Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescensbaserte målinger av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutveksling mellom membraner

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62177
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi protokoller ved hjelp av fluorescerende lipidsensorer og liposomer for å avgjøre om et proteinekstrakter og transporterer fosfatidylserin eller fosfatidylinositol 4-fosfat in vitro.

Abstract

Flere medlemmer av den evolusjonært konserverte oksysterolbindende proteinfamilien (OSBP)-relaterte proteiner (ORP)/OSBP-homologer (Osh) har nylig blitt funnet å representere en ny lipidoverføringsproteingruppe (LTP) i gjær og menneskeceller. De overfører fosfatidylserine (PS) fra endoplasmisk retikulum (ER) til plasmamembranen (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) utvekslingssykluser. Dette funnet gir en bedre forståelse av hvordan PS, som er kritisk for signalprosesser, fordeles over hele cellen og undersøkelsen av koblingen mellom denne prosessen og fosfoinositid (PIP) metabolisme. Utviklingen av nye fluorescensbaserte protokoller har vært medvirkende i oppdagelsen og karakteriseringen av denne nye cellulære mekanismen in vitro på molekylært nivå. Dette dokumentet beskriver produksjonen og bruken av to fluorescerende merkede lipidsensorer, NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP, for å måle evnen til et protein til å trekke ut PS eller PI(4)P og overføre disse lipidene mellom kunstige membraner. For det første beskriver protokollen hvordan du produserer, merker og henter prøver med høy renhet av disse to konstruksjonene. For det andre forklarer dette dokumentet hvordan du bruker disse sensorene med en fluorescensmikroplateleser for å avgjøre om et protein kan trekke ut PS eller PI(4)P fra liposomer, ved hjelp av Osh6p som en casestudie. Til slutt viser denne protokollen hvordan man nøyaktig måler kinetikken til PS / PI (4) P-utveksling mellom liposomer av definert lipidsammensetning og for å bestemme lipidoverføringshastigheter ved fluorescensresonansenergioverføring (FRET) ved hjelp av et standard fluorometer.

Introduction

Den nøyaktige fordelingen av lipider mellom forskjellige membraner og innenfor membranene til eukaryote celler1,2 har dype biologiske implikasjoner. Dekryptering av hvordan LTPer fungerer, er et viktig problem i cellebiologi3,4,5,6og in vitro-tilnærminger har stor verdi når det gjelder å løse dette problemet7,8,9,10,11. Her presenteres en in vitro, fluorescensbasert strategi som har vært medvirkende til å fastslå at flere ORP / Osh-proteiner påvirker PS / PI (4)P-utveksling mellom cellemembraner12 og dermed utgjør en ny klasse LTPer. PS er en anionisk glyserofosfolipid som representerer 2-10% av totale membranlipider i eukaryote celler13,14, 16,16 ,16. Den fordeles langs en gradient mellom ER og PM, der den representerer henholdsvis 5-7% og opptil 30% av glyserofosfolipider, henholdsvis17,18,19. Videre er PS i hovedsak konsentrert i statsministerens cytosoliske brosjyre. Denne oppbyggingen og den ujevne partisjonen av PS i PM er avgjørende for mobilsignaleringsprosesser19. På grunn av den negative ladningen av PS-molekyler er statsministerens cytosoliske brosjyre mye mer anionisk enn det cytosoliske pakningsvedlegget til andre organeller1,2,19,20. Dette gjør det mulig å rekruttere, via elektrostatiske krefter, av signalproteiner som myristoylert alaninrik c-kinase substrat (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rotte sarkom viral oncogene (K-Ras)23, og Ras-relatert C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1)24 som inneholder en strekning av positivt ladede aminosyrer og en lipidhale.

PS er også anerkjent av konvensjonell protein kinase C på en stereoselektiv måte via et C2-domene25. PS syntetiseres imidlertid i ER26, noe som angir at den må eksporteres til statsministeren før den kan spille sin rolle. Det var ikke kjent hvordan dette ble oppnådd19 før funnet at I gjær overfører Osh6p og Osh7p PS fra ER til PM27. Disse LTP-ene tilhører en evolusjonært bevart familie i eukaryoter hvis grunnlegger er OSBP og som inneholder proteiner (ORPer hos mennesker, Osh-proteiner i gjær) som integrerer et OSBP-relatert domene (ORD) med en lomme for å være vert for et lipidmolekyl. Osh6p og Osh7p består bare av en ORD hvis strukturelle egenskaper er tilpasset å spesifikt binde PS og overføre den mellom membraner. Likevel var det uklart hvordan disse proteinene retningsmessig overførte PS fra akuttmottaket til statsministeren. Osh6p og Osh7p kan fange PI(4)P som en alternativ lipidligand12. I gjær syntetiseres PI(4)P fra fosfatidylinositol (PI) i henholdsvis Golgi og PM av PI 4-kinases, Pik1p og Stt4p. Derimot er det ingen PI (4)P i ER-membranen, da denne lipiden hydrolyseres til PI av Sac1p-fosfatase. Derfor finnes det en PI(4)P-gradient både ved grensesnittene ER/Golgi og ER/PM. Osh6p og Osh7p overfører PS fra AKUTT til PM via PS/PI(4)P utvekslingssykluser ved hjelp av PI(4)P-gradienten som eksisterer mellom disse to membranene12.

Innenfor en syklus trekker Osh6p ut PS fra ER, bytter PS for PI(4)P ved PM og overfører PI(4)P tilbake til AKUTT for å trekke ut et annet PS-molekyl. Osh6p/Osh7p samhandler med Ist2p28, et av de få proteinene som forbinder og bringer ER-membranen og statsministeren i nærheten av hverandre for å opprette ER-PM kontaktsteder i gjær29,30,31. I tillegg blir foreningen av Osh6p med negativt ladede membraner svak så snart proteinet trekker ut en av sine lipidligander på grunn av en konformasjonsendring som endrer sine elektrostatiske egenskaper32. Dette hjelper Osh6p ved å forkorte membranbotiden, og opprettholder dermed effektiviteten av lipidoverføringsaktiviteten. Kombinert med bindingen til Ist2p, kan denne mekanismen gjøre det mulig for Osh6p/7p å både raskt og nøyaktig utføre lipidutveksling ved ER/PM-grensesnittet. I humane celler utfører ORP5- og ORP8-proteiner PS/PI(4)P-utveksling på ER-PM kontaktsteder via distinkte mekanismer33. De har en sentral ORD, lik Osh6p, men er direkte forankret til ER via en C-terminal transmembrane segment33 og dock inn i PM via en N-terminal Pleckstrin homology (PH) domene som gjenkjenner PI (4)P og PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 bruker PI(4)P til å overføre PS, og det har vist seg at ORP5/8 i tillegg regulerer PM PI(4,5)P2-nivåer og antagelig modulerer signalveier. I sin tur senker en reduksjon i PI(4)P og PI(4,5)P2-nivåene ORP5/ORP8-aktiviteten ettersom disse proteinene forbinder med PM på en PIP-avhengig måte. Unormalt høy PS-syntese, som fører til Lenz-Majewski syndrom, påvirker PI(4)P nivåer gjennom ORP5/836. Når aktiviteten til begge proteinene er blokkert, blir PS mindre rikelig ved statsministeren, og senker den onkogene evnen til å signalisere proteiner37.

Omvendt ser ORP5 overekspression ut til å fremme kreftcelleinvasjon og metastatiske prosesser38. Dermed kan endringer i ORP5/8-aktivitet alvorlig endre cellulær oppførsel gjennom endringer i lipid homeostase. Videre okkuperer ORP5 og ORP8 ER-mitokondrier kontaktsteder og bevarer noen mitokondriefunksjoner, muligens ved å levere PS39. I tillegg lokaliserer ORP5 til er-lipiddråpekontaktsider for å levere PS til lipiddråper av PS / PI (4)P exchange40. Strategien som er beskrevet her for å måle (i) PS og PI(4)P ekstraksjon fra liposomer og (ii) PS og PI(4)P transport mellom liposomer er utviklet for å etablere og analysere PS/PI(4)P utvekslingsaktiviteten til Osh6p/Osh7p12,32 og brukt av andre grupper for å analysere aktiviteten til ORP5/ORP835 og andreLTPer, 41. Den er basert på bruk av en fluorescensplateleser, et standard L-format spektrofluorometer og to fluorescerende sensorer, NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP, som kan oppdage henholdsvis PS og PI (4)P.

