबी लिपोसोम के बीच संतुलन है; SEM = मतलब के मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4B एफ0 और एफईक्यू का उपयोग करके एफ डेटा को संदर्भ मूल्यों के रूप में सामान्य बनाने के बाद एलए लिपोसोम्स से एलबी लिपोसोम्स, डॉप या पीआई (4) पी के साथ डोप नहीं करने के औसत गतिज घटता दिखाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रारंभिक परिवहन दर की गणना एक रैखिक समारोह के साथ प्रोटीन के इंजेक्शन के बाद मापा प्रारंभिक डेटा अंक फिटिंग द्वारा किया गया था । चित्रा 4C के साथ या PI (4) पी के बिना एलबी लिपोसोम का उपयोग कर तीन अलग प्रयोगों से निर्धारित मतलब प्रारंभिक पीएस परिवहन दर से पता चलता है । जब एलबी लिपोसोम में 0 और 5 मोल% पीआई (4) पी शामिल थे, तो दरें क्रमशः 1.4 और 15.8 PS.min-1 प्रति Osh6p अणु के बराबर थीं। चित्रा 5A एक LTP के रूप में Osh6p का उपयोग कर एक PI (4) पी हस्तांतरण परख से विशिष्ट परिणाम दिखाता है, जो पीएस परिवहन परख के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में एक ही सामग्री और शर्तों के साथ किया गया था ।

Figure 5
चित्रा 5:विशिष्ट पीआई (4) पी परिवहन काइनेटिक्स को ओश 6पी और संदर्भ वक्र के साथ मापा जाता है। (A)पीएस-फ्री लिपोसोम्स जिनमें 2 मोल% रोड-पीई (एलए,200 माइक्रोन टोटल लिपिड) और ओश6पी (200 एनएम) क्रमिक रूप से किए गए थे। NBD-PHFAPP (250 एनएम) और एलबी लिपोसोम्स (200 माइक्रोएम) युक्त एक क्यूवेट में जोड़ा गया 5 मोल% पीआई (4) पी (बाएं वक्र) के साथ डॉप किया गया। यही प्रयोग एलए लिपोसोम्स के साथ 5 मोल% पीएस (मिडिल कर्व) के साथ किया गया था। एफईक्यूनिर्धारित करने के लिए, एनबीडी-पीएचएफएपी (250 एनएम) को एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स के साथ प्रीमिक्स किया गया था; फिर, एलए-एक्यू लिपोसोम्स (दाएं वक्र) जोड़े गए। (ख)पीआई (4) पी ट्रांसफर काइनेटिक्स के साथ या पीएस के बिना एलए लिपोसोम्स के कई मापों के सामान्यीकरण के बाद निर्धारित (मतलब एसईएम, एन = 3 ±) । (C)प्रारंभिक पीआई (4) पी हस्तांतरण दरें (मतलब ± एसईएम, एन = 3)। संक्षिप्त नाम: NBD = 7-नाइट्रोबेंज-2-ऑक्सा-1, 3-डायजोल फ्लोरोफोर; NBD-PHFAPP = NBD-लेबल Pleckstrin homology डोमेन मानव चार-फॉस्फेट-एडाप्टर प्रोटीन 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, खंड [1-100]); पुनश्च = फॉस्फेटिडिलसेरीन; Osh6p = ऑक्सीस्टेरोल-बाइंडिंग प्रोटीन (OSBP) 6 प्रोटीन का समरूप; पीआई (4) पी = फॉस्फेटिलिनोसिटोल 4-फॉस्फेट; रोड-पीई = रोडामाइन-लेबल वाले फॉस्फेटिडिलथेनथेनमाइन; एलएक लिपोसोम्स = फॉस्फेटिडिलकोलिन से बना लिपोसोम्स, 2 मोल% रोड-पीई के साथ डॉप्ड, और जिसमें 5 मोल% पीएस होता है या नहीं; एलबी लिपोसोम्स = लिपोसोम्स में शामिल 5 मोल% पीआई (4)P; एफ = फ्लोरेसेंस; एफ0 = Osh6p के अलावा से पहले NBD के अनुरूप फ्लोरेसेंस; एफEq = फ्लोरेसेंस संकेत अगर PI (4) पी पूरी तरह से एक हस्तांतरण प्रक्रिया द्वारा एलए और एलबी लिपोसोम के बीच तुल्य है; SEM = मतलब के मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समय शून्य पर, एनबीडी-पीएचएफएपी को एचकेएम बफर के 570 माइक्रोन की मात्रा में 5 मोल% पीआई (4) पी वाले एलबी लिपोसोम्स के साथ मिलाया गया था। क्योंकि एनबीडी-पीएचएफएपी एलबी लिपोसोम्स के लिए बाध्य था, इसका सिग्नल ज्यादा था । एक मिनट के बाद एलएक लिपोसोम्स (30 माइक्रोल) जोड़े गए, जिससे संकेत में केवल थोड़ा बदलाव होने की उम्मीद थी । इसके बाद इसकी तीव्रता एफ0से मेल खाती थी . प्रतिक्रिया मिश्रण में Osh6p (२०० एनएम अंतिम एकाग्रता) इंजेक्शन NBD-पीएचFAPP अणुओं के स्थानांतरण के कारण NBD संकेत की एक शमन शुरू कर दिया एलएक liposomes के रूप में PI (4) पी एलB liposomes से एलएक लिपोसोम्स को हस्तांतरित किया गया था । जब एलए लिपोसोम्स में 5 मोल% चबूतरे होते थे, तो पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज के परिणामस्वरूप तेजी से पीआई (4) पी ट्रांसफर के कारण डीक्वेंचिंग बहुत तेज थी। तीसरा वक्र एक प्रयोग से मेल खाता है जिसमें एनबीडी-पीएचएफएप को एलए-ईक्यू और एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स की बराबर मात्रा के साथ मिलाया गया था ।

