Method Article

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

DOI:

10.3791/62180

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February 4th, 2021

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1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Verfahren zur Exprimisierung und Reinigung von Myosin 5a vorgestellt, gefolgt von einer Diskussion seiner Charakterisierung, wobei sowohl Ensemble- als auch Einzelmolekül-In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierte Assays verwendet werden, und wie diese Methoden für die Charakterisierung von nichtmuskleärem Myosin 2b modifiziert werden können.

Abstract

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Myosinproteine binden und interagieren mit filamentösem Aktin (F-Aktin) und kommen in Organismen im gesamten phylogenetischen Baum vor. Ihre Struktur und enzymatischen Eigenschaften sind an die jeweilige Funktion angepasst, die sie in Zellen ausführen. Myosin 5a geht prozessiv auf F-Aktin, um Melanosomen und Vesikel in Zellen zu transportieren. Umgekehrt fungiert das nichtmusklele Myosin 2b als bipolares Filament mit etwa 30 Molekülen. Es bewegt F-Aktin der entgegengesetzten Polarität in Richtung des Zentrums des Filaments, wo die Myosinmoleküle asynchron arbeiten, um Aktin zu binden, einen Kraftschlag zu verleihen und zu dissoziieren, bevor sie den Zyklus wiederholen. Nichtmuskleles Myosin 2b hat zusammen mit seinen anderen nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen Rollen, die Zelladhäsion, Zytokinese und Spannungserhaltung umfassen. Die Mechanochemie von Myosinen kann durch die Durchführung von In-vitro-Motilitätstests mit gereinigten Proteinen untersucht werden. Beim Gleitaktinfilament-Assay werden die Myosine an eine mikroskopisch kleine Decklip-Oberfläche gebunden und translozieren fluoreszierend markiertes F-Aktin, das verfolgt werden kann. Im Einzelmolekül/Ensemble-Motilitätstest wird F-Aktin jedoch an einen Coverslip gebunden und die Bewegung fluoreszierend markierter Myosinmoleküle auf dem F-Actin beobachtet. In diesem Bericht wird die Aufreinigung von rekombinantem Myosin 5a aus Sf9-Zellen mittels Affinitätschromatographie skizziert. Im Anschluss skizzieren wir zwei fluoreszenzmikroskopiebasierte Assays: den Gleit-Aktin-Filament-Assay und den Inverted Motility Assay. Aus diesen Assays können Parameter wie Aktintranslokationsgeschwindigkeiten und Einzelmoleküllauflängen und -geschwindigkeiten mit der Bildanalysesoftware extrahiert werden. Diese Techniken können auch angewendet werden, um die Bewegung einzelner Filamente der nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen zu untersuchen, die hier im Zusammenhang mit nichtmuskleärem Myosin 2b diskutiert werden. Dieser Workflow stellt ein Protokoll und eine Reihe quantitativer Werkzeuge dar, mit denen die Einzelmolekül- und Ensembledynamik von nichtmuskleären Myosinen untersucht werden kann.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myosine sind Motorproteine, die Kraft auf Aktinfilamente ausüben, indem sie die Energie aus der Adenosintriphosphat (ATP)-Hydrolysenutzen 1. Myosine enthalten eine Kopf-, Hals- und Schwanzdomäne. Die Kopfdomäne enthält die Aktinbindungsregion sowie den Ort der ATP-Bindung und Hydrolyse. Die Halsdomänen setzen sich aus IQ-Motiven zusammen, die an Leichte Ketten, Calmodulin oder Calmodulin-ähnliche Proteinebinden 2,3. Die Schwanzregion hat mehrere Funktionen, die für jede Klasse von Myosinen spezifisch sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dimerisierung von zwei schweren Ketten, die Bindung von Frachtmolekülen und die Regulierung des Myosins durch autoinhibitorische Wechselwirkungen mit den Kopfdomänen1.

Die beweglichen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen. Einige dieser Eigenschaften umfassen das Tastverhältnis (der Anteil des mechanischen Zyklus von Myosin, in dem das Myosin an Aktin gebunden ist) und die Prozessivität (die Fähigkeit eines Motors, vor dem Ablösen mehrere Schritte auf seiner Spur zu machen)4. Die über 40 Klassen von Myosinen wurden anhand von Sequenzanalysen5,6,7,8bestimmt. Die Myosine der Klasse 2 werden als "konventionell" eingestuft, da sie die ersten waren, die untersucht wurden; alle anderen Klassen von Myosinen werden daher als "unkonventionell" eingestuft.

Myosin 5a (M5a) ist ein Myosin der Klasse 5 und ist ein prozessiver Motor, was bedeutet, dass es mehrere Schritte entlang des Aktins machen kann, bevor es sich dissoziiert. Es hat ein hohes Tastverhältnis, was darauf hindeutet, dass es einen großen Teil seines mechanischen Zyklus an Aktin9,10,11,12,13,14gebunden ist . Wie andere Myosine enthält die schwere Kette eine N-terminale Motordomäne, die sowohl eine Aktinbindungs- als auch eine ATP-Hydrolysestelle umfasst, gefolgt von einer Halsregion, die als Hebelarm dient, mit sechs IQ-Motiven, die an essentielle Leichtketten (ELC) und Calmodulin (CaM)binden 15. Der Schwanzbereich enthält α-spiralförmige Coils, die das Molekül dimerisieren, gefolgt von einem kugelförmigen Schwanzbereich zur Bindung von Fracht. Seine Kinetik spiegelt seine Beteiligung am Transport von Melanosomen in Melanozyten und des endoplasmatischen Retikulums in Purkinje-Neuronen16,17wider. M5a gilt als prototypischer Gütertransportmotor18.

Klasse-2-Myosine oder die herkömmlichen Myosine umfassen die Myosine, die die Kontraktion der Skelett-, Herz- und glatten Muskulatur zusätzlich zu den nichtmuskleären Myosin-2 (NM2)-Isoformen NM2a, 2b und 2c19antreiben. Die NM2-Isoformen befinden sich im Zytoplasma aller Zellen und haben eine gemeinsame Rolle bei der Zytokinese, Adhäsion, Gewebemorphogenese und Zellmigration19,20,21,22. Dieser Artikel diskutiert konventionelle Myosinprotokolle im Kontext von nichtmuskleellem Myosin 2b (NM2b)23. NM2b hat im Vergleich zu M5a ein niedriges Tastverhältnis und ist enzymatisch langsamer mit einem Vmax von 0,2 s-123 im Vergleich zu M5as Vmax von ≈18 s-124. Bemerkenswerterweise bewegen sich abgeschnittene NM2b-Konstrukte mit zwei Köpfen nicht ohne weiteres prozessiv auf Aktin; Vielmehr führt jede Begegnung mit Aktin zu einem Kraftschlag, gefolgt von einer Dissoziation desMoleküls 25.

NM2b enthält zwei myosinschwere Ketten mit jeweils einer kugelförmigen Kopfdomäne, einem Hebelarm (mit einer ELC und einer regulatorischen Leichtkette (RLC)) und einer α-helikalen Coiled-Coil-Rod/Tail-Domäne, etwa 1.100 Aminosäuren lang, die diese beiden schweren Ketten dimerisiert. Die enzymatische Aktivität und der Strukturzustand von NM2b werden durch Phosphorylierung des RLC23reguliert. Unphosphoryliertes NM2b nimmt in Gegenwart von ATP und physiologischen Ionenstärken (ca. 150 mM Salz) eine kompakte Konformation an, bei der die beiden Köpfe an einer asymmetrischen Wechselwirkung teilnehmen und der Schwanz an zwei Stellen23über die Köpfe zurückklappt. In diesem Zustand interagiert das Myosin nicht stark mit Aktin und hat eine sehr geringe enzymatische Aktivität. Bei RLC-Phosphorylierung durch Calmodulin-abhängige Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK) oder Rho-assoziierte Proteinkinase dehnt sich das Molekül aus und assoziiert sich mit anderen Myosinen durch den Schwanzbereich, um bipolare Filamente von etwa 30 Myosinmolekülen zu bilden23. Die vorgenannte Phosphorylierung des RLC führt auch zu einer erhöhten Aktin-aktivierten ATPase-Aktivität von NM2b um etwa das Vierfache26,27,28. Diese bipolare Filamentanordnung mit vielen Myosinmotoren an jedem Ende ist für Rollen bei der Kontraktions- und Spannungserhaltung optimiert, bei denen Aktinfilamente mit entgegengesetzten Polaritäten relativ zueinander bewegt werden können23,29. Dementsprechend hat sich gezeigt, dass NM2b als Einzensemble von Motoren fungiert, wenn es mit Aktin interagiert. Die große Anzahl von Motoren in diesem Filament ermöglicht es NM2b-Filamenten, sich prozessiv auf Aktinfilamenten zu bewegen, wodurch die Prozessivität des In-vitro-Filaments charakterisiert werdenkann 29.