NBD-C2Lact tilsvarer C2-domenet til glykoproteinet, laktadherin, som ble reengineered for å inkludere et unikt løsningsmiddel-eksponert cystein nær det antatte PS-bindingsstedet; polaritetssensitiv NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluorofor er kovalent knyttet til denne resten (Figur 1A)12. For å være mer presis ble C2-domenet til laktadherin (Bos taurus, UniProt: Q95114,residues 270-427) klonet i en pGEX-4T3 vektor som skal uttrykkes i fusjon med glutathione S-transferase (GST) i Escherichia coli. C2Lact-sekvensen ble deretter mutert for å erstatte to løsemiddeltilgjengelige cysteinrester (C270, C427) med alaninrester og for å introdusere en cysteinrester i en region nær det putative PS-bindestedet (H352C-mutasjon) som senere kan merkes med N,N'-dimetyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etylendiamin (IANBD) 12. Et spaltingssted for trombin er til stede mellom GST-proteinet og N-terminus av C2-domenet. En stor fordel er at dette domenet selektivt gjenkjenner PS på en Ca2+-uavhengig måte i motsetning til andre kjente C2-domener eller Annexin A542. NBD-PHFAPP er avledet fra PH-domenet til det humane firefosfatadapterproteinet 1 (FAPP1), som ble reengineered for å inkludere et enkelt løsningsmiddeleksponert cystein som kan merkes med en NBD-gruppe nær PI(4)P bindingsstedet (Figur 1A)43. Nukleotidsekvensen av PH-domenet til det menneskelige FAPP-proteinet (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) har blitt klonet inn i en pGEX-4T3 vektor som skal uttrykkes i takt med en GST-tag. PHFAPP-sekvensen er modifisert for å sette inn en unik cysteinrester i membranbindende grensesnitt av proteinet43. Videre er det innført en ni-rester linker mellom trombin spalting området og N-terminus av PH-domenet for å sikre tilgjengelighet til protease.

For å måle PS-ekstraksjon fra liposomer blandes NBD-C2Lact med liposomer laget av fosfatidylkolin (PC) som inneholder spormengder av PS. På grunn av sin affinitet for PS, binder denne konstruksjonen seg til liposomene, og NBD fluoroforen opplever en endring i polaritet når den kommer i kontakt med membranens hydrofobe miljø, som fremkaller et blått skifte og en økning i fluorcence. Hvis PS ekstraheres nesten helt av en stoichiometrisk mengde LTP, forbinder ikke sonden med liposomer, og NBD-signalet er lavere (Figur 1B)32. Denne forskjellen i signal brukes til å avgjøre om en LTP(f.eks. Osh6p) trekker ut PS. En lignende strategi brukes med NBD-PHFAPP for å måle PI(4)P ekstraksjon (Figur 1B), som beskrevet tidligere12,32. To FRET-baserte analyser ble designet for å (i) måle PS-transport fra LA til L B-liposomer, som etterligner henholdsvis ER-membranen og PM, og (ii) PI(4)P transport i motsatt retning. Disse analysene utføres under de samme forholdene (dvs. samme buffer, temperatur og lipidkonsentrasjon) for å måle PS / PI (4) P-utveksling. For å måle PS-transport blandes NBD-C2Lact med L A-liposomer sammensatt av PC og doped med 5 mol% PS og 2 mol% av en fluorescerende rhodamin-merket fosfatidylethanolamin (Rhod-PE) - og LB liposomer som inkorporerer 5 mol% PI (4)P.

Ved null tid slukker FRET med Rhod-PE NBD-fluorescensen. Hvis PS transporteres fra LA til LB liposomer(f.eks. ved injeksjon av Osh6p), oppstår en rask dequenching på grunn av translokasjon av NBD-C2Laktmolekyler fra LA til LB liposomer (Figur 1C). Gitt mengden tilgjengelig PS, forblir NBD-C2Lact i hovedsak i en membranbundet tilstand i løpet av eksperimentet12. Dermed korrelerer intensiteten til NBD-signalet direkte med fordelingen av NBD-C2Lact mellom LA- og L B-liposomer og kan enkelt normaliseres for å bestemme hvor mye PS overføres. For å måle overføringen av PI(4)P i motsatt retning blandes NBD-PHFAPP med LA- og L B-liposomer; gitt at den bare binder seg til L B-liposomer som inneholder PI(4)P, men ikke Rhod-PE, er fluorescensen høy. Hvis PI(4)P overføres til L A-liposomer, translokaliseres det til disse liposomene, og signalet reduseres på grunn av FRET med Rhod-PE (Figur 1C). Signalet normaliseres for å bestemme hvor mye PI(4)P som overføres43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensing av NBD-C2Lakt

MERK: Selv om denne protokollen beskriver bruken av en celleforstyrrer for å bryte bakterier, kan den endres til å bruke andre lysisstrategier (f.eks. en fransk presse). I begynnelsen av rensingen er det obligatorisk å bruke buffer som er nyavgasset, filtrert og supplert med 2 mM dithiothreitol (DTT) for å forhindre oksidasjon av cystein. For proteinmerkingstrinnet er det imidlertid viktig å fjerne DTT helt. Mange trinn må utføres på is eller i et kaldt rom for å unngå proteinforringelse. Prøver av 30 μL volum må samles på ulike trinn i protokollen for å utføre en analyse av natrium dodecylsulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) ved hjelp av en 15% akrylamidgel for å sjekke fremdriften av rensingen. Bland nok denaturering laemmli prøvebuffer med hver aliquot, og varme blandingen ved 95 °C. Frys og oppbevar rørene ved -20 °C til analysen.