यह संकेत एफ0 से कम था क्योंकि यह उस स्थिति से मेल खाता था जहां जांच समान रूप से एलए और एलबी लिपोसोम्स से बंधी हुई थी, इस प्रकार लिपोसोम्स के बीच पीआई (4) पी की पूर्ण संतुलन का संकेत मिलता है । एफEq प्रयोग के अंतिम 5 मिनट में मापा संकेत के मूल्य औसत से गणना की गई थी । चित्रा 5B,सी शो सिग्नल सामान्यीकरण के बाद प्राप्त औसत गतिज घटता है और मतलब PI (4) पी प्रारंभिक हस्तांतरण दरों एलएक लिपोसोम के साथ मापा जाता है जो 5 मोल% पीएस के साथ डोप या डोप नहीं किए गए थे। यहां, यह ध्यान देने योग्य बात है कि दोनों लिपिड लिगांड को तेजी से और इसी तरह के वेग के साथ ले जाया गया था जब प्रत्येक लिपिड शुरू में एलए और एलबी झिल्ली में क्रमशः मौजूद था, जो इंगित करता है कि Osh6p एक पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंजर है ।

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Discussion

इन परख के परिणाम सीधे फ्लोरोसेंट लिपिड सेंसर के संकेतों पर भरोसा करते हैं। इस प्रकार, एनबीडी के साथ 1:1 अनुपात पर और मुफ्त एनबीडी फ्लोरोफोर संदूषण के बिना लेबल किए गए इन जांचों का शुद्धिकरण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह जांचना भी अनिवार्य है कि जांच के तहत एलटीपी को ठीक से मोड़ा गया है या नहीं और एकत्रित नहीं किया गया है । निष्कर्षण में परीक्षण की गई एलटीपी की मात्रा सुलभ पीएस या पीआई (4) पी अणुओं के बराबर या अधिक होनी चाहिए ताकि यह ठीक से माप सके कि क्या यह एलटीपी कुशलतापूर्वक इन लिपिड को निकालता है। दरअसल, एक शास्त्रीय संतृप्ति बाध्यकारी वक्र के बाद, NBD-C2लैक्ट और एनबीडी-पीएचएफएपी क्रमशः पीएस और पीआई (4) पी के लिए बाध्य करते हैं। पीएस और पीआई (4) पी के लिए उनके संबंधित समानताओं को देखते हुए, ये जांच काफी हद तक लिपोसोम्स से बंधे रहते हैं, भले ही लिपोसोम्स में इन लिगामेंट्स के अवशिष्ट निशान हों। यह गलत निष्कर्ष है कि एक LTP कुशलता से इन लिपिड निकालने नहीं करता है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रोटोकॉल मानक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसी, पीएस, और पीआई (4) पी उप-प्रजातियों पर निर्भर करता है जो क्रमशः 18:1/18:1-पीसी, 16:0/18:1-पीएस, और 16:0/16:0-पीआई (4) पी हैं। अन्य एसील चेन के साथ लिपिड प्रजातियों का उपयोग करके प्रयोग करने से विभिन्न परिणाम मिल सकते हैं, जैसा कि पहले12,35बताया गया था।