Während Fortschritte beim Verständnis der Rolle von Myosinen in der Zelle erzielt wurden, besteht die Notwendigkeit, ihre individuellen Eigenschaften auf Proteinebene zu verstehen. Um Actomyosin-Interaktionen auf einer einfachen Protein-Protein-Interaktionsebene und nicht innerhalb einer Zelle zu verstehen, können wir rekombinante Myosine für die Verwendung in In-vitro-Studien exprimieren und reinigen. Die Ergebnisse solcher Studien informieren Mechanoobiologen dann über die biophysikalischen Eigenschaften spezifischer Myosine, die letztendlich komplexe zelluläre Prozesse antreiben12,13,14,25,29. Typischerweise wird dies erreicht, indem einem Myosinkonstrukt in voller Länge oder einem abgeschnittenen Myosinkonstrukt ein Affinitäts-Tag hinzugefügt und mittels Affinitätschromatographie29,30,31aufgereinigt wird. Darüber hinaus kann das Konstrukt so konstruiert werden, dass es ein genetisch kodierbares Fluorophor oder ein Tag für die Proteinmarkierung mit einem synthetischen Fluorophor enthält. Durch Hinzufügen einer solchen fluoreszierenden Markierung können Einzelmolekül-Bildgebungsstudien durchgeführt werden, um die Myosinmechanik und -kinetik zu beobachten.

Nach der Reinigung kann das Myosin auf verschiedene Arten charakterisiert werden. Die ATPase-Aktivität kann mit kolorimetrischen Methoden gemessen werden, die Einenschluss über den Gesamtenergieverbrauch und die Aktinaffinität des Motors unter verschiedenen Bedingungen geben32. Um mehr über die Mechanochemie seiner Motilität zu erfahren, sind weitere Experimente erforderlich. Dieser Artikel beschreibt zwei auf In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie basierende Methoden, mit denen die beweglichen Eigenschaften eines gereinigten Myosinproteins charakterisiert werden können.

Die erste dieser Methoden ist der Gleit-Aktin-Filament-Assay, mit dem die Ensembleeigenschaften von Myosinmotoren quantitativ untersucht und die Qualität einer Charge gereinigten Proteins qualitativ untersucht werden können33. Obwohl in diesem Artikel die Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) für diesen Assay diskutiert wird, können diese Experimente effektiv mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, die häufig in vielen Labors zu findenist 34. Bei diesem Assay wird eine sättigende Schicht von Myosinmotoren an einem Deckslip befestigt. Dies kann mit Nitrocellulose, Antikörpern, Membranen, SiO2-derivatisierten Oberflächen (wie Trimethylchlorsilan), unter anderem29, 33,35,36,37,38erreicht werden. Fluoreszierend markierte Aktinfilamente werden durch die Decklippenkammer geleitet, auf der das Aktin an das an der Oberfläche befestigte Myosin bindet. Nach Zugabe von ATP (und Kinasen in der Untersuchung von NM2) wird die Kammer abgebildet, um die Translokation von Aktinfilamenten durch die oberflächengebundenen Myosine zu beobachten. Tracking-Software kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit und Länge jedes gleitenden Aktinfilaments zu korrelieren. Analysesoftware kann auch ein Maß für die Anzahl der beweglichen und stationären Aktinfilamente liefern, was nützlich sein kann, um die Qualität eines bestimmten Myosinpräparats zu bestimmen. Der Anteil an festgefahrenen Filamenten kann auch absichtlich durch Oberflächenanbindeung von Aktin an andere Proteine moduliert und gemessen werden, um die Lastabhängigkeit des Myosins zu bestimmen39. Da jedes Aktinfilament von einer großen Anzahl verfügbarer Motoren angetrieben werden kann, ist dieser Assay sehr reproduzierbar, wobei die endgültige gemessene Geschwindigkeit robust gegenüber Störungen wie Veränderungen der Anfangsmyosinkonzentration oder dem Vorhandensein zusätzlicher Faktoren in der Lösung ist. Dies bedeutet, dass es leicht modifiziert werden kann, um die Myosinaktivität unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, wie z. B. veränderte Phosphorylierung, Temperatur, Ionenstärke, Lösungsviskosität und die Auswirkungen der durch Oberflächengurte induzierten Belastung. Obwohl Faktoren wie stark bindende Myosin-"Totköpfe", die nicht in der Lage sind, ATP-Hydrolyse zu blockierenden Aktinfilamenten führen können, gibt es mehrere Methoden, um solche Probleme zu mildern und genaue Messungen zu ermöglichen. Die kinetischen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen und abhängig vom verwendeten spezifischen Myosin kann die Geschwindigkeit des Aktinfilamentgleitens in diesem Assay von unter 20 nm / s (Myosin 9)40,41und bis zu 60.000 nm / s (Characean Myosin 11)42variieren .

Der zweite Assay invertiert die Geometrie des gleitenden Aktinfilament-Assays12. Hierbei werden die Aktinfilamente an die Deckschichtoberfläche gebunden und die Bewegung einzelner Moleküle von M5a oder einzelner bipolarer Filamente von NM2b visualisiert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Lauflängen und Geschwindigkeiten einzelner Myosinmoleküle oder Filamente auf Aktin zu quantifizieren. Ein Deckrutsch ist mit einer chemischen Verbindung beschichtet, die unspezifische Bindungen blockiert und gleichzeitig die Oberfläche funktionalisiert, wie z.B. Biotin-Polyethylenglykol (Biotin-PEG). Die Zugabe von modifizierten Avidinderivaten primet dann die Oberfläche und biotinyliertes Aktin wird durch die Kammer geleitet, was zu einer Schicht F-Aktin führt, die stabil an den Boden der Kammer gebunden ist. Schließlich wird aktiviertes und fluoreszierend markiertes Myosin (typischerweise 1-100 nM) durch die Kammer geflossen, das dann abgebildet wird, um die Myosinbewegung über die stationären Aktinfilamente zu beobachten.

Diese Modalitäten stellen schnelle und reproduzierbare Methoden dar, mit denen die Dynamik sowohl von nichtmuskleären als auch von Muskelmoosinen untersucht werden kann. Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung von M5a und NM2b, die unkonventionelle bzw. konventionelle Myosine darstellen. Es folgt eine Diskussion einiger myosinspezifischer Anpassungen, die durchgeführt werden können, um eine erfolgreiche Bewegungserfassung in den beiden Arten des Assays zu erreichen.

Expression und Molekularbiologie
Die cDNA für das interessierende Myosin muss auf einen modifizierten pFastBac1-Vektor geklont werden, der entweder für ein C-terminales FLAG-Tag (DYKDDDDK) kodiert, wenn M5a-HMM exprimiert wird, oder für ein N-terminales FLAG-Tag, wenn es das Molekül in voller Länge von NM2b23,43,44,45,46exprimiert. C-terminale FLAG-Tags auf NM2b führen zu einer geschwächten Affinität des Proteins für die FLAG-Affinitätssäule. Im Gegensatz dazu bindet das N-terminale FLAG-markierte Protein normalerweise gut an die FLAG-Affinitätssäule23. Das N-terminal markierte Protein behält enzymatische Aktivität, mechanische Aktivität und phosphorylierungsabhängige Regulation23bei.