  1. Uttrykk for GST-C2Lact i Escherichia coli
    1. Bland 20 μL BL21 Gull kompetente celler med 18 μL sterilisert vann. Bland deretter 2 μL pGEX-C2Laktplasmid (ved ~ 65 ng / μL) med bakteriene, og transformer dem ved elektroporasjon. Resuspend bakteriene med 150 μL autoklavert Lennox Lysogeny-Broth (LB) medium (10 g / L tryptone, 5 g / L gjærekstrakt, 5 g / L NaCl i deionisert vann, glukosefri). La bakteriene vokse ved 37 °C i 1 time i et mikrocentrifugerør på 2 ml.
    2. Inokuler 25 ml LB-medium, supplert med 50 μg/ml ampicillin, med 150 μL bakteriell suspensjon i en 125 ml steril Erlenmeyer-kolbe. Plasser kolben i en orbital shaker ved 37 °C, og la bakteriene vokse over natten med agitasjon ved 185 o/min.
    3. Fyll to sterile 2 L Erlenmeyer-kolber med 500 ml LB medium supplert med 50 μg/ml ampicillin, og tilsett 5 ml prekulturell suspensjon. La bakteriene vokse ved 37 °C med agitasjon ved 220 o/min.
    4. Mål regelmessig den optiske tettheten (OD) av suspensjonen ved en bølgelengde (λ) på 600 nm. Når OD når en verdi på ~ 0,6-0,7, tilsett 500 μL av en lagerløsning på 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til hver kolbe for å starte uttrykket av GST-C2Lact. Rist kolbeene ved 185 o/min i 4 timer ved 37 °C.
    5. Overfør innholdet i hver kolbe til en polypropylen sentrifugeflaske. Sentrifuger de to flaskene i 30 min ved 4600 × g ved 4 °C for å pelletse bakteriene. Kast supernatanten, og resuspender hver pellets i 50 ml kald fosfatbufret saltvann.
    6. Overfør bakteriell suspensjon i hver flaske til et 50 ml konisk sentrifugerør. Sentrifuger de to rørene i 30 min ved 2300 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten, og lagre rørene, som hver inneholder en bakteriell pellets, ved -20 °C.
  2. Rensing av C2Lakt
    1. På is, fyll to 50 ml koniske sentrifugalrør med 50 ml buffer som inneholder 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 150 mM NaCl (heretter kalt TN-buffer), tidligere filtrert og avgasset ved membranvakuumfiltrering.
    2. For å forberede lysisbufferen i hvert rør, oppløs en tablett etylendiamintetraacetisk syrefri proteasehemmercocktail i TN-bufferen ved mild sonikering eller virvel. Tilsett andre antiproteaser (10 μM bestatin, 1 μg/ml pepstatin A og 10 μM fosforamidon). Det er viktig å supplere bufferen med 2 mM DTT.
    3. Fyll de to rørene som inneholder bakteriepellets tilberedt i trinn 1.1.6, med lysisbuffer for å oppnå et sluttvolum på 30 ml i hvert rør, og avriming pelletsene sakte på is i 10 minutter. Knus hver pellets med en spatel i rustfritt stål, og resuspender dem ved å virvelge rørene og/eller ved å pipettere suspensjonen frem og tilbake med en pipettekontroller og en 25 ml pipette til en homogen suspensjon oppnås.
    4. Utfør lysis ved hjelp av en forhåndskjølt celleforstyrer (se materialtabellen) ved å laste 30 ml av prøven inne i reservoaret og kjøre en bruddsyklus i kontinuerlig modus med et trykk på 1,6 bar. Samle lysatet i samme rør, hold røret på is, og tilsett umiddelbart 250 μL fra en lagerløsning på 200 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) fremstilt i isopropanol.
    5. Lyse den andre prøven etter samme prosedyre. Bruk resten av lysisbufferen til å vaske celleforstyrreren, og samle vasken for å justere volumet på hver lysat (~ 30 ml) til et endelig volum på 50 ml.
    6. Suppler hvert lysat med 5 mM MgCl2, og tilsett 20 μg/ml DNAse I for å fragmentere DNA-et og dermed redusere viskositeten til prøven. Inkuber på is i 30 min. Samle en prøve for gelanalyse.
    7. Overfør hver 50 ml lysat til et forhåndsklokket polykarbonat ultrasenterrifugerør (to totalt, se materialtabellen). Sentrifuge ved 186 000 × g ved 4 °C i minst 1 time ved hjelp av en ultracentrifuge.
    8. Parallelt med sentrifugeringstrinnet, dispenser 1,4 ml slurry som inneholder glutathione koblet til 4% agarose perler i to 50 ml koniske sentrifugalrør, tilsett 20 ml TN-buffer supplert med 1 mM DTT (TND-buffer) til hvert rør, sentrifuge ved 1200 × g i 5 min, og kast supernatanten. Gjenta dette vasketrinnet to ganger.
    9. Etter sentrifugering av bakteriell lysat, fjern en 30 μL prøve fra supernatanten, og overfør supernatanten fra hvert ultracentrifuge rør til et tilsvarende 50 ml konisk sentrifugerør som inneholder rene perler. For gelanalyse, resuspend rusk pellet i en av ultracentrifuge rør med 50 ml TND buffer, og samle en 30 μL prøve.
    10. Plasser rørene på en rotator i 3-4 timer ved 4 °C for å oppnå en homogen perleoppheng. Slå sammen perlefjæringene i en tom 25 ml kromatografikolonne. La perlene dekantere, og fjern bufferen og ubundne proteiner ved tyngdekraften. Ta en prøve fra eluate for analyse.
    11. Resuspend perlene med 20 ml TND buffer, og samle eluate ved tyngdekraften strømning. Gjenta dette trinnet to ganger for å vaske perlene helt. Samle sammen de innsamlede eluates, og behold en 30 μL prøve for videre analyse.
      MERK: Etter en kort dekantering, et volum på ~ 2 ml perle suspensjon, som GST-C2Lact er festet til, sedimenter på bunnen av kolonnen.
    12. Tilsett 1 ml perlefjæring til to 2 ml mikrosenterrør med 2 ml. Fyll hvert rør med TND buffer til et endelig volum på 1.970 ml. Ta en 30 μL prøve fra ett rør for videre analyse (B1 prøve). Tilsett 10 μL 10 mM CaCl2-oppløsning og 25 μL fra en lagerløsning av human trombinproteaseoppløsning ved 0,02 U/μL.
    13. Plasser de to rørene på en rotator ved 4 °C over natten for å la trombin holde seg unna GST-taggen fra C2Lact-domenet. Neste dag, i hvert rør, bland 10 μL 200 mM PMSF-løsning med perlefjæringen for å hemme trombinvirkningen.
    14. Sentrifuger rørene ved 700 × g i 5 min, og samle supernatanten, som inneholder løselig C2Lact-domene, fra hvert rør, uten å ta perlene. Samle supernatantene i et mikrocentrifugerør på 2 ml som holdes på is.
    15. Tilsett 1 ml TND buffer til hvert rør for å resuspendere perlene, og vask dem; gjenta trinn 1.2.14. Utfør dette trinnet tre ganger mer for å gjenopprette en maksimal mengde protein. Hver gang kan du samle de innsamlede supernatantene i et nytt 2 ml rør (E2, E3, E4 og E5 eluates), og ta en aliquot for videre analyse. På slutten av vasketrinnene, ta en aliquot fra perle suspensjon (aliquot B2).
    16. Analyser de 30 μL prøvene som ble samlet inn på de forskjellige trinnene i renselsesprotokollen ved SDS-PAGE-separasjon på en 15% akrylamidgel.
    17. Fjern potensielle forurensende perler ved å samle alle supernatantene (dvs.~ 10 ml) samlet i trinn 1.2.14 og 1.2.15 i en 10 ml kromatografikolonne. Samle eluate ved tyngdekraften strømning, og behold perlene nederst i kolonnen.
    18. Konsentrer C2Lact-prøven ved hjelp av en sentrifugalfilterenhet med en molekylvektkutt (MWCO) på 3 kDa og en sentrifugeringshastighet på 2300 × g. Stopp konsentrasjonsprosedyren når volumet av proteinprøven er ~ 1 ml.
  3. Tilberedning og rensing av NBD-C2Lakt
    1. Likevekt en desaltingskolonne (se Materialfortegnelse) med TN-buffer. Last kolonnen med 1 ml konsentrert C2Laktprøve. La prøven komme helt inn i gelsengen, tilsett 1,5 ml nyavgasset DTT-fri TN-buffer til kolonnen, og samle eluate ved tyngdekraften strømme inn i et 2 ml snap-cap mikrocentrifuge rør.
    2. Fortynn 50 μL eluate i et sluttvolum på 300 μL TN buffer, og registrer et absorbansspekter fra 230 til 450 nm ved hjelp av ren TN-buffer som blank. Bestem C2Lact-konsentrasjonen basert på absorbansen målt ved 280 nm, med tanke på en utryddelseskoeffisient ε lik 44 920 M-1,cm-1.
    3. For å merke C2Lact-konstruksjonen med en NBD-fluorofor, bland proteinet med et ti ganger molar overskudd av N,N'-dimetyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)etylendiamin (IANBD amide).
      1. Løs opp 1 mg IANBD i vannfri dimetylformamid (DMF), husk at det endelige volumet av DMF som brukes til merking av C2 Lact-konstruksjonen, ikke må overstige 5% (v / v) av proteinprøvevolumet.
      2. For å bestemme volumet av DMF (VDMF) for å oppløse IANBD, må du først beregne den nødvendige mengden IANBD (m, uttrykt i mg) for å merke proteinet ved hjelp av formel 1.
        m = 10 000 × C × V × MWIANBD (1)
        der C er konsentrasjonen av C2Lact målt i trinn 1.3.2, V er volumet av C2Lact-prøven, og MWIANBD er molekylvekten til fluoroforen (420 g / mol).
      3. Beregn VDMF ved hjelp av formel 2 (med m0=1) og 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0,05 × V (3)
        Der m0 er mengden IANBD pulver i mg, og VIANBD er volumet av IANBD-oppløsning som skal legges til C2Lact-prøven.
      4. Tilsett volum VIANBD av den nylagde IANBD-løsningen i C2Lact-prøven, og rist reaksjonsblandingen ved 800-900 o /min i 30 minutter ved 25 °C ved hjelp av en termomikser beskyttet mot lys. La reaksjonen fortsette i 90 min på is. I mellomtiden rengjør du en sentrifugalfilterenhet (MWCO = 3 kDa) med 10 ml TN-buffer.
    4. Tilsett L-cystein (i 10 ganger molar overskudd til IANBD) til reaksjonsblandingen for å inaktivere fri IANBD.
    5. Tilsett 15 ml TN-buffer til NBD-C2Laktløsningen, og overfør NBD-C2Lact-løsningen til sentrifugalfilterenheten. Konsentrer prøven til 2 ml for å skille det meste av den frie NBD fra proteinet ved sentrifugering ved 2300 × g. Gjenta dette vasketrinnet to ganger. Sentrifuger prøven i et 2 ml snap-cap sentrifugerør i 10 min ved 19 000 × g ved 4 °C til pelletspotensiale aggregater, og samle supernatanten.
    6. Fortynn 50 μL eluate i et sluttvolum på 300 μL TN-buffer. Registrer absorbansspekteret fra 230 til 650 nm ved hjelp av eluate samlet under konsentrasjonsprosedyren som en blank. Bestem NBD-C2 Laktkonsentrasjonen ved hjelp av maksimal absorbans ved λ = 280 og 495 nm og utryddelseskoeffisienter ε = 44,920 M-1,cm-1 (protein) og 25 000 M-1,cm-1 (NBD fluorofor).
      MERK: Hvis de to konsentrasjonsverdiene er like, indikerer dette at C2Lact-konstruksjonen er merket med et 1:1-forhold til NBD-gruppen.
    7. Hvis NBD-C2Lact-konsentrasjonen estimert fra måling av NBD-absorbans overstiger konsentrasjonen estimert fra absorbansen av tryptofan (Trp) rester, gjenta trinn 1.3.5 for å fjerne gratis NBD ytterligere.
    8. Tilsett glyserol i prøven for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10% (v / v) for å kryobeskytte NBD-C2Lact-konstruksjonen under flash-frysing. Mål den endelige proteinkonsentrasjonen.
    9. Forbered 50 μL aliquots protein i 0,5 ml snap-cap mikrocentrifuge rør. Flash-fryse rørene i flytende nitrogen, og lagre dem ved -80 °C.