स्थानांतरण परख में, यदि एलए और एलबी लिपोसोम्स के थोक लिपिड संरचना (पीएस या पीआई (4) पी) को संशोधित नहीं किया जाना है, तो एलए-ईक्यू और एलबी-ईक्यू लिपोसोम्स का उपयोग करके नियंत्रण प्रयोगों को भी करने की कुंजी है, जो एलए और एलबी लिपोसोम के समान थोक संरचना के साथ है, क्रमशः। यही सिद्धांत निष्कर्षण परख के लिए लागू होता है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट लिपिड-बाध्यकारी डोमेन का उपयोग मोटे तौर पर कोशिकाओं के अंदर लिपिड वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है44। झिल्ली के साथ इन लिपिड जांच के सहयोग के रूप में ऐसे प्रयोगों का विश्लेषण करते समय सावधानी की सिफारिश की जाती है, हालांकि मुख्य रूप से लक्षित लिपिड की उपस्थिति से प्रेरित, अन्य मापदंडों (एनियोनिक लिपिड, लिपिड-पैकिंग का घनत्व) से प्रभावित हो सकता है जो सेल डिब्बों के बीच भिन्न होते हैं। इन इन इन विट्रो परखों में, लिपोसोम्स की संरचना सेलुलर झिल्ली की तुलना में बहुत सरल है: वे ज्यादातर पीसी, एक zwitterionic लिपिड से बने होते हैं, और इस तरह एक निष्क्रिय सतह का पर्दाफाश करते हैं जो पीएस और पीआई (4) पी को उनके संबंधित सेंसर द्वारा मान्यता प्राप्त कैसे प्रभावित करता है। पीएचएफएपी का उपयोग एनियोनिक लिपिड की उपस्थिति में किया जा सकता है, जैसे पीएस, फॉस्फेटिक एसिड (पीए), औरपीआई 32,और सी 2लैक्ट पीआई (4) पी12को नहीं पहचानता है; ये दोनों टिप्पणियां पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंज के निष्पक्ष माप की अनुमति देती हैं । NBD-PHFAPP स्टेरोल43से प्रभावित नहीं है।

हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि इन जांचों, विशेष रूप से, NBD-C2लैक्ट,चरम सुविधाओं के साथ लिपोसोम के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है(उदाहरण के लिए, बहुत कम या उच्च लिपिड-पैकिंग, अत्यधिक नकारात्मक आवेशित सतह, लिपिड डोमेन की उपस्थिति)। लिपोसोम संरचना के संबंध में इस संभावित सीमा के बावजूद, फ्लोरोसेंट सेंसर के आधार पर इन स्थानांतरण परख अन्य तरीकों की तुलना में जबरदस्त फायदे हैं। सबसे पहले, वे फ्लोरोसेंटी लेबल पीएस और पीआई (4) पी पर भरोसा नहीं करते हैं जो एक अतिरिक्त भारी समूह को सहन करते हैं और एलटीपी की बाध्यकारी जेब से ठीक से समायोजित नहीं होते हैं। दूसरा, ये परख लिपोसोम सेपरेशन (रेडियोधर्मिता आधारित परख45 या मास स्पेक्ट्रोमेट्री33)के आधार पर तरीकों की तुलना में कहीं बेहतर समय समाधान प्रदान करते हैं, और यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रेडियोलेबल पीआई (4) पी और पीएस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। पीएस या पीआई (4) पी को स्थानांतरित करने के लिए प्रोटीन की क्षमता लिपोसोम्स के साथ फ्लोरोसेंट सेंसर के संघ से प्रभावित नहीं होती है। दरअसल, यदि एनटीपी के लिए सुलभ लिपोसोम्स के बाहरी पत्रक में एनबीडी-सी2लैक्ट या एनबीडी-पीएचएफएपी और पीएस और पीआई (4) पी की मात्रा पर विचार किया जाता है, तो पीएस या पीआई (4) पी का केवल 5% ही किइनेटिक्स मापन के दौरान जांच से जुड़ा होता है।