In dieser Arbeit wurde ein abgeschnittenes Maus-M5a-schweres Meromyosin (HMM)-ähnliches Konstrukt mit einem GFP zwischen dem FLAG-Tag und dem C-Terminus der schweren Myosinkette verwendet. Beachten Sie, dass M5a-HMM im Gegensatz zu NM2b erfolgreich mit N- oder C-Terminal FLAG-Tags markiert und gereinigt werden kann und in beiden Fällen das resultierende Konstrukt aktiv ist. Die M5a-Schwerkette wurde an der Aminosäure 1090 abgeschnitten und enthält einen Drei-Aminosäure-Linker (GCG) zwischen dem GFP und dem Coiled-Coil-Bereich des M5a47. Zwischen GFP und FLAG-Tag wurde kein zusätzlicher Linker hinzugefügt. M5a-HMM wurde zusammen mit Calmodulin exprimiert. Das menschliche NM2b-Konstrukt in voller Länge wurde zusammen mit ELC und RLC exprimiert. Die N-Termini des RLC wurden über einen Linker aus fünf Aminosäuren (SGLRS) mit einem GFP verschmolzen. Direkt am FLAG-Tag war ein HaloTag angebracht. Zwischen dem HaloTag und dem N-Terminus der Myosin-Schwerkette befand sich ein Linker aus zwei Aminosäuren (AS).

Beide Myosinpräparate wurden aus einem Liter sf9-Zellkultur, die mit Baculovirus infiziert war, mit einer Dichte von etwa 2 x 106 Zellen/ml gereinigt. Die Volumina des Baculovirus für jede Untereinheit hingen von der Vielzahl der Infektionen des Virus ab, die durch die Anweisungen des Herstellers bestimmt wurde. Im Fall von M5a wurden die Zellen mit zwei verschiedenen Baculoviren koinfiziert - eines für Calmodulin und eines für M5a schwere Kette. Im Fall des NM2b wurden die Zellen mit drei verschiedenen Viren koinfiziert - eines für ELC, eines für RLC und eines für NM2b Schwere Kette. Für Labore, die mit einer Vielzahl von Myosinen (oder anderen multikomplexen Proteinen) arbeiten, ist dieser Ansatz effizient, da er viele Kombinationen von schweren und leichten Ketten ermöglicht und häufig verwendete leichte Ketten wie Calmodulin mit vielen verschiedenen schweren Myosinketten kotransfiziert werden können. Alle Zellarbeiten wurden in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter steriler Technik durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.

Für die Expression von M5a und NM2b wurden die Sf9-Zellen, die die rekombinanten Myosine produzieren, 2-3 Tage nach der Infektion durch Zentrifugation gesammelt und bei -80 °C gelagert. Zellpellets wurden durch Zentrifugieren der koinfizierten Sf9-Zellen bei 4 °C für 30 min bei 2.800 x gerhalten. Der Proteinreinigungsprozess wird im Folgenden detailliert beschrieben.

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Protocol

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1. Proteinreinigung

  1. Zelllyse und Proteinextraktion
    1. Bereiten Sie einen 1,5-fachen Extraktionspuffer basierend auf Tabelle 1 vor. Filtern und lagern bei 4 °C.
    2. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Zellpellets auf Eis. Während die Pellets auftauen, ergänzen Sie 100 ml Extraktionspuffer mit 1,2 mM Dithiothreitol (DTT), 5 μg/ ml Leupeptin, 0,5 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und zwei Proteaseinhibitortabletten. Bleibe auf Eis.
    3. Sobald das Pellet aufgetaut ist, fügen Sie 1 ml des ergänzten Extraktionspuffers pro 10 ml Zellkultur hinzu. Wenn die Zellpellets beispielsweise aus 500 ml Zellkultur gebildet wurden, fügen Sie dem Pellet 50 ml zusätzlichen Extraktionspuffer hinzu.
    4. Beschallen Sie die Zellpellets, während Sie sie auf Eis halten. Verwenden Sie für jedes Pellet die folgenden Bedingungen: 5 s ON, 5 s OFF, Dauer 5 min, Leistung 4-5.
    5. Sammeln Sie das gesamte homogenisierte Lysat in einem Becherglas und fügen Sie ATP (0,1 M Stammlösung; pH 7,0) hinzu, so dass die Endkonzentration von ATP 1 mM beträgt. 15 min in einem kühlen Raum umrühren. Das ATP dissoziiert aktives Myosin von Aktin, so dass es im folgenden Zentrifugationsschritt getrennt werden kann. Es ist daher wichtig, sofort mit dem nächsten Schritt fortzufahren, um die Möglichkeit einer ATP-Erschöpfung und erneuten Bindung an Aktin zu minimieren.
    6. Zentrifuge die Lysate bei 48.000 x g für 1 h bei 4 °C. Während dies geschieht, beginnen Sie mit dem Waschen von 1-5 ml einer 50% igen Aufschlämmung von Anti-FLAG-Affinitätsharz (für ein Pellet, das aus 1 L Zellen gebildet wird) mit 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zum Beispiel für 5 ml Harz, waschen Sie 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung. Im letzten Waschschritt wird das Harz mit 1-5 ml PBS mit genügend Volumen wieder aufgebraucht, um eine 50% ige Aufschlämmung zu erzeugen.
    7. Nach der Lysatzentrifugation den Überstand mit der gewaschenen Harzaufschlämmung verrühren und 1-4 h vorsichtig im Kühlraum schaukeln. Machen Sie während des Wartens die in Tabelle 1 beschriebenen Puffer und halten Sie sie auf Eis.
  2. FLAG Affinitätsreinigungsvorbereitung
    1. Zentrifugiert die Lösung in Schritt 1.7 bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Das Harz wird am Boden des Rohres verpackt. Ohne das Harz zu stören, entfernen Sie den Überstand.
    2. Das Harz wird in 50 ml Puffer A wie in Tabelle 1 beschrieben wieder aufgebraucht und bei 500 x g zentrifugiert, um 5 min bei 4 °C zu zentrifugieren. Ohne das Harz zu stören, entfernen Sie den Überstand.
    3. Das Harz wird in 50 ml Puffer B wie in Tabelle 1 beschrieben wieder hergestellt und bei 500 x g zentrifugiert, und 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal und enuspendieren Sie das Harz in 20 ml Puffer B. Dann mischen Sie das Harz und den Puffer gründlich, indem Sie das Röhrchen etwa 10 Mal von Hand vorsichtig umkehren.
  3. Proteinelution und -konzentration
    1. Machen Sie 30 ml Elution Buffer wie in Tabelle 1 beschrieben und lassen Sie es auf Eis abkühlen.
    2. Stellen Sie die Elutionssäule in einem Kühlraum auf. Gießen Sie die Harzaufschlämmung vorsichtig in die Säule. Waschen Sie die Säule mit 1-2 Säulenvolumina von Puffer B, während das Harz auf der Unterseite verpackt ist, und stellen Sie sicher, dass das Harz nicht austrocknet.
    3. 1 ml des Elution Buffer durch das Harz fließen lassen und den Durchfluss in einem 1,5 mL Rohr sammeln. Wiederholen Sie dies so, dass 12, 1 ml Fraktionen gesammelt werden.
    4. Führen Sie an dieser Stelle einen groben Bradford-Test an den Fraktionen durch, um qualitativ zu bestimmen, welche Fraktionen am stärksten konzentriert sind48. Auf einer Reihe einer 96-Well-Platte 60 μL 1x Bradford-Reagenz pipetten. Wenn Fraktionen gesammelt werden, mischen Sie 20 μL jeder Fraktion pro Vertiefung. Eine dunklere blaue Färbung weist auf die konzentrierteren Fraktionen hin.
    5. Sammeln Sie in einem 50-ml-Röhrchen das verbleibende Protein, indem Sie den verbleibenden Elutionspuffer vorsichtig durch die Säule pipettieren, um das verbleibende Myosin freizusetzen, das an das Harz im Säulendurchfluss gebunden ist. Dieser Durchfluss wird im nächsten Schritt konzentriert. Stellen Sie sicher, dass das Harz dann für die Wiederverwendung regeneriert und gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert wird.
    6. Die drei konzentriertesten Fraktionen werden gebündelt und der Durchfluss im 50-ml-Rohr sowie die verbleibenden 1-ml-Fraktionen mit einem 100.000 MWCO-Konzentrationsrohr weiter konzentriert. Laden Sie die gepoolte Probe bei 750 x g für 15 min bei 4 °C auf das konzentrierende Röhrchen und die Zentrifuge und wiederholen Sie, bis das gesamte eluierte Protein auf ein Endvolumen von ca. 0,5-1 ml konzentriert ist.
      HINWEIS: Diese Porengröße ermöglicht die Retention der Myosinmoleküle, die Massen haben, die ein Vielfaches der Molekulargewichtsabschneidung aufweisen. Die Leichtketten bleiben während dieses Konzentrationsverlaufs fest an die motorischen Domänen gebunden, wie durch die Durchführung einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese am Endprodukt nachgewiesen wurde.
  4. Dialyse und Schockgefrieren
    1. Machen Sie 2 L Dialysepuffer, wie in Tabelle 1beschrieben. Laden Sie die Probe in einen Dialysebeutel oder eine Kammer und dialysieren Sie sie über Nacht im Kühlraum. Beachten Sie, dass die Zusammensetzung der Dialysepuffer für NM2b und M5a unterschiedlich ist.
      HINWEIS: Im Fall von NM2b besteht der Zweck dieses Dialyseschritts darin, Myosinfilamente im Puffer mit niedriger Ionenstärke zu bilden. Die Sedimentation dieser Filamente sorgt dann für einen zusätzlichen Reinigungsschritt und ermöglicht die Konzentration der Probe. Es wird daher am nächsten Tag einen sichtbaren weißen Niederschlag in der Dialysekammer geben. Diese Filamente werden durch Zentrifugation gesammelt und in Schritt 5.1 depolymerisiert. Im Falle von M5a-HMM ist das Protein nach der Dialyse über Nacht ausreichend rein für die Verwendung in nachfolgenden Assays. Weitere Reinigungsschritte wie Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie können bei Bedarf durchgeführt werden. Für die M5a-Wiederherstellung nach der Dialyse fahren Sie mit Schritt 5.2 fort.
  5. Wiederherstellung von Myosin nach der Dialyse
    1. Für NM2b entladen Sie vorsichtig die gesamte Probe aus dem Dialysebeutel oder der Kammer und zentrifugieren Sie bei 4 °C für 15 minuten bei 49.000 x g, um die Myosinfilamente zu sammeln. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie den Speicherpuffer schrittweise dem Pellet hinzu, wie in Tabelle 1 beschrieben, bis es sich aufgelöst hat. Sanftes Auf- und Abpipettieren hilft, das Pellet zu solubilisieren. Normalerweise werden hierfür nicht mehr als 500 μL pro Röhrchen benötigt. Nachdem sichergestellt wurde, dass das Pellet vollständig im speicherpuffer mit hoher Ionenstärke gelöst ist, kann ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt (15 min bei 49.000 x g)durchgeführt werden, um bei Bedarf unerwünschte Aggregate zu entfernen, da das Myosin nun unpolymerisiert wird und im Überstand verbleibt.
    2. Für M5a-HMM sollten Sie die gesamte Probe vorsichtig aus der Dialysekammer und zentrifuge bei 4 °C für 15 min bei 49.000 x g entnehmen, falls unerwünschte Aggregate vorhanden sind. Nehmen Sie den Überstand.
  6. Konzentrationsbestimmung und Schockgefrieren
    1. Um die Konzentration des Produkts zu bestimmen, messen Sie die Absorption mit einem Spektralphotometer bei den Wellenlängen 260, 280, 290 und 320 nm. Berechnen Sie die Konzentration in mg/ml (cmg/ml) mit Gleichung 1, wobei A280 die Absorption bei 280 nm und A320 die Absorption bei 320 nm darstellt. Die resultierende Konzentration in mg/ml kann mit Gleichung 2in μM von Myosinmolekülen umgewandelt werden, wobei M das Molekulargewicht des gesamten Proteins (einschließlich der schweren Ketten, leichten Ketten, Fluorophore und aller Tags) ist.
      cmg/ml = (A280 - A320) / ε (1)
      μM Moleküle = 1000cmg/ml/M(2)
      HINWEIS: Wenn eine Verdünnung notwendig ist, muss sie in einem Puffer mit hoher Ionenstärke erfolgen. Der Extinktionskoeffizient (ε) kann bestimmt werden, indem die Aminosäuresequenz des Proteins in ein Programm wie ExPASy importiert wird. Die typische Ausbeute für das M5a-HMM beträgt etwa 0,5-1 ml 1-5 mg/ml Protein und für das NM2b in voller Länge 0,5-1 ml 0,5-2 mg/ml. Der extinktionskoeffizient für das in dieser Arbeit verwendete M5a-HMM betrug 0,671. Der in diesem Artikel verwendete Extinktionskoeffizient für das NM2b betrug 0,611.
    2. Lagern Sie das gereinigte Myosin auf eine der beiden Arten. Aliquot zwischen 10-20 μL in ein dünnwandiges Rohr, z. B. ein Polymerisationskettenreaktionsrohr, und lassen Sie das Rohr zum Schockgefrieren in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff fallen. Alternativ können Sie zwischen 20-25 μL Myosin direkt in flüssigen Stickstoff pipetten und die gefrorenen Proteinperlen in sterilen kryogenen Röhrchen lagern. In beiden Fällen können die resultierenden Röhrchen in -80 °C oder flüssigem Stickstoff für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
      HINWEIS: Da beide unten beschriebenen Motilitätstests sehr geringe Mengen an Protein erfordern, ist die Lagerung in kleinen Aliquoten, wie beschrieben, wirtschaftlich.

2. Gleitaktinfilament-Assay

  1. Aufbereitung von Abdeckrippen
    1. Machen Sie eine 1% ige Nitrocelluloselösung in Amylacetat.
    2. Erhalten Sie eine Gewebekulturschale (150 x 25 mm) und fügen Sie ein kreisförmiges Filterpapier (125 mm Durchmesser) auf den Boden der Schüssel hinzu.
    3. Acht quadratische Abdecklappen nr. 1,5 mit einer Dicke von 22 mm auf ein Gestell laden und mit ca. 2-5 mL 200-proof Ethanol anschließend mit 2-5 mL destilliertem Wasser (dH2 O)waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und enden Sie mit Wasser. Anschließend trocknen Sie die Abdeckrlips vollständig mit einergefilterten Luftleitung oder N2-Linie.
    4. Nehmen Sie einen Coverlip und pipetetten Sie langsam 10 μL der 1% igen Nitrocelluloselösung entlang einer Kante des Schlupfes. Dann, in einer glatten Bewegung, schmieren Sie es über den Rest des Coverlips mit der Seite einer glatten 200 μL Pipettenspitze. Legen Sie diesen Coverlip mit der Nitrocellulose-Seite nach oben auf die Gewebekulturschale. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Abdecklippen und lassen Sie sie trocknen, während Sie die verbleibenden Reagenzien vorbereiten, und verwenden Sie die Abdecklippen innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung.
  2. Kammervorbereitung
    1. Wischen Sie einen Objektträger mit einem optischen Linsenpapier ab, um große Ablagerungen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband, ca. 2 cm lang.
    2. Legen Sie ein Stück entlang der Mitte des langen Randes des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Bandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Band etwa 2 mm unter das erste Stück Band, so dass die beiden parallel und ausgerichtet sind. Dadurch entsteht eine Strömungskammer, die ca. 10 μL Lösung aufnehmen kann (siehe Abbildung 1).
    3. Nehmen Sie einen der nitrocellulosebeschichteten Deckschichten aus Teil 1. Kleben Sie den Deckmantel vorsichtig auf das Klebeband, so dass die mit Nitrocellulose beschichtete Seite direkten Kontakt mit dem Band hat (siehe Abbildung 1). Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Slide-Tape-Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Coverlip ordnungsgemäß auf dem Dia haftet. Schneiden Sie das überschüssige Klebeband, das über dem Rand des Dias hängt, mit einer Rasierklinge ab.
  3. Aktin-Zubereitung
    1. 20 μM F-Aktin durch Polymerisation von globulärem Aktin (G-Actin) in Polymerisationspuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl2,1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) bei 4 °C über Nacht herstellen.
    2. F-Aktin im Motilitätspuffer auf 5 μM verdünnen (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etikett mit mindestens 1,2-fachem molaren Überschuss an Rhodamin-Phalloidin. (mit Aluminiumfolie bedeckt) mindestens 2 h auf Eis lassen. Diese kann bis zu 1-2 Monate verwendet werden, auf Eis gelagert.
  4. Durchführung des Myosin 5a Gleitaktinfilament Assays
    HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des Myosin 5a (HMM) Gleittests bereitgestellt.
    1. Bereiten Sie die in Tabelle 2 beschriebenen Lösungen für Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis.
    2. 10 μL des Myosins 5a (50-100 nM) durch die Strömungskammer strömen und 1 min warten.
    3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT ("low salt" Buffer). Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren.
    4. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    5. Durchfluss in 10 μL der schwarzen Aktinlösung (5 μM F-Aktin, 1 μM Calmodulin und 1 mM ATP in 50 mM MB mit 1 mM DTT), um "tote Köpfe" zu eliminieren, wie im Abschnitt Diskussion diskutiert.
      1. Pipetten Sie die Lösung mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie die Lösung in die Kammer einführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male und warten Sie nach dem dritten Mal 1 Minute. Etwa 20 Pipettierereignisse sind ausreichend.
      2. Um den "Dead Head" -Spin durchzuführen, fügen Sie eine stöchiometrische Menge F-Aktin zu Myosin in Gegenwart von 1 mM ATP und 1 mM MgCl2 bei einer Salzkonzentration von 500 mM hinzu. Dann Ultrazentrifuge bei 480.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das tote Myosin befängt sich im Pellet.
    6. Durchfluss in 50 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP, um die Kammer der freien Aktinfilamente zu erschöpfen.
    7. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male, um die Kammer eines ATP zu erschöpfen.
    8. Strömen Sie in 10 μL 20 nM Rhodamin Actin (Rh-Actin) Lösung mit 1 mM DTT in 50 mM MB und warten Sie 1 Minute, um eine rigoore Bindung der Aktinfilamente an das Myosin 5a zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckslips befestigt ist.
    9. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT, um Rh-Actin-Filamente wegzuwaschen, die nicht an die Oberfläche gebunden sind. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    10. Durchfluss in 30 μL Endpuffer.
    11. Nehmen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm auf, um Rh-Actin zu visualisieren. Eine angemessene Belichtungszeit beträgt 200 ms bei 1,4 mW Laserleistung für eine Gesamtaufnahmedauer von 0,5-1 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erfassungsrate entsprechend der Geschwindigkeit der sich bewegenden Filamente skaliert wird. Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für die Verwendung mit Tracking-Programmen ist die Erfassungsbildrate. Subpixelbewegungen zwischen Frames führen zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit, und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. Eine optimale Erfassungsrate bietet Aktingleiten für mindestens einen Pixelabstand zwischen den Frames. Im Falle des TIRF-Mikroskops, das hier für die Bildgebung verwendet wird, entspricht dieser Schwellenwert 130 nm; Daher muss ein Myosin, von dem erwartet wird, dass es 1 μm/s zurückliegt, mit einer Rate von 5 Bildern/s (0,2 s Intervall) abgebildet werden, um 200 nm Bewegung zu erreichen, während ein Myosin, das voraussichtlich 10 nm/s zurücklegen wird, 0,05 Bilder/s (20 s Intervalle) benötigt. Daten können daher bei Bedarf in diesem Stadium heruntergerechnet werden (siehe Diskussion für weitere Details).
  5. Durchführung des nichtmuskleären Myosin-2b-Gleitaktin-Filament-Assays
    HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des nichtmuskleären Myosin-2b-Gleitassays in voller Länge bereitgestellt. Das nichtmuskleäre Myosin 2b Gliding Actin Filament Assay Protokoll unterscheidet sich in bestimmten Schritten vom Myosin 5a Protokoll. Stellen Sie sicher, dass für jeden dieser Schritte die richtigen Puffer verwendet werden. Zum Beispiel erfordert der NM2b-Assay die Befestigung von Myosin an den Coverslip in einem hohen Salzpuffer, während der M5a in hohen oder niedrigen Salzpuffern am Coverslip befestigt werden kann. Darüber hinaus verwendet der M5a-Gleit-Aktin-Filament-Assay eine niedrigere Myosinkonzentration, um die Häufigkeit von Aktinfilamenten zu mildern, die während der Erfassung auseinanderbrechen.
    1. Bereiten Sie die Lösungen für NM2b wie in Tabelle 2 beschrieben vor und halten Sie sie auf Eis.
    2. 10 μL des nichtmuskleären Myosins 2b (0,2 μM) in 500 mM Motility Buffer (MB) ("High Salt" Buffer) und 1 mM Dithiothreitol (DTT) durch die Strömungskammer strömen lassen und 1 min warten.
      HINWEIS: Die hohen Salzpuffer dissoziieren Myosinfilamente und ermöglichen die Anheftung einzelner Myosinmoleküle an die Oberfläche, da nichtmuskeliges Myosin 2b in Ionenkonzentration <150 mM zu Filamenten polymerisieren kann.
    3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml Rinderserumalbumins (BSA) in 500 mM MB mit 1 mM DTT ("High Salt" Buffer) wie in Tabelle 2beschrieben . Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
    4. Waschen mit 10 μL von 500 mM MB mit 1 mM DTT wie in Tabelle 2beschrieben. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    5. Durchfluss in 10 μL der schwarzen Aktinlösung wie in Tabelle 2 beschrieben, um "tote Köpfe" zu eliminieren, wie weiter im Abschnitt Diskussion erläutert. Die schwarze Aktinlösung enthält 5 μM unmarkiertes F-Aktin, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM und 1 mM DTT in 50 mM NaCl Motilitätspuffer, um das nichtmusklele Myosin 2b auf der Oberfläche der Kammer zu phosphorylatieren.
      1. Pipetten Sie die Lösung mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie die Lösung in die Kammer einführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male und warten Sie nach dem dritten Mal 1 Minute. Ungefähr 20 Pipettierereignisse sind ausreichend.
    6. Durchfluss in 50 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP, um die Kammer der freien Aktinfilamente zu erschöpfen.
    7. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male, um die Kammer eines ATP zu erschöpfen.
    8. Strömen Sie in 10 μL 20 nM Rh-Actin-Lösung mit 1 mM DTT in 50 mM MB und warten Sie 1 Minute, um eine rigoline Bindung der Aktinfilamente an das nichtmuskleäre Myosin 2b zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckels befestigt ist.
    9. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT, um Rh-Actin-Filamente wegzuwaschen, die nicht an die Oberfläche gebunden sind. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    10. Durchfluss in 30 μL Endpuffer. Für den nichtmuskleären Myosin-2b-Gleit-Aktin-Filament-Assay enthält der Final Buffer auch Calmodulin, CaCl2und Myosin-Leichtkettenkinase, um eine vollständige Phosphorylierung des nichtmuskleären Myosins 2b während der Videobildgebung zu ermöglichen. 0,7% Methylcellulose können auch in den Endpuffer aufgenommen werden, wenn Aktinfilamente nur lose gebunden oder nicht an die Oberfläche gebunden sind. Dies wird im Abschnitt Diskussion weiter erläutert.
    11. Nehmen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm auf. Eine angemessene Belichtungszeit beträgt 200 ms bei 1,4 mW Laserleistung für eine Gesamtaufnahmedauer von 0,5 -3 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erfassungsrate entsprechend der Geschwindigkeit der sich bewegenden Filamente skaliert wird. Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für die Verwendung mit Tracking-Programmen ist die Erfassungsbildrate. Subpixelbewegungen zwischen Frames führen zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit, und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. Eine optimale Erfassungsrate bietet Aktingleiten für mindestens einen Pixelabstand zwischen den Frames. Im Falle des TIRF-Mikroskops, das hier für die Bildgebung verwendet wird, entspricht dieser Schwellenwert 130 nm; Daher muss ein Myosin, von dem erwartet wird, dass es 1 μm/s zurückliegt, mit einer Rate von 5 Bildern/s (0,2 s Intervall) abgebildet werden, um 200 nm Bewegung zu erreichen, während ein Myosin, das voraussichtlich 10 nm/s zurücklegen wird, 0,05 Bilder/s (20 s Intervalle) benötigt. Die Daten können daher in dieser Phase bei Bedarf heruntersampelt werden (siehe Diskussion für weitere Details).

3. Einzelmolekül-TIRF-Assay

  1. Aufbereitung von Abdeckrippen
    1. Teilen Sie das Stammpulver in 10 mg Aliquoten (in 1,5 ml Röhrchen) Methoxy-Peg-Silan (mPEG) und 10 mg Aliquoten Biotin-Peg-Silan (bPEG). Bei -20 °C in einem verschlossenen, feuchtigkeitsfreien Behälter lagern und innerhalb von 6 Monaten verwenden.
    2. Laden Sie acht 22 mm quadratische Abdecklappen mit einer Dicke von 1,5 H (hochpräzise) auf ein Gestell und waschen Sie sie mit 2-5 ml 200-proof Ethanol, gefolgt von 2-5 ml destilliertem Wasser. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und enden Sie mit Wasser. Anschließend trocknen Sie die Abdeckrlips vollständig mit einer Luftleitung oder N2 und reinigen Sie sie 3 min lang mit Argon.
    3. Legen Sie die sauberen Abdeckteile auf Filterpapier (90 mm) in eine Gewebekulturschale (100 x 20 mm) und inkubieren Sie sie in einem 70 °C-Ofen, während Sie die folgenden Schritte ausführen.
      HINWEIS: Die Plasmareinigung kann durch andere chemische Reinigungsmethoden ersetzt werden49.
    4. Bereiten Sie 80%igeEthanollösung mit dH 2 O vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 2,0 ein. Fügen Sie 1 ml davon zu einem 10 mg Aliquot mPEG und 1 ml zu einem 10 mg Aliquot bPEG hinzu. Wirbel aufzulösen, was nicht mehr als 30 s dauern sollte.
    5. Nehmen Sie 100 μL der bPEG-Lösung und fügen Sie 900 μL 80% Ethanol (pH 2,0) hinzu. Diese Lösung ist 1 mg / ml bPEG. Machen Sie dann eine Lösung aus beiden PEGs wie folgt, und mischen Sie gründlich.
      1. 200 μL 10 mg/ml mPEG (Endkonzentration: 2 mg/ml).
      2. 10 μL des 1 mg/ml bPEG (Endkonzentration: 10 μg/ml).
      3. 790 μL der 80%igen Ethanollösung (pH 2,0).
    6. Nehmen Sie die Abdecklippen aus dem Ofen. Dosieren Sie vorsichtig 100 μL der PEG-Lösung auf die Mitte jedes Deckstücks, um sicherzustellen, dass nur die obere Oberfläche nass ist. Dann die Slips wieder in den Ofen geben und 20 bis 30 min inkubieren.
    7. Wenn die Decklippen ein löchriges Aussehen annehmen, mit kleinen Kreisen auf der Oberfläche, entfernen Sie sie aus dem Ofen.
    8. Jeden Abdecklappen mit 100% Ethanol waschen, mit einer Luftleitung trocknen und wieder in den Ofen stellen. Inkubieren Sie nur für die Zeit, die zum Erstellen von Kammern in Schritt 2 erforderlich ist.
  2. Kammervorbereitung
    1. Reinigen Sie einen Objektträger für die Herstellung der Kammer. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband, ca. 2 cm lang.
    2. Legen Sie ein Stück entlang der Mitte des langen Randes des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Bandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Band etwa 2 mm unter das erste Stück Band, so dass die beiden parallel und ausgerichtet sind.
    3. Nehmen Sie einen der funktionalisierten Abdecklippen aus dem Ofen (erstellt in 3.1). Kleben Sie den Deckblatt vorsichtig auf das Klebeband, sodass die mit PEG beschichtete Seite mit dem Gesicht nach unten ist und direkten Kontakt mit dem Band hat, wie in Abbildung 1dargestellt. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Slide-Tape-Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Coverlip ordnungsgemäß auf dem Dia haftet.
    4. Schneiden Sie das überschüssige Klebeband, das über dem Schlitten hängt, mit einer Rasierklinge ab. Diese Kammern können sofort verwendet oder paarweise in ein 50-ml-Rohr gelegt und für die zukünftige Verwendung in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden. Es ist wichtig, sofort zu lagern, da sich sonst die Oberfläche verschlechtert.
  3. Durchführung des Myosin 5a TIRF-Mikroskopie-Assays
    1. Bereiten Sie die in Tabelle 3 beschriebenen Lösungen für den invertierten Motilitätstest von Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis.
    2. Waschen Sie die Kammer mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT.
    3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
    4. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    5. 10 μL der NeutrAvidin-Lösung in 50 mM MB mit 1 mM DTT durchfließen und 1 min warten.
    6. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    7. 10 μL biotinyliertes Rhodamin-Actin (bRh-Actin) mit 1 mM DTT in 50 mM MB strömen und 1 min warten. Verwenden Sie für diesen Schritt eine großgebohrte Pipettenspitze und vermeiden Sie ein Pipettieren nach oben und unten, um das Scheren der fluoreszierenden Aktinfilamente zu minimieren, um sicherzustellen, dass lange Aktinfilamente an der Oberfläche befestigt werden können (20-30 μm oder länger). Eine effektive Alternative ist das Schneiden des Kegels einer Standardpipettenspitze (mit einer Öffnung von ≈1-1,5 mm).
    8. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    9. 30 μL Endpuffer mit 10 nM Myosin 5a durchfließen, dann sofort auf das TIRF-Mikroskop laden und aufnehmen, nachdem der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebungsmodalität gefunden wurde. Belichtungszeiten zwischen 100-200 ms sind bei 1,4 mW Laserleistung für das Aktin und GFP-markierte Myosin angemessen. Eine geeignete Erfassungszeit für die Geschwindigkeitsanalyse beträgt 3 min.
  4. Durchführung des nichtmuskulären Myosin-2b-TIRF-Mikroskopie-Assays
    HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des nichtmuskleären Myosin-2b-TIRF-Assays unter Verwendung polymerisierter und phosphorylierter Filamente bereitgestellt. Ein detailliertes Protokoll (Abschnitte 4.1-4.3) zur Phosphorylierung und Polymerisation des nichtmuskleären Myosin-2b in einem Röhrchen ist enthalten.
    1. Um das gereinigte NM2b zu phosphorylatieren, machen Sie eine 10-fache Kinasemischung mit den folgenden Bedingungen: 2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK und 0,1 mM ATP. Dieser kann mit 500 mM MB mit 10 mM DTT auf Volumen gebracht werden. Fügen Sie die 10-fache Kinasemischung in einem volumetrischen Verhältnis von 1:10 zum Myosin hinzu und lassen Sie es 20-30 minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Typischerweise beträgt die Myosinkonzentration für diesen Schritt 1 μM.
    2. Um das phosphorylierte Myosin zu Filamenten zu polymerisieren, senken Sie die Salzkonzentration des NM2b auf 150 mM NaCl. Machen Sie dazu einen 1x Motilitätspuffer (1x MB) ohne Salz, indem Sie die 4x MB viermal in dH2O verdünnen. Diese 1x MB können verwendet werden, um die Salzkonzentration zu senken, da das NM2b in einem 500 mM Salzpuffer eingefroren wurde.
    3. Für jede 3 μL Stamm NM2b 7 μL von 1x MB hinzufügen, um die Salzkonzentration auf 150 mM NaCl zu senken, und 20-30 minuten auf Eis inkubieren, um NM2b-Filamente zu bilden.
      HINWEIS: Die Reihenfolge in den Abschnitten 4.1-4.3 ist nicht entscheidend, solange das NM2b phosphoryliert ist und die endgültige Salzkonzentration 150 mM beträgt. Die Inkubation in der Größenordnung von 30 min-1 h ermöglicht genügend Zeit für eine vollständige Phosphorylierung und Polymerisation.
    4. Bereiten Sie die lösungen für den in Tabelle 3 beschriebenen invertierten Motilitätstest für nichtmuskleles Myosin 2b vor und halten Sie sie auf Eis.
    5. Waschen Sie die Kammer mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT.
    6. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 150 mM MB mit 1 mM DTT Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
    7. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    8. 10 μL der NeutrAvidin-Lösung in 150 mM MB mit 1 mM DTT durchfließen lassen und 1 min warten.
    9. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    10. 10 μL bRh-Actin einströmen und 1 min warten. Verwenden Sie für diesen Schritt eine großgebohrte Pipettenspitze und vermeiden Sie ein Pipettieren nach oben und unten, um das Scheren der fluoreszierenden Aktinfilamente zu minimieren, um sicherzustellen, dass lange Aktinfilamente an der Oberfläche befestigt werden können (20-30 μm oder länger). Eine effektive Alternative ist das Schneiden des Kegels einer Standardpipettenspitze.
    11. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    12. 10 μL der nichtmuskleären Myosin-2b-Lösung (ca. 30 nM) durchfließen und 1 min warten.
    13. Waschen mit 10 μL von 150 MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
    14. 30 μL Endpuffer einfließen lassen, dann sofort auf das TIRF-Mikroskop laden und aufzeichnen, nachdem der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebungsmodalität gefunden wurde. Belichtungszeiten zwischen 100-200 ms sind bei 1,4 mW Laserleistung für das Aktin und GFP-markierte Myosin angemessen. Eine geeignete Erfassungszeit für die Geschwindigkeitsanalyse beträgt 3 min.

4. Bildanalyse

  1. Bildanalyse für Gleitaktinfilament-Assay
    HINWEIS: Die Bilder können mit der Software und den Handbüchern analysiert werden, die in der Materialliste verlinkt sind. Es ist wichtig zu beachten, dass das hier beschriebene Programm TIFF-Stacks zur Analyse benötigt. Das Verfahren zur Analyse des Gleitaktinfilament-Assays ist wie folgt50.
    1. Laden Sie rohe Filmstapel in eine bestimmte Ordnerstruktur hoch und geben Sie das oberste Verzeichnis der Filmordner in das Programm ein.
      HINWEIS: Das Programm analysiert die Dateien in diesem Verzeichnis und den Unterverzeichnissen und behandelt die Verzeichnisse der untersten Ebene als Replikate. Für jede Gruppe von Replikaten werden durchschnittliche Statistiken erstellt. In diesem Fall wurde für jedes Myosin ein einzelner Film verwendet. Bei der Charakterisierung eines neuartigen Myosins oder der Untersuchung einer neuen experimentellen Erkrankung empfiehlt es sich, Filme aus drei Sichtfeldern (FOV) pro Kammer für insgesamt drei Kammern zu analysieren und diesen Workflow für drei Präparate des untersuchten Myosins zu wiederholen.
    2. Verwenden Sie das Skript "stack2tifs" in Verbindung mit der vom Benutzer eingegebenen Bildrate, um jeden TIFF-Stapel in einen Ordner zu konvertieren, der eine Reihe einzelner TIFF-Dateien und eine entsprechende Metadaten.txt Datei enthält, die die Startzeit jedes Frames enthält. Für Daten, die nicht im TIFF-Stack-Format vorliegen, muss zunächst eine Konvertierung mit Software wie der in der Materialtabelle aufgeführten vorgenommenwerden.
      HINWEIS: Dieses Skript ist Teil des Softwarepakets. Die Informationen zum Skript finden Sie hier: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Verwenden Sie den Parameter -px, d. h. die Pixelgröße (in nm) während der Erfassung. In diesem Fall beträgt die Pixelgröße 130 nm. Verwenden Sie die Parameter -xmax und -ymax, um die Achsen für die Streudiagrammausgaben zu skalieren. Diese entsprechen der längsten geplotteten Filamentlänge und der maximalen geplotteten Geschwindigkeit (in nm/s).
      HINWEIS: Dies sind Schätzwerte und können auf höher als erwartete Werte festgelegt werden, um sicherzustellen, dass Daten im Diagramm enthalten sind. Nach der Analyse können die Rohdaten auch zur Verwendung in anderen Statistik- oder Grafiksoftware zur Anzeige und Analyse exportiert werden.
    4. Verwenden Sie den Parameter -minv, bei dem es sich um einen Parameter mit minimaler Geschwindigkeitsabschaltung handelt, um die Filamente zu definieren, die sich nicht bewegen und daher von der Analyse ausgeschlossen werden können. Für ein langsames Myosin wie NM2b muss dieser Parameter niedrig sein (in diesem Beispiel 5 nm/s), um zu vermeiden, dass echte Gleitbewegungen ausgeschnitten werden. Für ein schnelles Myosin wie M5a kann dieser Parameter höher sein (in diesem Beispiel 100 nm/ s), um einen strengeren Filter anzuwenden, während die wahre Gleitgeschwindigkeitsverteilung erhalten bleibt.
    5. Verwenden Sie den Cutoff-Parameter -pt, um eine reibungslose Bewegung zu identifizieren. Für jedes Stichprobenfenster wird ein Wert berechnet, der 100 x Geschwindigkeit Standardabweichung/Mittlere Geschwindigkeit entspricht. Tracks mit höheren Werten als der Cutoff, haben mehr variable Geschwindigkeiten und sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen. In diesem Beispiel wurde ein Cutoff-Wert von 33 verwendet. Tracks mit höheren Werten haben mehr variable Geschwindigkeiten und sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
    6. Verwenden Sie -maxd, um einen maximal zulässigen Verknüpfungsabstand zwischen Frames festzulegen. Dies ist ein berechneter Frame-to-Frame-Abstand, der vom Mittelpunkt des Filaments in Einheiten von nm bewegt wird. Es kann nützlich sein, um sporadische Bewegungen oder falsche Verbindungen zwischen Filamenten auszuschließen. In den Beispielen hier wurde der Parameter auf dem Standardwert von 2.000 nm belassen.
  2. Bildanalyse für TIRF-Mikroskopie-Assay
    HINWEIS: Das Verfahren zur Analyse des Einzelmolekül-TIRF-Assays auf der Bildgebungssoftware, die speziell im Materialtabelle ist wie folgt29.
    1. Klicken Sie auf das aufgezeichnete Mikroskopievideo und ziehen Sie es in den Arbeitsbereich der Software, um es zu öffnen51. Teilen Sie dann die Erfassungskanäle auf. Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      HINWEIS: Bei einer nennenswerten Stufendrift während der Aufnahme müssen die Bilder stabilisiert werden, um die instrumentelle Drift auf der Abbildungsebene zu korrigieren. In diesem Fall wurde keine Kompensation für die Z-Achsendrift verwendet, da das Mikroskop, mit dem diese Daten erhalten wurden, den Z-Fokus gut stabilisiert. Um das Bild im Bildanalyseprogramm zu stabilisieren, installieren Sie das entsprechende Stabilisator-Plug-In, das in der Materiallisteverlinkt ist. Der Bildstabilisator nimmt feste Positionen für die Objekte im Bild an und verwendet einen gleitenden Durchschnitt der vorherigen Frames als Referenz. Das empfohlene Verfahren ist daher, mit dem Kanal zu beginnen, der Bilder von markiertem Aktin enthält, da sich dieser in einer festen Position befindet.
    2. Klicken Sie auf Plugins, dann finden Sie Image Stabilizer; Stellen Sie sicher, dass Übersetzung ausgewählt ist, und behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Protokolltransformationskoeffizienten. Durch Anwenden dieses Protokollschritts können die berechneten Verschiebungsparameter im nächsten Schritt auf den anderen Kanal angewendet werden. Lassen Sie den Vorgang abschließen.
    3. Öffnen Sie dann den Kanal mit dem beschrifteten Myosin und wenden Sie die Stabilisierung an, indem Sie auf Plugins > Image Stabilizer Log Applierklicken. Wenn Bilder von Aktin während derselben Aufnahme nicht aufgenommen werden können, weil eine höhere Bildgebungsrate in einem einzelnen Kanal erforderlich ist, stabilisieren Drifts den Bildstapel, indem sie einen Bereich auswählen, der statische Objekte wie einen biotinylierten Fiducialmarker oder Fluorophore enthält, die unspezifisch an die Biotin-PEG-Oberfläche gebunden sind. Dieser Bereich kann vom ursprünglichen Stapel abgeschnitten und stabilisiert werden, gefolgt von der Anwendung der resultierenden Verschiebungswerte auf den ursprünglichen Stapel.
      HINWEIS: In der Praxis wird die in Motilitätsexperimenten beobachtete Drift im Verhältnis zur Bewegung von Myosinen, die sich mit mehreren hundert nm / s bewegen, vernachlässigbar sein, aber für die langsamsten Myosine wird dies zu einer wichtigen Überlegung.
    4. Öffnen Sie dann TrackMate, klicken Sie auf Plugins; Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Tracking und schließlich auf TrackMate. An dieser Stelle wird die Bildanalyse anhand der Parameter des Fluorophors und der Assaybedingungen optimiert. Ideale Startparameter sind jedoch wie folgt.
      1. Kalibrierungseinstellungen: Behalten Sie alle Standardwerte bei.
      2. Detektor: LoG-Detektor.
      3. Geschätzter Blobdurchmesser: 0,5-1,0 Mikron.
      4. Schwellenwert: 25-200. (Dies kann durch Klicken auf Vorschau nach Auswahl einer Zahl bestimmt werden, um zu sehen, ob die erkannten Flecken mit dem Film übereinstimmen und entsprechend angepasst werden.)
      5. Anfänglicher Schwellenwert: nicht festgelegt.
      6. Ansicht: HyperStack Displayer.
      7. Filter auf Spots setzen: nicht gesetzt.
      8. Tracker: Einfacher LAP-Tracker.
        HINWEIS: Diese hängen von der Bildrate und der Myosingeschwindigkeit ab und müssen groß genug sein, um nachfolgende Positionen zu verbinden und gleichzeitig unerwünschte Verbindungen zwischen verschiedenen Partikeln auszuschließen.
      9. Verbindungsentfernung: 1,0 Mikron.
      10. Lückenschließende maximale Entfernung: 1,0 Mikron.
      11. Lückenschließende maximale Rahmenlücke: 1.
      12. Legen Sie Filter für Spuren fest: Spurverschiebung (>0,39, um nur Spots einzuschließen, die sich mehr als 3 Pixel bewegen), Spots in Spuren (>3-nur Spuren mit mindestens 3 Spots einzubeziehen). Andere Filter wie Minimal Velocity können eingeführt werden, um Stellen auszuschließen, die für längere Zeit zum Stillstand kommen. Die Ergebnisse der Filterung müssen durch visuelle Inspektion von Spuren überprüft werden, um sicherzustellen, dass falsche Spuren (d. H. Myosinbewegung im Hintergrund, die sich nicht entlang einer Aktinspur befindet) entfernt werden, während die mit Aktin verbundenen Spuren beibehalten werden.
    5. Sobald der Bildschirm Anzeigeoptionen angezeigt wird, klicken Sie auf Analyse für die entsprechenden Ausgaben. Speichern Sie die drei erstellten Tabellen (Track Statistics, Links in Track Statistics und Spots in Track Statistics). Die Tabelle Track Statistics enthält die Geschwindigkeits- und Verschiebungsdaten, die anschließend analysiert werden können, um beispielsweise ein neuartiges Protein oder die Auswirkungen einer bestimmten experimentellen Bedingung zu charakterisieren.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Reinigung von Myosin kann durch die Durchführung der Reduktion der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE)-Gelelektrophorese wie in Abbildung 2gezeigt bewertet werden. Während diese Zahl das letzte, postdialysierte Myosin darstellt, kann SDS-PAGE an Aliquoten aus den verschiedenen Phasen des Reinigungsverfahrens durchgeführt werden, um alle Produkte zu identifizieren, die an den Überstand verloren gehen. Myosin 5a HMM hat ein Band im Bereich von 120-130 kDa und das nicht-muslimisch...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Workflow zur Aufreinigung und In-vitro-Charakterisierung von Myosin 5a und nichtmuskleärem Myosin 2b vorgestellt. Diese Reihe von Experimenten ist nützlich, um die mechanochemischen Eigenschaften von gereinigten Myosinkonstrukten schnell und reproduzierbar zu quantifizieren. Obwohl die beiden hier gezeigten Myosine nur zwei konkrete Beispiele aus den vielen Möglichkeiten sind, können die Bedingungen und Techniken mit etwas Schneiderei auf die meisten Myosine und auf viele andere Motorproteine angewendet wer...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Fang Zhang für die technische Unterstützung bei der Vorbereitung der Reagenzien, die für die Erfassung dieser Daten verwendet werden. Diese Arbeit wurde durch die NHLBI/NIH Intramural Research Program Fonds HL001786 an J.R.S.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SpritzeBD309628
2 M CaCl2 LösungVWR10128-558
2 M MgCl2 LösungVWR10128-298
27 Gauge NadelBecton Dickinson309623
5 M NaCl LösungKD MedicalRGE-3270
EssigsäureThermoFisher Scientific984303
AmylacetatLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinyliertes G-AktinCytoskeleton, Inc.AB07
RinderserumalbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silanLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford ReagenzkonzentratBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Zirkuläres Filterpapier - GleittestMillipore SigmaWHA1001125
Zirkuläres Filterpapier - Invertierter AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-freie Proteasehemmer-TablettenMillipore Sigma5056489001Dies sollte bei 4 μC gelagert werden. Die Tabletten können direkt verwendet oder als 25-fache Stammlösung rekonstituiert werden, indem 1 Tablette in 2 mL destilliertem Wasser aufgelöst wird. Die resultierende Lösung kann bei 4 Grad gelagert werden. C für 1-2 Wochen oder mindestens 12 Wochen bei -20°C. 
Konzentrationsröhrchen (100.000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024Die MWCO des Röhrchens ist nicht unbedingt eine Einheitsgröße, solange die MWCO kleiner ist als das gesamte Molekulargewicht des zu reinigenden Proteins. Das NM2b wurde mit einer 100.000 MWCO-Röhre und das M5a mit einer 30.000 MWCO-Röhre konzentriert.
Coomassie Brilliant Blue R-250 FarbstoffThermoFisher Scientific20278
Deckglas-RackMillipore SigmaZ688568-1EA
strong>Deckgläser: Gleitend wirkender Filament-AssayVWR International48366-227
Deckgläser: Invertierter Motilitäts-Assay Azer ScientificES0107052
Dialyseschlauch (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5ADer Durchmesser des Dialyseschlauchs kann variieren, aber der MWCO sollte gleich sein. Das hierin verwendete NM2b wurde in einem 18-mm-Dialyseschlauch dialysiert. Die Röhrchen können in einer 20%igen Alkohollösung bei 4 °C gelagert werden.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586Dies kann in einem Puffer gelöst werden, der 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN<>3 und 10 mM MOPS (pH 7,2) enthält. Dies kann bei -20 ° C gelagert werden. C wie 300 µ L aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550Diese können wiederverwendet werden. Spülen Sie die Säule zum Reinigen mit 2-3 Säulenvolumina PBS und destilliertem Wasser. Kühlen Sie die Säule bei 4°; C vor Gebrauch.
EthanolFischer ScientificA4094
G-AktinPMID: 4254541G-Aktin-Bestand kann bei 200 μm gelagert werden; M in Flüssigkeit N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
GlucoseoxidaseMillipore SigmaG2133
Glycin Pufferlösung, 100 mM, pH 2-2,5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Pipettenspitzen mit großer ÖffnungFischer Scientific02-707-134
Leupeptin-Protease-InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Ungefärbte StandardleiterThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMilliporeSigma MX0482
MethylcelluloseMillipore SigmaM0512
ObjektträgerFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100<
strong>mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAG markiertes MLCK kann auf die gleiche Weise gereinigt werden, wie das FLAG-markierte Myosin hier gereinigt wurde.
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800<
NuPAGE 4 bis 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF kann als 0,1 M Stammlösung in Isopropanol hergestellt und in 4 μC gelagert werden. Die Zugabe von Isopropanol führt zu einer Kristallfällung, die durch Rühren bei Raumtemperatur aufgelöst werden kann. Unmittelbar vor der Verwendung kann PMSF tropfenweise zu einer schnell rührenden Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM hinzugefügt werden.
RasierklingenOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock kann in 100% Methanol auf eine Endkonzentration von 200 μm verdünnt werden.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027Dies sollte bei 4°C gelagert werden. Die Haltbarkeit beträgt 18 Monate ab Herstellungsdatum.
Gewebekulturschale - GleittestCorning353025Jede Gewebekulturschale kann ca. neun Deckgläser aufnehmen.
Gewebekulturschale - Invertierter AssayCorning353003Jede Gewebekulturschale kann ca. vier Deckgläser aufnehmen.
Glatt 200 & Mikro; L PipettenspitzenThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
ZentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MikroskopNikonModell: Eclipse Ti mit H-TIRF-System mit 100x TIRF Objektiv (N.A. 1.49)
MikroskopkameraAndorModell: iXon DU888 EMCCD-Kamera (1024 x 1024 Sensorformat)
Mikroskop Environmental Control BoxTokai HITCustom Thermobox
Mikroskop-LasereinheitNikonLU-n4 Vier-Laser-Einheit mit Festkörperlasern für 405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm
Mid Bench ZentrifugeThermoFisher ScientificModell: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Typ: Zepto
Sonicator Probe (3,2 mm)Qsonica4418
Standard InkubatorBinderModell: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads<
strong>FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST ist für Mac OSX und Linux basierte Systeme verfügbar.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
<>Imaging SoftwareNIS Elements (AR-Paket)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
< mit strong> File:TrackMate-manual.pdf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

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