2. Rensing av NBD-PHFAPP

MERK: Prosedyren for å produsere og merke PHFAPP er identisk med den for NBD-C2Lact til overføringen av NBD-C2Lact-løsningen til en sentrifugalfilterenhet i trinn 1.3.4. Fra dette trinnet og fremover følger du protokollen som er beskrevet nedenfor.

  1. Etter konsentrasjonstrinnet, hold 2 ml NBD-PHFAPP ved 4 °C i mørket i ikke mer enn 1 dag før du utfører størrelsesekskluderingskromatografi. Før størrelsesekskluderingskromatografi må du kontrollere at det ikke er noen oransje avsetning (aggregering under konsentrasjon) nederst på røret. Hvis dette er tilfelle, sentrifugerer du prøven ved 540 000 × g i 10 min ved 4 °C, og renser supernatanten ved størrelsesekskluderingskromatografi.
    MERK: Størrelsesekskluderingskromatografi utføres på en kolonne fullpakket med krysskoblet dekstran-akrylamidkopolymer (se materialtabellen), tidligere likevektet med TND-buffer, ved hjelp av et raskt proteinvæskekromatografisystem (se materialtabellen). Kolonnen må beskyttes mot lys. En strømningshastighet på 1 ml/min ble brukt, og elutionen av NBD-PHFAPP-konstruksjonen ble etterfulgt av registrering av absorbansen ved λ = 280 (protein) og 480 nm (NBD) ved kolonneutgangen.
    1. Injiser NBD-PHFAPP-prøven som er lastet inn i en 2 ml injeksjonssløyfe på kolonnen, og samle umiddelbart 2,5 ml fraksjoner av eluate.
  2. Analyser alle fraksjonene som tilsvarer hovedtoppen som er oppdaget ved 280 og 480 nm på en 15% SDS-PAGE gel. Bland en 25 μL prøve av hver brøkdel med 15 μL Laemmli prøvebuffer før oppvarming og lasting på gelen.
    MERK: En hovedtopp, som samtidig oppdages ved λ = 280 og 480 nm, vises når et volum på ~ 150 ml buffer passerer gjennom kolonnen.
  3. Legg sammen brøkene som utelukkende inneholder NBD-PHFAPP-protein (~12,2 kDa), og tilsett glyserol ved en endelig konsentrasjon på 10 % (v/v). Konsentrer prøven ved hjelp av en sentrifugalfilterenhet med en MWCO på 3 kDa til et endelig volum på 1 ml ved hjelp av en sentrifugeringshastighet på 2300 × g.
  4. Forbered aliquots, og registrer et absorbansspekter som beskrevet for NBD-C2Lact. Bruk en utryddelseskoeffisient ε = 29 450 M-1,cm-1 for å bestemme konsentrasjonen av proteinet basert på absorbansen målt ved λ = 280 nm.

3. Tilberedning av liposomer for PS og PI(4)P ekstraksjon eller overføringsanalyser

MERK: Utfør alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert. Håndter organiske løsningsmidler, rotavapor og flytende nitrogen med forsiktighet.

  1. Forbered fersk, filtrert og avgasset 50 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES)-kaliumhydroksid (KOH), pH 7,4, 120 mM kaliumacetat (HK) buffer.
  2. For hver type liposome, ta nøyaktige mengder forskjellige lipider fra lagerløsninger, og bland dem i en 25 ml pæreformet glassflaske (tabell 1). Tilsett ren kloroform for å justere volumet av hver blanding til 1 ml. Merk hver kolbe med liposomets navn. Pakk kolbeene som inneholder lipidblanding dopet med Rhod-PE med aluminiumsfolie.
  3. Plasser kolben på en roterende fordamper. Tørk lipidene under vakuum og ved 25 °C i minst 30 minutter med en rotasjonshastighet på 500 o/min. For lipidfilmer som inneholder PI(4)P, må du forvarme kolben ved 32-34 °C i 5 minutter, under skånsom rotasjon, for å blande PI(4)P riktig med de andre lipidene før du lager vakuum i kolben for å fjerne løsningsmidlet, som etterlater en film med tørre lipider på kolbeveggen.
  4. Koble kolben fra fordamperen, og plasser den i et vakuumkammer i 45 min for å fjerne eventuelle gjenværende spor av løsningsmiddel. Fyll kolben med 2 ml HK buffer, og tilsett noen glassperler med 4 mm diameter til løsningen. Virvel forsiktig kolben i 2 min for å resuspendere lipidene og forberede multilamellar lipid vesicles (MLVs) med en lipidkonsentrasjon på 4 mM. Forbered 0,5 ml aliquots mlvs i 1,5 ml skruehett mikrocentrifuge rør.
  5. Frys rørene 5x (henholdsvis ved hjelp av flytende nitrogen og et vannbad ved henholdsvis 37 °C). Ekstruder liposomene eller oppbevar dem ved -20 °C.
  6. Bruk en mini ekstruder for å forberede liposomene (dvs. store unilamellar vesicles) fra MLVene i henhold til produsentens retningslinjer. Bruk et polykarbonatfilter med ensartede sylindriske porer med en diameter på 200 nm.
  7. For å forberede hver type liposom, ekstruder minst 250 μL av den tilsvarende suspensjonen av MLVs. Oppbevar de ekstruderte liposomene ved 4 °C og i mørket hvis de inneholder Rhod-PE. Bruk liposomene innen 2 dager.
Lipidsammensetning (mol/mol) Lipid
Liposome navn DOPC
(25 mg/ml)		 DUKKER
(10 mg/ml)		 16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/ml)		 C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/ml)
Ekstraksjonsanalyser Liposome 2 mol% PS PC/PS 98/2 247 μL 12,5 μL
Liposome 2 mol% PI(4)P PC/PI(4)P 98/2 247 μL 153 μL
PC-liposome PC 100 252 μL
Transportanalyser LA  PC/PS/Rhod-PE 93/5/2 234 μL 31,4 μL 200 μL
LA uten PS PC/Rhod-PE 98/2 247 μL 200 μL
LB  PC/PI(4)P 95/5 237 μL 383 μL
LB uten PI(4)P PC 100 252 μL
LA-Eq PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2 234 μL 15,7 μL 200 μL 191 μL
LB-Eq PC/PS/PI(4)P 95/2,5/2,5 239 μL 15,7 μL 191 μL

Tabell 1: Volumer av lipid lagerløsninger som skal blandes for liposompreparat. Forkortelser: PS = fosfatidylserine; PC = fosfatidylkolin; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodamin-merket fosfatidyletanolamin; DOPC = dioleoylfosfatidylkolin; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-3-fosfo-L-serin; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rhodamin B sulfonyl).