इसके अलावा, झिल्ली की सतह का केवल 0.55-0.86% जांच द्वारा कवर किया जाता है, लिपोसोम्स की कुल सतह (एलए+ एलबी लिपोसोम्स; 5.1 × 1016 एनएम2 के क्षेत्रफल के साथ 0.7 एनएम2 प्रति लिपिड) को ध्यान में रखते हुए, झिल्ली सतह जो एक व्यक्तिगत सी 2 या पीएच अणु क्रमशः कब्जा कर सकता है (≈3.1 और 4.8 एनएम2,संदर्भोंसे अनुमानित 47,48) और उनकी एकाग्रता (250 एनएम)। इस प्रकार, इन परखों में अंतर्निहित सिद्धांतों को एलटीपी के गतिज और मशीनी पहलुओं का ठीक से विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, ओआरपी 5/8 की गतिविधि में परिवर्तन सेलुलर डिस्फंक्शन49का कारण बन सकता है। उदाहरण के लिए, अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामकता ORP5 अभिव्यक्ति के स्तर पर भरोसा करने लगता है। इसके अलावा, एक कारण ORP5 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर और मानव अग्नाशय के कैंसर के गरीब पूर्वानुमान के बीच मौजूद है । फेफड़ों के ट्यूमर ऊतकों में ओआरपी 5 अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर भी पाया जाता है, और विशेष रूप से, मेटास्टैटिक मामलों में। दिलचस्प बात यह है कि लिपिड को स्थानांतरित करने के लिए ORP5 की क्षमता यह समझा सकती है कि यह सेल प्रसार और प्रवासन को बढ़ावा क्यों देता है।

ORP5 रैपामाइसिन कॉम्प्लेक्स 1 (mTORC1) कॉम्प्लेक्स के स्तनधारी लक्ष्य को बढ़ाता है, जो सेल अस्तित्व और प्रसार में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, शायद इसलिए कि यह PS. कुल मिलाकर, इन टिप्पणियों का सुझाव है कि ORP5 एक दिलचस्प औषधीय लक्ष्य हो सकता है, और है कि इन विट्रो परखों को स्क्रीन अणुओं कि अपनी गतिविधि को बाधित करने में सक्षम है स्क्रीन करने के लिए सेवा कर सकते है mkt, mTORC1 के एक अपस्ट्रीम सक्रियक की गतिविधि को बढ़ाता है । यह परख यह भी बेहतर परिभाषित करने में मदद कर सकती है कि ओआरपी/ओश परिवार के अन्य सदस्य पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंजर हैं या नहीं । विशेष रूप से, ORP10 को ईआर-गोल्गी संपर्क साइटों27,50में वीइंट्रो और ट्रांसफर पीएस में पीएस को समाहित करने के लिए पाया गया था, लेकिन यह अभी भी अज्ञात है कि क्या यह पीएस/पीआई (4) पी एक्सचेंजर के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, ये प्रोटोकॉल अन्य परिवारों से संबंधित एलटीपी की क्षमता का पता लगाने के लिए पीआई (4) पी परिवहन के लिए काम कर सकते हैं, जैसा कि हाल ही में स्टेरॉयड तीव्र नियामक हस्तांतरण जैसे प्रोटीन10,या पीएस के साथ दिखाया गया था। इसके अतिरिक्त, एनबीडी-पीएचएपी का उपयोग लिपोसोम्स के बीच पीआई (4,5) पी2 के परिवहन के लिए एलटीपी की क्षमता का पालन करने के लिए किया गया है, क्योंकि यह इस पीआईपी10,पहचानता है 35. अंत में, इस रणनीति को अन्य लिपिड-बाध्यकारी डोमेन(उदाहरण के लिए, पीआई51,स्पोरुलेशन-विशिष्ट प्रोटीन 20 खंड का पता लगाने के लिए पीआई 51, स्पोरुलेशन-विशिष्ट प्रोटीन 20 खंड का पता लगाने के लिए स्टेरोल53का पता लगाने के लिए) का पता लगाने के लिए विट्रो में अन्य निष्कर्षण या परिवहन प्रक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों के टकराव नहीं हैं ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए डॉ ए कटट्रीस के आभारी हैं । यह काम फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी अनुदान ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) और CNRS द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

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References

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Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

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