Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Ananya Tripathi; Charles Bond; James R. Sellers; Neil Billington; Yasuharu Takagi

doi:10.3791/62180

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Methodenartikel

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

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DOI:

10.3791/62180

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4. Februar 2021

Ananya Tripathi¹ , Charles Bond¹^,² , James R. Sellers¹ , Neil Billington¹ , Yasuharu Takagi¹

¹Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, ²Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren zur Exprimisierung und Reinigung von Myosin 5a vorgestellt, gefolgt von einer Diskussion seiner Charakterisierung, wobei sowohl Ensemble- als auch Einzelmolekül-In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierte Assays verwendet werden, und wie diese Methoden für die Charakterisierung von nichtmuskleärem Myosin 2b modifiziert werden können.

Zusammenfassung

Myosinproteine binden und interagieren mit filamentösem Aktin (F-Aktin) und kommen in Organismen im gesamten phylogenetischen Baum vor. Ihre Struktur und enzymatischen Eigenschaften sind an die jeweilige Funktion angepasst, die sie in Zellen ausführen. Myosin 5a geht prozessiv auf F-Aktin, um Melanosomen und Vesikel in Zellen zu transportieren. Umgekehrt fungiert das nichtmusklele Myosin 2b als bipolares Filament mit etwa 30 Molekülen. Es bewegt F-Aktin der entgegengesetzten Polarität in Richtung des Zentrums des Filaments, wo die Myosinmoleküle asynchron arbeiten, um Aktin zu binden, einen Kraftschlag zu verleihen und zu dissoziieren, bevor sie den Zyklus wiederholen. Nichtmuskleles Myosin 2b hat zusammen mit seinen anderen nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen Rollen, die Zelladhäsion, Zytokinese und Spannungserhaltung umfassen. Die Mechanochemie von Myosinen kann durch die Durchführung von In-vitro-Motilitätstests mit gereinigten Proteinen untersucht werden. Beim Gleitaktinfilament-Assay werden die Myosine an eine mikroskopisch kleine Decklip-Oberfläche gebunden und translozieren fluoreszierend markiertes F-Aktin, das verfolgt werden kann. Im Einzelmolekül/Ensemble-Motilitätstest wird F-Aktin jedoch an einen Coverslip gebunden und die Bewegung fluoreszierend markierter Myosinmoleküle auf dem F-Actin beobachtet. In diesem Bericht wird die Aufreinigung von rekombinantem Myosin 5a aus Sf9-Zellen mittels Affinitätschromatographie skizziert. Im Anschluss skizzieren wir zwei fluoreszenzmikroskopiebasierte Assays: den Gleit-Aktin-Filament-Assay und den Inverted Motility Assay. Aus diesen Assays können Parameter wie Aktintranslokationsgeschwindigkeiten und Einzelmoleküllauflängen und -geschwindigkeiten mit der Bildanalysesoftware extrahiert werden. Diese Techniken können auch angewendet werden, um die Bewegung einzelner Filamente der nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen zu untersuchen, die hier im Zusammenhang mit nichtmuskleärem Myosin 2b diskutiert werden. Dieser Workflow stellt ein Protokoll und eine Reihe quantitativer Werkzeuge dar, mit denen die Einzelmolekül- und Ensembledynamik von nichtmuskleären Myosinen untersucht werden kann.

Einleitung

Myosine sind Motorproteine, die Kraft auf Aktinfilamente ausüben, indem sie die Energie aus der Adenosintriphosphat (ATP)-Hydrolyse^{nutzen 1}. Myosine enthalten eine Kopf-, Hals- und Schwanzdomäne. Die Kopfdomäne enthält die Aktinbindungsregion sowie den Ort der ATP-Bindung und Hydrolyse. Die Halsdomänen setzen sich aus IQ-Motiven zusammen, die an Leichte Ketten, Calmodulin oder Calmodulin-ähnliche Proteine^{binden 2}^,³. Die Schwanzregion hat mehrere Funktionen, die für jede Klasse von Myosinen spezifisch sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dimerisierung von zwei schweren Ket....