4. Måling av PS eller PI(4)P ekstraksjon

MERK: Målinger må utføres ved hjelp av en svart 96-brønnsplate og en fluorescensplateleser utstyrt med monokromoatorer: en for fluorescenseksitasjon og en for utslipp, med variabel båndbredde.

  1. Klargjør fersk, filtrert og avgasset HK-buffer supplert med 1 mM MgCl2 (HKM-buffer). Forbered rene PC-liposomer og PC-liposomer dopet med 2 mol% PS eller 2 mol% PI(4)P (4 mM endelig lipidkonsentrasjon, se tabell 1).
    MERK: Hold rørene fylt med suspensjon av ekstruderte liposomer ved romtemperatur gjennom hele eksperimentet, og hold proteinene på is. Beskytt i tillegg lipidsensorene mot lys.
  2. For PS-ekstraksjonsanalysen blander du liposomer som inneholder 2 mol% PS (80 μM endelig lipidkonsentrasjon, 0,8 μM tilgjengelig PS-konsentrasjon) med NBD-C2Lact (250 nM endelig konsentrasjon) i et sluttvolum på 100 μL. Fyll en annen brønn med samme mengde liposom (80 μM, 2 mol% PS) og NBD-C2Lact (250 nM) blandet med 3 μM LTP (Osh6p som en positiv kontroll eller et protein av interesse).
    MERK: En inkubasjonstid på 5 min er tilstrekkelig for Osh6p for å oppnå lipidutvinning.
  3. Fyll en tredje brønn med NBD-C2Lact (250 nM) blandet med rene PC-liposomer (80 μM). Fyll en fjerde brønn bare med rene PC-liposomer (80 μM). Gjenta trinn 4.2-4.3 for å forberede ytterligere tre serier med fire brønner.
  4. For hver brønn registrerer du et NBD-spektrum fra 505 til 650 nm (båndbredde 5 nm) ved eksitasjon ved 490 nm (båndbredde 5 nm) ved 25 °C. For hver serie trekker du fra spekteret som er registrert med bare liposomer fra det andre spektraet.
    MERK: F og Fmax tilsvarer intensiteten ved 536 nm målt med PS-inneholdende liposomer i nærvær eller fravær av LTP, mens F0 er intensiteten ved samme bølgelengde med rene PC-liposomer. For hver serie er prosentandelen av tilgjengelig PS som ekstraheres av proteinet gitt ved hjelp av følgende formel.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmaks.-F0))) (4)
  5. For PI(4)P ekstraksjonsanalysen, lag liposomer dopet med 2 mol% PI(4)P, og utfør målinger med NBD-PHFAPP-sonden. Utfør kontrolleksperimenter og bestem utvinningsprosenten på samme måte som beskrevet ovenfor.
    MERK: Liposomet og proteinkonsentrasjonen er identiske med de som brukes i PS-ekstraksjonsanalysen.

5. Sanntidsmåling av PS-transport

MERK: Et standard fluormålerformat (90° format) utstyrt med en temperaturkontrollert celleholder og en magnetisk rører brukes til å registrere lipidoverføringskinetikk. For å innhente data nøyaktig, er det viktig å opprettholde prøven permanent ved samme temperatur (sett mellom 25 og 37 °C avhengig av opprinnelsen til proteinet (f.eks.gjær eller menneske)) og for å stadig røre det. Protokollen beskrevet nedenfor er for måling av lipidtransport i en 600 μL prøve inneholdt i en sylindrisk kvartscelle.

  1. Forbered nyavgasset og filtrert HKM-buffer. Hold rørene som inneholder ekstruderte liposomer ved romtemperatur. Vikle rør som inneholder liposomer med Rhod-PE i aluminiumsfolie, og/eller oppbevar dem i en ugjennomsiktig boks for å forhindre fotobleking.
  2. Juster eksitasjons- og utslipps-monokromoatorene ved henholdsvis λ = 460 nm (med kort båndbredde (1-3 nm)) og ved λ = 530 nm (med stor båndbredde (≥ 10 nm)). Sett anskaffelsestiden til 25 min med en tidsoppløsning ≤ 1 s.
  3. I kvarts cuvette, fortynne 30 μL av LA liposome suspensjon og et volum av NBD-C2Lact lagerløsning i forvarsel HKM buffer for å forberede en 570 μL prøve som inneholder 200 μM totale lipider og 250 nM NBD-C2Lact. Tilsett en liten magnetisk rørestang, og plasser cuvette i fluorometerholderen.
  4. Når prøven er termisk likevektet (etter 3-5 min), utløser du målingen. Etter 1 min, tilsett 30 μL L LB liposome suspensjon (endelig konsentrasjon på 200 μM totale lipider) til prøven. Etter 3 min, injiser LTP i prøven slik at den endelige konsentrasjonen av LTP er 200 nM, og skaffe signalet for de resterende 21 min.
  5. Utfør et parallelt eksperiment for å normalisere NBD-signalet. Bland 30 μL LA-Eq liposomfjæring med 250 nM NBD-C2Lakt i HKM-buffer (sluttvolum på 570 μL). Etter 1 min, injiser 30 μL LB-Eq liposole suspensjon.
    MERK: Lipidsammensetningen av LA-Eq- og LB-Eq liposomer ligner på LA- og L B-liposomer som brukes i overføringsanalysen, bortsett fra at hver av dem inneholder 2,5 mol% PS og 2,5 mol% PI (4)P. Som et resultat tilsvarer NBD-signalet som måles, referert til som FEq, signalet som skal måles hvis PS ble fullstendig likevektet mellom LA- og L B-liposomer ved en overføringsprosess.
  6. Konverter de kinetiske kurvene målt med en LTP av interesse for å bestemme mengden PS (i μM) overført fra LA til LB liposomer over tid. Normaliser hvert datapunkt (F) i kurven ved hjelp av følgende formel.
    FNorm = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    der F0 tilsvarer NBD-signalet like før tilsetning av en LTP, og FEq er signalet målt i trinn 5.5.
    MERK: Mengden PS (i μM) overført fra LA til LB liposomer tilsvarer 2,5 × FNorm, med tanke på at likevekten tilsvarer en situasjon der halvparten av tilgjengelige PS-molekyler, i det ytre pakningsvedlegget til L A-liposomene,(dvs., tilsvarende 5 mol% av 0,5 × 200 μM totale lipider) er overført til LB liposomer.

6. Sanntidsmåling av PI(4)P transport

  1. Still inn fluorimeteret (eksitasjons- og utslippsbølgelengde, båndbredde, oppkjøpstid, tidsoppløsning) som gjort for PS-overføringsanalysen. På samme måte bruker du samme buffer, cuvette og liposomer for å utføre forsøkene under konstant omrøring ved samme temperatur.
  2. I cuvette blander du 30 μL LB liposomsuspensjon og NBD-PHFAPP med forhåndsvarslet HKM-buffer for å oppnå et endelig volum på 570 μL (200 μM totale lipider, 250 nM NBD- PHFAPP). Når den termiske likevekten av prøven er nådd, start målingen, og etter 1 min, injiser 30 μL LA liposome suspensjon. Etter 3 min, injiser LTP av interesse (endelig konsentrasjon på 200 nM), og registrer signalet.
  3. Utfør et nytt eksperiment for å normalisere NBD-signalet. Bland 30 μL LB-Eq liposomefjæring med 250 nM NBD-PHFAPP i 570 μL HKM-buffer. Etter 1 min, injiser 30 μL LL A-Eq liposom suspensjon.
    MERK: Her tilsvarer NBD-signalet, referert til som FEq, det som skal måles hvis PI(4)P var fullt likevektsbehandlet mellom LA- og L B-liposomer.
  4. Konverter de kinetiske kurvene for å bestemme mengden PI(4)P (i μM) som overføres fra LB til LA liposomer over tid. Hvert datapunkt (F) normaliseres ved hjelp av formel 5 der F0 tilsvarer NBD-signalet før det legges til et LTP, og FEq er signalet målt i trinn 6.3.
    MERK: Mengden PI(4)P (i μM) overført fra LB til LA liposomer tilsvarer 2,5 × FNorm, med tanke på at likevekten tilsvarer en situasjon der halvparten av PI(4)P inneholdt i det ytre pakningsvedlegget til L B-liposomer (dvs. 0,5 × 5 μM) er overført i LA liposomer.

7. Analyse av kinetikkkurver

  1. Kvantifisere i hvilken grad en LTP er effektiv ved å bestemme hastigheten som denne LTP overfører lipider fra en liposole befolkning til den andre i de første sekundene etter injeksjonen til cuvette.
    1. Utfør en lineær regresjon av de første datapunktene i overføringskinetikken for å få en skråning. Del hellingsverdien ved LTP-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen for å bestemme antall lipidmolekyler overført per protein per tidsenhet (min eller s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Beskrivelse av fluorescerende lipidsensorer og in vitro-analyser. (A) Tredimensjonale modeller av NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP basert på krystallstrukturen til C2-domenet til bovint laktadherin (PDB ID: 3BN648) og NMR-strukturen til PH-domenet til det humane FAPP1-proteinet (PDB ID: 2KCJ46). En N,N'-dimetyl-N-(tioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)etylendiamin moiety, bygget manuelt og energisk minimert, ble podet på tiolfunksjonen til C352 (NBD-C2Lact) og C13 (NBD-PHFAPP) rester (representert som sfærer, med karbon i grønt, nitrogen i blått, oksygen i rødt, svovel i gult og hydrogen i hvitt). Overflaten på lipidbindingsstedet til hver sonde ble farget i blått. (B) Ekstraksjonsanalyser. I PS-ekstraksjonsanalysen ble PC/PS-liposomer (98/2 mol/mol) inkubert med 250 nM NBD-C2Lact. I fravær av utvinning er sonden sterkt bundet til liposomene, noe som resulterer i et blått skifte av NBD-fluorescens og en økning av utslippsintensiteten. Hvis PS-ekstraksjon skjedde i nærvær av en LTP(f.eks. Osh6p), ble sonden dissosiert fra liposomene, og fluorescensen var lavere. I PI(4)P ekstraksjonsanalysen ble liposomer dopet med 2 mol% PI(4)P, og 250 nM NBD-PHFAPP ble brukt. (C) FRET-baserte lipidtransportanalyser. I PS transportanalyse ble PC/PS/Rhod-PE liposomer (93/5/2 mol/mol, LA) inkubert med 250 nM NBD-C2Lact. PC liposomer (LB), dopet eller ikke med 5 mol% PI(4)P, og Osh6p ble sekvensielt lagt til ved henholdsvis t = 1 min og t = 4 min. Hvis PS-transport oppstår, fremkaller dette en dequenching av NBD-signalet som tilsvarer translokasjonen av NBD-C2Lact fra LA til LB liposomer. I PI(4)P transportanalysen ble L B-liposomer dopet med 5 mol% PI(4)P inkubert med 250 nM NBD-PHFAPP. PC liposomer (LA) dopet eller ikke med 5 mol% PS ble lagt til. Hvis PI(4)P transport oppstår, forårsaker dette en slukking av NBD-signalet på grunn av translokasjon av NBD-PHFAPP fra LB til LA liposomer. Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NMR = kjernemagnetisk resonans; FAPP1 = firefosfat-adapterprotein 1; PDB = Protein Data Bank; PS = fosfatidylserine; PC = fosfatidylkolin; LTP = lipidoverføringsprotein; Osh6p = oksysterolbindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat; FRET = fluorescens resonans energioverføring; Rhod-PE = rhodamin-merket fosfatidyletanolamin; LEt liposomer = liposomer sammensatt av PC, dopet med 2 mol% Rhod-PE, og inneholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer som inneholder 5 mol% PI(4)P. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2A viser en SDS-PAGE-analyse av produktene fra forskjellige trinn som fører til rensing av C2Lact. Lane 1 viser proteinprofilen til de lysede bakteriene som uttrykker GST-C2Lact (~ 44,8 kDa), mens baner 2 og 3 henholdsvis viser proteinprofilene til supernatant og bakteriell rusk etter ultracentrifugation. Sammenligningen av disse banene viser at GST-C2Lact har blitt gjenvunnet i supernatanten og dermed kan isoleres ved hjelp av glutathione-tilknyttede agaroseperler. Baner 4 og 5 viser proteinprofilene til supernatanten etter inkubasjon med perler og vasker gjenvunnet av tyngdekraften, mens bane 6 viser profilen til proteiner som har blitt beholdt på perlene. En analyse av disse banene indikerer at nesten alle GST-C2Lact har blitt gjenvunnet fra perlene.

Lanes 8-12 viser tilstedeværelsen av et stort band som tilsvarer C2Lact (~ 17,9 kDa) i supernatantene som ble gjenvunnet gjennom påfølgende vasker av perlene etter trombinbehandling. Lane 13 indikerer at ikke-cleaved GST-C2Lact, sammen med GST (~ 26.9 kDa), forble bundet til perler etter denne behandlingen. Sammenligningen av disse banene indikerer at spaltingsprosedyren, om enn ikke 100% effektiv, ga C2Lact som da ble fluorescerende merket. Figur 2B viser et ultrafiolett (UV)-synlig absorbansspekter av C2Lakt merket med NBD. Siden konstruksjonen er 100% ren, bekrefter disse resultatene at alle C2 Lact-molekyler ble merket med en NBD-gruppe basert på den optiske tettheten målt ved 280 nm (Trp) og 495 nm (NBD). Renheten til NBD-C2Lact og dens fluorescens ble bestemt av SDS-PAGE-analyse (Figur 2C).

Figure 2
Figur 2: NBD-C2Laktrensing. (A) SDS-PAGE-analyse ble brukt til å kontrollere tilstedeværelsen av proteinet på forskjellige trinn i renseprosedyren før merking. Pilspissene angir plasseringen av C2Lact-domenet (rød pilspiss), bare for GST (grå pilspiss) og GST-C2Lact-konstruksjonen (svart pilspiss). (B) UV-synlig absorbansspekter av NBD-C2Lakt. (C) SDS-PAGE analyse av renset NBD-C2Lact. Det første bildet ble anskaffet under UV-belysning uten farging og avslører tilstedeværelsen av NBD-C2Lact-konstruksjonen da den avgir fluorescens. Det andre bildet viser samme gel etter en proteinfargingsprosedyre (se materialtabellen). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)) etylendiamin moiety knyttet til tiolfunksjonen til C352 rester av en reengineered versjon av C2-domenet til bovint laktadherin (PDB ID: 3BN648); PDB = Protein Data Bank; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese; GST = glutathione S-transferase; MW = markør for molekylvektstørrelse; UV = ultrafiolett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 viser resultatene fra PS- og PI(4)P-ekstraksjonsanalyser ved hjelp av Osh6p. Når den bare inkuberes med liposomer som inneholder 2 mol% PS, var fluorescensen til NBD-C2Lact maksimal da NBD fluorofor ble satt inn i membranen (dvs. en hydrofob kontekst), noe som indikerer at sensoren var membranbundet. I nærvær av Osh6p var fluorescensen lavere og sammenlignbar med den som ble målt med rene PC-liposomer (figur 3A). Normaliseringen av intensitetsverdier ved 536 nm indikerte at ~ 75% av tilgjengelig PS ble trukket ut. I den andre analysen ble NBD-PHFAPP blandet med liposomer som inneholder 2 mol% PI (4)P. NBD-signalet var høyt uten Osh6p, men lavt når Osh6p var til stede og lignet det som ble målt med PI(4)P-frie liposomer (figur 3B). En analyse av intensiteten viste at ~100 % av tilgjengelig PI(4)P ble ekstrahert av LTP.

Figure 3
Figur 3: Ekstraksjonsanalyser. (A) Fluorescensspektra av NBD-C2-lakt (250 nM) målt ved eksitasjon ved 460 nm i nærvær av liposomer (80 μM, 2 mol% PS) i fravær eller tilstedeværelse av 3 μM Osh6p. Referansespektra ble registrert med rene PC-liposomer inkubert eller ikke med NBD-C2Lact (venstre panel). Flere spektra ble registrert fra ulike brønnserier, korrigert ved å trekke bakgrunnsspredningssignalet fra DOPC-liposomer alene og gjennomsnittet (n = 4, ± SEM). Prosentandelen av tilgjengelig PS som ble trukket ut er angitt (høyre panel). (B) Fluorescensspektra av NBD-PHFAPP (250 nM) blandet med liposomer (80 μM, 2 mol% PI(4)P) i fravær eller tilstedeværelse av 3 μM Osh6p. Referansespektra tatt opp med PC-liposomer i nærvær og fravær av sensoren vises (venstre panel). Flere spektra ble registrert fra ulike brønnserier, korrigert ved å trekke bakgrunnsspredningssignalet fra DOPC-liposomer alene og gjennomsnittet (n = 4, ± SEM). Prosentandelen tilgjengelig PI(4)P som ble trukket ut, er angitt (høyre panel). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)) etylendiamin moiety knyttet til tiolfunksjonen til C352 rester av en reengineered versjon av C2-domenet til bovint laktadherin (PDB ID: 3BN648); PDB = Protein Data Bank; PS = fosfatidylserine; PC = fosfatidylkolin; DOPC = dioleoylfosfatidylkolin; Osh6p = oksysterolbindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat; SEM = standardfeil av gjennomsnittet; a.u. = vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4A viser typiske resultater fra en PS-overføringsanalyse som bruker Osh6p som LTP. På tidspunktet null ble NBD-C2Lact blandet med LA liposomer som inneholder 5 mol% 16:0/18:1-PS (POPS) og 2 mol% Rhod-PE i et volum på 570 μL HKM buffer ved 30 °C. Da sonden var bundet til L A-liposomer, ble signalet slokket på grunn av FRET med Rhod-PE til stede i disse liposomene. Etter ett minutt ble Rhod-PE-frie L B-liposomer (30 μL) tilsatt; Dette var forventet å bare fremkalle en liten endring i signalet på grunn av lysdiffusjon av denne andre liposompopulasjonen og / eller en fortynningseffekt. Signalintensiteten etter tilsetningen av L B-liposomene tilsvarer F0. Injeksjonen av noen få μL av en lagerløsning av Osh6p (vanligvis 40 μM) for å fortynne 200 nM av proteinet i reaksjonsblandingen fremkalte en langsom økning i NBD-signalet på grunn av dequenching av fluoroforen da PS ble transportert fra LA til LB liposomer, og dermed fremme translokasjonen av NBD-C2Lact.

Da L B-liposomer inneholdt 5 mol% PI(4)P, var dequenching mye raskere, da PS ble overført raskere av Osh6p til L B-liposomer på grunn av motekschangen av PS med PI (4)P av LTP (andre kurve). Den tredje kurven tilsvarer et eksperiment der NBD-C2Lact ble blandet med like store mengder LA-Eq og LB-Eq liposomer. Signalet var høyere enn F0 og korresponderte med en situasjon der sonden var jevnt bundet til LA- og L B-liposomer, og dermed reflekterte en situasjon der PS var fullt ut likevektet mellom de to populasjonene av liposomer. FEq ble beregnet ved å beregne verdien av signalet målt i de siste 5 min av eksperimentet.

Figure 4
Figur 4: Typisk PS-transportkinetikk målt med Osh6p og referansekurve. (A) LB liposomer uten PI(4)P (200 μM totalt lipider) og Osh6p (200 nM) ble sekvensielt lagt til en cuvette som inneholder NBD-C2Lact (250 nM) og LA liposomer (200 μM) dopet med 5 mol% PS og 2 mol% Rhod-PE (venstre). Det samme eksperimentet ble utført med LB liposomer dopet med 5 mol% PI (4)P (midtkurve). For å bestemme FEqble NBD-C2Lact (250 nM) forhåndsmikset med LA-Eq liposomer; Deretter ble LB-Eq liposomer lagt til (høyre kurve). (B) Gjennomsnittlige PS-transportkurver bestemt etter normalisering av flere målinger gjort ved hjelp av L B-liposomer med eller uten PI(4)P (gjennomsnittlig ± SEM, n=3). (C) Innledende PS-overføringshastigheter (gjennomsnittlig ± SEM, n=3). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-C2Lakt = N,N'-dimetyl-N-(tioacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)) etylendiamin moiety knyttet til tiolfunksjonen til C352 rester av en reengineered versjon av C2-domenet til bovint laktadherin (PDB ID: 3BN648); PDB = Protein Data Bank; PS = fosfatidylserine; Osh6p = oksysterolbindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodamin-merket fosfatidyletanolamin; LEt liposomer = liposomer sammensatt av fosfatidylkolin, dopet med 2 mol% Rhod-PE, og inneholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer som inkorporerer 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens tilsvarende NBD før tilsetning av Osh6p; FEq = fluorescenssignal hvis PS er fullstendig likevekts mellom LA- og L B-liposomer ved en overføringsprosess; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4B viser gjennomsnittlige kinetiske kurver av PS-overføring fra L A-liposomer til LB-liposomer, dopet eller ikke dopet med PI(4)P etter normaliseringen av F-data ved hjelp av F0 og FEq som referanseverdier. Den første transporthastigheten for hvert eksperiment ble beregnet ved å tilpasse de første datapunktene målt etter injeksjonen av proteinet med en lineær funksjon. Figur 4C viser den gjennomsnittlige innledende PS-transportraten bestemt fra tre forskjellige eksperimenter ved hjelp av L B-liposomer med eller uten PI(4)P. Da L B-liposomer inneholdt henholdsvis 0 og 5 mol% PI(4)P, var ratene henholdsvis lik 1,4 og 15,8 PS.min -1 per Osh6p-molekyl. Figur 5A viser typiske resultater fra en PI(4)P overføringsanalyse ved bruk av Osh6p som LTP, som ble utført med de samme materialene og betingelsene som de som ble brukt til PS-transportanalysen.

Figure 5
Figur 5: Typisk PI(4)P transportkinetikk målt med Osh6p og referansekurve. (A) PS-frie liposomer som inneholder 2 mol% Rhod-PE (LA,200 μM totale lipider) og Osh6p (200 nM) ble sekvensielt lagt til en cuvette som inneholder NBD-PHFAPP (250 nM) og LB liposomer (200 μM) dopet med 5 mol PI% PI(4)P (venstre) P (venstre). Det samme eksperimentet ble utført med LA liposomer dopet med 5 mol% PS (midtkurve). For å bestemme FEqble NBD-PHFAPP (250 nM) forhåndsmikset med LB-Eq liposomer; Deretter ble LA-Eq liposomer lagt til (høyre kurve). (B) PI(4)P overføring kinetikk bestemt etter normalisering av flere målinger av LA liposomer med eller uten PS (gjennomsnittlig ± SEM, n = 3). (C) Innledende PI(4)P overføringshastigheter (gjennomsnitt ± SEM, n=3). Forkortelser: NBD = 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol fluorofor; NBD-PHFAPP = NBD-merket Pleckstrin homology domene av humant fire-fosfat-adapter protein 1 (FAPP1, UniProt: Q9HB20, segment [1-100]); PS = fosfatidylserine; Osh6p = oksysterolbindende protein (OSBP) homolog 6 protein; PI(4)P = fosfatidylinositol 4-fosfat; Rhod-PE = rhodamin-merket fosfatidyletanolamin; LEt liposomer = liposomer sammensatt av fosfatidylkolin, dopet med 2 mol% Rhod-PE, og inneholder eller ikke 5 mol% PS; LB liposomer = liposomer som inkorporerer 5 mol% PI(4)P; F = fluorescens; F0 = fluorescens tilsvarende NBD før tilsetning av Osh6p; FEq = fluorescenssignal hvis PI(4)P er fullt likevektsbehandlet mellom LA- og L B-liposomer ved en overføringsprosess; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

På tidspunktet null ble NBD-PHFAPP blandet med L B-liposomer som inneholder 5 mol% PI(4)P i et volum på 570 μL HKM-buffer. Fordi NBD-PHFAPP var bundet til L B-liposomer, var signalet høyt. Etter ett minutt ble LA liposomer (30 μL) tilsatt, noe som var forventet å bare fremkalle en liten endring i signalet. Intensiteten korresponderte deretter med F0. Injisering av Osh6p (200 nM endelig konsentrasjon) i reaksjonsblandingen utløste en slukking av NBD-signalet på grunn av translokasjon av NBD-PHFAPP-molekyler til LA-liposomer da PI(4)P ble overført fra LB-liposomer til LA liposomer. Da LA liposomer inneholdt 5 mol% POPS, var dequenching mye raskere på grunn av en raskere PI (4)P overføring som følge av PS / PI (4) P utveksling. Den tredje kurven tilsvarer et eksperiment der NBD-PHFAPP ble blandet med like store mengder LA-Eq og LB-Eq liposomer.

Signalet var lavere enn F0 da det tilsvarte en situasjon der sonden var jevnt bundet til LA- og L B-liposomer, og dermed indikerer en full likevekt av PI(4)P mellom liposomene. FEq ble beregnet ved å beregne verdien av signalet målt i de siste 5 min av eksperimentet. Figur 5B,C viser gjennomsnittlige kinetikkkurver oppnådd etter signal normalisering og gjennomsnittlig PI(4)P innledende overføringshastigheter målt med LA liposomer som ble dopet eller ikke dopet med 5 mol% PS. Her er det verdt å merke seg at begge lipidligandene ble transportert raskere og med lignende hastigheter når hver lipid i utgangspunktet var til stede i henholdsvis LA- og L B-membraner, noe som indikerer at Osh6p er en PS / PI (4) P-veksler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultatene av disse analysene er direkte avhengige av signalene fra fluorescerende lipidsensorer. Dermed er rensing av disse sondene merket med et 1: 1-forhold med NBD og uten gratis NBD fluoroforurensing et kritisk skritt i denne protokollen. Det er også obligatorisk å sjekke om LTP under eksamen er riktig brettet og ikke aggregert. Mengden LTP som testes i ekstraksjonsanalysene må være lik eller høyere enn for tilgjengelige PS- eller PI(4)P-molekyler for å kunne måle om denne LTP-en effektivt trekker ut disse lipidene. Faktisk binder NBD-C2Lact og NBD-PHFAPP seg til henholdsvis PS og PI(4)P, etter en klassisk metningsbindingskurve. Gitt deres respektive affiniteter for PS og PI(4)P, forblir disse sondene i stor grad bundet til liposomene selv om liposomene inneholder gjenværende spor av disse ligandene. Dette kan føre til den feilaktige konklusjonen at en LTP ikke effektivt trekker ut disse lipidene. Protokollen er avhengig av standard og kommersielt tilgjengelige underarter av PC, PS og PI(4)P som er henholdsvis 18:1/18:1-PC, 16:0/18:1-PS og 16:0/16:0-PI(4)P. Å utføre eksperimenter ved hjelp av lipidarter med andre acylkjeder kan gi forskjellige resultater, som tidligere rapportert12,35.

I overføringsanalysene, hvis bulk lipidsammensetningen (ikke vurderer PS eller PI(4)P) av LA- og L B-liposomer må endres, er det viktig å også utføre kontrolleksperimentene ved hjelp av LA-Eq og LB-Eq liposomer med en bulksammensetning som ligner på LA- og L B-liposomer, henholdsvis. Det samme prinsippet gjelder for utvinningsanalysene. Genetisk kodede fluorescerende lipidbindingsdomener brukes i stor grad til å analysere lipidfordeling i celle44. Forsiktighet anbefales ved analyse av slike eksperimenter som foreningen av disse lipidsondene med membranen, men primært drevet av tilstedeværelsen av den målrettede lipiden, kan påvirkes av andre parametere (tetthet av anioniske lipider, lipidpakking) som varierer mellom cellerom. I disse in vitro-analysene er sammensetningen av liposomer mye enklere enn for cellulære membraner: de er for det meste laget av PC, en zwitterionic lipid, og dermed utsette en ganske inert overflate som ikke påvirker hvordan PS og PI (4) P gjenkjennes av deres tilsvarende sensor. PHFAPP kan brukes i nærvær av anioniske lipider, som PS, fosfatidsyre (PA) og PI32, og C2Lact gjenkjenner ikke PI(4)P12; Begge disse observasjonene tillater objektive målinger av PS/PI(4)P utveksling. NBD-PHFAPP påvirkes ikke av sterol43.

Det er imidlertid ikke kjent om disse sondene, spesielt NBD-C2Lact, kan brukes med liposomer med ekstreme egenskaper(f.eks. svært lav eller høy lipidpakking, svært negativt ladet overflate, tilstedeværelse av lipiddomener). Til tross for denne potensielle begrensningen med hensyn til liposomsammensetning, har disse overføringsanalysene basert på fluorescerende sensorer enorme fordeler sammenlignet med andre metoder. For det første er de ikke avhengige av fluorescerende merket PS og PI(4)P som bærer en ekstra stor gruppe og sannsynligvis ikke er riktig innkvartert av bindingslommen til LTPer. For det andre tilbyr disse analysene langt bedre tidsoppløsning enn metoder basert på liposomseparasjon (radioaktivitetsbaserte analyser45 eller massespektrometri33), og det skal bemerkes at radiomerket PI(4)P og PS ikke er kommersielt tilgjengelige. Kapasiteten til et protein for å overføre PS eller PI(4)P påvirkes ikke av foreningen av fluorescerende sensorer med liposomer. Faktisk, hvis mengden NBD-C2Lact eller NBD-PHFAPP og PS og PI(4)P i det ytre pakningsvedlegget av liposomer som er tilgjengelige for LTP vurderes, er bare 5% av PS eller PI (4)P forbundet med sonde under en kinetikkmåling.

Videre er bare 0,55-0,86% av membranoverflaten dekket av sonden, med tanke på den totale overflaten av liposomer (LA+LB liposomer; 5,1 ×10 16 nm 2 med et areal på 0,7 nm2 per lipid), membranoverflaten som ett enkelt C2- eller PH-molekyl kan oppta (henholdsvis ≈3,1 og 4,8 nm2, estimert fra referanse46 , 47,48) og konsentrasjonen (250 nM). Dermed er prinsippene bak disse analysene tilpasset for å analysere de kinetiske og mekanistiske aspektene ved LTP-er på riktig måte. Som nevnt i introduksjonen, kan endringer i aktiviteten til ORP5/8 føre til cellulære dysfunksjoner49. For eksempel ser invasiviteten til kreftceller i bukspyttkjertelen ut til å stole på nivået av ORP5-uttrykk. Videre eksisterer en kausalitet mellom høye nivåer av ORP5-uttrykk og den dårlige prognosen for human bukspyttkjertelkreft. Et høyt nivå av ORP5-uttrykk oppdages også i lungesvulstvev, og mer spesielt i metastatiske tilfeller. Interessant nok kan ORP5s evne til å overføre lipider forklare hvorfor det fremmer celleproliferasjon og migrasjon.

ORP5 oppregulerer pattedyrmålet for rapamycinkompleks 1 (mTORC1) kompleks, som spiller en sentral rolle i celleoverlevelse og spredning, sannsynligvis fordi det forbedrer aktiviteten til Akt, en oppstrøms aktivator av mTORC1, ved å forsyne statsministeren med PS. Totalt sett antyder disse observasjonene at ORP5 kan være et interessant farmakologisk mål, og at disse in vitro-analysene kan tjene til å screene molekyler som er i stand til å hemme aktiviteten. Denne analysen kan også bidra til å bedre definere om andre medlemmer av ORP/Osh-familien er PS/PI(4)P-vekslere. Orp10 ble funnet å innkapsle PS in vitro og overføre PS i ER-Golgi kontaktsider27,50, men det er fortsatt ukjent om det fungerer som en PS / PI (4) P-utveksling. Videre kan disse protokollene tjene til å utforske evnen til LTPer som tilhører andre familier til å transportere PI(4)P, som nylig ble vist med steroidogene akutte regulatoriske overføringslignende proteiner10, eller PS. I tillegg har NBD-PHFAPP blitt brukt til å følge LTPs evne til å transportere PI (4,5) P2 mellom liposomer, som det gjenkjenner denne PIP10, 35. Til slutt kan denne strategien tilpasses for å måle andre utvinnings- eller transportprosesser in vitro ved hjelp av andre lipidbindende domener (f.eks. en ikke-katalytisk PI-PLC for å oppdage PI51, sporuleringsspesifikk protein 20 fragment for å oppdage PA52, domene 4 (D4) perfringolysin O for å oppdage sterol53).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til dr. A. Cuttriss for hennes grundige korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet er finansiert av det franske nasjonale forskningsbyrået ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) og av CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

Biokjemi Utgave 169 lipidoverføringsprotein OSBP-relatert protein fosfatidylserin fosfatidylinositol 4-fosfat fluorescens rekombinant protein liposom
Fluorescensbaserte målinger av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutveksling mellom membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, … More

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter