Diese Studie präsentiert ein hochreproduzierbares Großtiermodell für renale Ischämie-Reperfusionsverletzungen bei Schweinen unter Verwendung eines vorübergehenden perkutanen bilateralen Ballonkatheterverschlusses der Nierenarterien für 60 min und einer Reperfusion für 24 h.
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Methodenartikel
Ein Großtiermodell für akute Nierenverletzungen durch vorübergehenden bilateralen Nierenarterienverschluss
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Akute Nierenschäden (AKI) sind postoperativ mit einem höheren Risiko für Morbidität und Mortalität verbunden. Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist die häufigste Ursache für AKI. Um dieses klinische Szenario nachzuahmen, präsentiert diese Studie ein hochreproduzierbares Großtiermodell der nierenlichen IRI bei Schweinen unter Verwendung eines vorübergehenden perkutanen bilateralen Ballonkatheterverschlusses der Nierenarterien. Die Nierenarterien werden für 60 Minuten verschlossen, indem die Ballonkatheter durch die Oberschenkel- und Halsschlagader eingeführt und in den proximalen Teil der Arterien vorgerückt werden. Jodinierter Kontrast wird in die Aorta injiziert, um eine Trübung der Nierengefäße zu beurteilen und den Erfolg des Arterienverschlusses zu bestätigen. Dies wird zusätzlich durch die Abflachung der Pulswellenform an der Spitze der Ballonkatheter bestätigt. Die Ballons werden nach 60 Minuten bilateralem Nierenarterienverschluss entleert und entfernt, und die Tiere dürfen sich 24 Stunden lang erholen. Am Ende der Studie nehmen Plasmakreatinin und Blutharnstoffstickstoff signifikant zu, während eGFR und Urinausscheidung signifikant abnehmen. Der Bedarf an jodiertem Kontrast ist minimal und beeinträchtigt die Nierenfunktion nicht. Der bilaterale Nierenarterienverschluss ahmt das klinische Szenario der perioperativen Nierenhypoperfusion besser nach, und der perkutane Ansatz minimiert die Auswirkungen der Entzündungsreaktion und das Infektionsrisiko, das mit einem offenen Ansatz wie einer Laparotomie beobachtet wird. Die Fähigkeit, dieses klinisch relevante Schweinemodell zu erstellen und zu reproduzieren, erleichtert die klinische Translation auf den Menschen.
Einleitung
Akute Nierenschädigung (AKI) ist eine häufig diagnostizierte Erkrankung bei chirurgischen Patienten, die mit signifikanter Morbidität und Mortalität verbunden ist1,2. Verfügbare Daten zeigen, dass AKI sogar die Hälfte aller hospitalisierten Patienten weltweit betreffen kann und zu einer Sterblichkeitsrate von 50% bei Patienten auf der Intensivstation1,3führt. Trotz ihrer hohen Prävalenz beschränkt sich die derzeitige AKI-Therapie weiterhin auf präventive Strategien wie Flüssigkeitsmanagement und Dialyse. Daher besteht ein anhaltendes Interesse an der Erforschung alternativer Therapien für AKI4,5,6.
AKI wird typischerweise in prärenal, intrinsisch und post-renal basierend auf seiner Ätiologie4,5,6klassifiziert. Die Mehrheit der chirurgischen Patienten mit AKI ist mit prärennalen Ursachen aufgrund von Hypovolämie assoziiert, was zu einer Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) der Nieren führt2. Klinisch nimmt die Urinproduktion ab und der Kreatininspiegel steigt aufgrund einer verminderten Nierenfunktion. Die Niere ist ein Organ mit hoher Stoffwechselrate und anfällig für Ischämie. Ein hochreproduzierbares Großtiermodell der renalen IRI ist notwendig, um einen besseren Einblick in die Pathophysiologie von AKI und ihre potenziellen Therapieansätze zu erhalten5.
Um das klinische Szenario der Nierenhyperfusion perioperativ nachzuahmen, wird ein Modell des bilateralen Nierenarterienverschlusses als geeignet erachtet. Zuvor beschriebene Modelle, die einen einseitigen Nierenarterienverschluss mit oder ohne Resektion der kontralateralen Niere beinhalten, bieten keine ausreichende klinische Anwendbarkeit7,8. Obwohl diese Modelle ausreichen, um AKI zu verursachen, ähneln sie weder in Bezug auf die Art noch die Dauer der Verletzung realen klinischen Szenarien.
Ziel dieser Arbeit ist es, ein Porcine-Modell des perkutanen bilateralen vorübergehenden Verschlusses der Nierenarterien durch Ballon-Katheter-Okklusion unter Angiographie zu präsentieren. Bilateraler Nierenarterienverschluss ahmt das klinische Szenario der Nierenhyperfusion nach, gefolgt von der anschließenden Entfernung des Ballons zur Reperfusion9,10. Die technischen Schritte werden beschrieben, einschließlich Katheterisierung, Katheterführung, Angiographie und hämodynamische Überwachung. Diese Methode ermöglicht nicht nur einen hoch kontrollierten und replizierbaren Verschluss der Nierenarterien, sondern der perkutane Ansatz minimiert auch die Auswirkungen der Entzündungsreaktion, indem er die Menge an Beleidigung des Körpers im Vergleich zu einem offenen Ansatz begrenzt.
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Protokoll
Alle In-vivo-Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health zur Tierpflege und -verwendung durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee des Boston Children's Hospital genehmigt (Protokoll 18-06-3715). Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren human gepflegt. Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste einschließlich Anästhesie, chirurgische Vorbereitung und Zeitpunkte für primäre Endpunktmessungen dieser Studie.
1. Induktion, Anästhesie und Intubation
- Um unnötigen Stress und Beschwerden zu vermeiden, sedieren Sie das Schwein durch intramuskuläre Injektion einer Mischung aus Tiletamin / Zolazepam 4-6 mg / kg und Xylazin 1,1-2,2 mg / kg sowie Isofluran 3% mit einer Gesichtsmaske.
- Kanülieren Sie die Ohrvene, um einen venösen Zugang mit einer 20 G IV-Kanüle zu erhalten, nachdem Sie den Bereich mit 95% Ethanol desinfiziert haben. Beginnen Sie eine Erhaltungsinfusion (0,9% NaCl bei 5 ml/kg/h).
- Intubieren Sie das Schwein mit einem Endotrachealtubus (Größe 7 für Schweine mit einem Gewicht von 40-50 kg), sobald die Angemessenheit der Anästhesie bestätigt ist. Führen Sie eine Ballonbelüftung mit einer Frequenz von 12 Atemzügen/min durch und transportieren Sie das Schwein in den Operationssaal.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Starten Sie sofort die mechanische Überdruckbeatmung mit FiO2 0,50, 10 ml/kg Gezeitenvolumen und einer Frequenz von 12 Atemzügen/min unter kontinuierlicher Kapnographie.
- Legen Sie zur kontinuierlichen Überwachung ein Pulsoximeter auf das Ohr oder die Unterlippe.
- Halten Sie die Normothermie (37 °C) mit einem luftbeheizten Pad aufrecht.
- Um die Vollnarkose aufrechtzuerhalten, halten Sie die Isofluran-Verabreichung bei 0,5-4% durch den Endotrachealtubus. Überwachen Sie während des gesamten Verfahrens kontinuierlich EKG, arteriellen Blutdruck, Temperatur und Kapnographie, um die Tiefe der Anästhesie zu messen.
- Setzen Sie einen Foley-Katheter ein, um den Flüssigkeitsstatus des Tieres zu überprüfen und die Urinproduktion zu überwachen, indem Sie Urin in einem Drainagebeutel sammeln.
HINWEIS: Weibliche Schweine werden aufgrund der anatomischen Merkmale ihrer Harnröhre gegenüber Männchen bevorzugt, was eine einfachere Katheterisierung ermöglicht.
2. Operationsvorbereitung und Gefäßzugang
- Drapieren Sie das Tier auf sterile Weise.
- Desinfizieren Sie den rechten seitlichen Bereich des Halses, indem Sie Betadin und dann 95% Ethanol für 3 mal auftragen.
- Führen Sie eine Kürzung für die Katheterisierung der rechten Halsschlagader und der rechten Jugularvene durch. Ziehen Sie den Musculus sternocleidomastoidis seitlich zurück und sezieren Sie ihn bis zur rechten Halsschlagader und zur rechten Vena jugularis.
- Führen Sie eine 5F-Angiographiescheide sowohl in die Arterie als auch in die Vene ein. Sichern Sie es mit einer Seidennäht von 2-0.
- Führen Sie eine 5F-Angiographiescheide mit der Seldinger-Technik in die linke Oberschenkelarterie ein.
- Um die Seldinger-Technik durchzuführen, punktiert man die Oberschenkelarterie mit einer Hohlnadel. Führen Sie einen weichen Führungsdraht durch das Lumen ein und dringen Sie ihn in die Oberschenkelarterie vor.
- Halten Sie den Führungsdraht sicher mit der Hand, während Sie die Nadel entfernen. Führen Sie die Angiographiescheide über den Führungsdraht in die Oberschenkelarterie und ziehen Sie den Führungsdraht zurück. Verwenden Sie bei Bedarf eine Ultraschallführung.
3. Induktion einer renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung
- 200 IE/kg Natriumheparin intravenös verabreichen, um eine systemische Antikoagulation zu erreichen (Target Activated Clotting Time (ACT) > 300 s).
- Führen Sie eine Angiographie durch, indem Sie ein jodiertes Kontrastmittel unter Fluoroskopie injizieren, um die Nierenarterien zu identifizieren.
HINWEIS: Um das Risiko einer kontrastinduzierten Nephrotoxizität zu reduzieren, verdünnen Sie das jodierte Kontrastmittel in einer 1:1-Lösung mit normaler Kochsalzlösung. Tabellarisch die Dosierung für alle Tiere, um eine gleichwertige Dosierung zu gewährleisten. - Identifizieren Sie die Nierenarterien, führen Sie den Führungsdraht im Führungskatheter manuell vor.
- Positionieren Sie den 5F JL4-Führungskatheter in der linken Nierenarterie durch die rechte Halsschlagader (Abbildung 1A).
- Positionieren Sie den zweiten 5F JL4-Leitkatheter in der rechten Nierenarterie durch die linke Oberschenkelarterie (Abbildung 1A).
- Verwenden Sie die Führungsdrähte, um einen perkutanen transluminalen Angioplastiekatheter (PTA) mit 5F in jeder Nierenarterie zu steuern.
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, den Ballon an der proximalen Nierenarterie so zu positionieren, dass nach dem Aufblasen des Ballons keine Äste oder Kollateralen der Nierenarterie patentiert bleiben. - Positionieren Sie jeden Ballonkatheter an Ort und Stelle und verbinden Sie eine Druckleitung mit jedem Katheter.
- Überprüfen Sie das Vorhandensein arterier Pulswellenformen im Druckmonitor, um die korrekte Positionierung des Katheters sicherzustellen.
- Blasen Sie jeden Ballon auf und streben Sie einen Druck von ca. 2,5 atm im Ballon an (Abbildung 1B).
- Um die Beendigung des Blutflusses zu den Nieren zu bestätigen, beobachten Sie die Abflachung der Pulswellenform an der Spitze des Ballonkatheters.
- Jodhaltiges Kontrastmittel (1:1 Verdünnung) injizieren und auf Trübung der Nierengefäße prüfen.
HINWEIS: Es ist auch möglich, den Ballon mit einem jodierten Kontrastmittel zur Visualisierung des aufgeblasenen Ballons zu füllen. Diese Methode ist jedoch nicht so empfindlich wie die Abflachung der Pulswellenform, um den Verschluss der Nierenarterien zu bestätigen. - Nach 60 Minuten Okklusion vorsichtig entleeren und entfernen Sie die Ballonkatheter aus den Nierenarterien.
- Führen Sie eine Angiographie durch (unter Verwendung eines 1:1 verdünnten Kontrastmittels), um die Durchgängigkeit der Nierenarterie und die Etablierung einer Nierenreprofusion zu bestätigen (Abbildung 1C).
- Entfernen Sie die 5F-Angiographiescheide von der linken Oberschenkelarterie.
- Wenden Sie 30 Minuten lang festen Druck an der Katheterstelle an.
- Kehren Sie die Wirkung von Heparin durch die Verabreichung von Protamin (3 mg / kg) um, bis sich ACT normalisiert.
- Um während der postoperativen Phase Urin zu entnehmen, befestigen Sie einen Schlauch mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem unterbrochenen Stich auf der Haut am Foley-Katheter.
- Lassen Sie die Angiographiescheiden in der rechten Halsschlagader und der rechten Jugularvene an Ort und Stelle und sichern Sie sie mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem unterbrochenen Stich, um die Blutentnahme während der gesamten Studie zu ermöglichen.
- Schließen Sie den Halsschnitt mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem durchgehenden Stich in 2 Schichten.
- Verabreichen Sie Bupivacain (3 mg/kg) an der Schnittstelle, um Schmerzen zu minimieren.
- Hydratisieren Sie das Tier weiterhin mit 0,9% NaCl bei 5 ml / kg / h für insgesamt 2 h nach dem Ende der Ischämie.
- Legen Sie ein Fentanylpflaster (25-50 μg/h) auf den Rücken des Tieres, um postoperative Schmerzen zu minimieren.
- Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von Buprenorphin (0,005-0,1 mg/kg), um postoperative Schmerzen zu minimieren.
- Überwachen Sie das Tier und halten Sie es bis zum Erwachen mechanisch belüften.
4. Tiergewinnung
- Nach dem Erwachen unterbringen Sie das Tier in einem temperaturkontrollierten Raum.
- Drehen Sie das Tier weiterhin von einer seitlichen Seite zur anderen, bis es das volle Bewusstsein und die Fähigkeit zum Gehen wiedererlangt.
- Stellen Sie Wasser und Nahrung ad libitum zur Verfügung.
5. Funktionsbewertung
- Sammeln Sie das Blut und die Urinproben nach dem gewünschten Protokoll.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die folgenden Zeitpunkte festgelegt: Ausgangswert (1 h nach Beginn des Hydratationsprotokolls und vor Verschluss der Nierenarterien), Ende der Ischämie und Reperfusion (2 h, 6 h, 24 h). - Sammeln Sie die arteriellen und venösen Blutproben. Lagern Sie sie in Lithium-Heparin- oder EDTA-beschichteten Vakutainern zur anschließenden Analyse.
HINWEIS: Entnahme von Blut direkt aus den Kathetern in der Halsschlagader und Jugularvene. - Sammeln Sie die Urinproben aus dem Foley-Katheter und lagern Sie sie zur Analyse in 15 ml Röhrchen.
HINWEIS:Sammeln Sie den Urin aus dem Drainagebeutel, der mit dem Foley-Katheter verbunden ist. - Um die Urinproduktion zu bestimmen, leeren Sie den Drainagebeutel und sammeln Sie Urin für 1 h.
HINWEIS:Für den 6-Stunden-Zeitpunkt, an dem ein Drainagebeutel nicht mit dem Foley-Katheter verbunden ist, schließen Sie das mit dem Foley-Katheter verbundene Röhrchen für 30 Minuten und sammeln Sie dann den Urin mit einer 60-ml-Spritze, um die Urinproduktion zu bestimmen.
6. Euthanasie
- Führen Sie nach dem Ende der Reperfusionsphase eine Anästhesie durch und überwachen Sie sie wie oben beschrieben.
- Setzen Sie die Hydratation mit 0,9% NaCl bei 5 ml/kg/h fort.
- Verwenden Sie die arteriellen und venösen Katheter für die Blutentnahme und den Foley-Katheter, um die Urinproduktion zu bestimmen. Sammeln Sie die endgültigen Blut- und Urinproben und berechnen Sie die Urinproduktion.
- Führen Sie einen 15-cm-Midline-Laparotomieschnitt mit einer Klinge der Größe 10 vom Xiphoid bis zum mittleren Becken durch.
- Verwenden Sie einen geraden seitlichen Retraktor, um die Bauchhaut zurückzuziehen.
- Sezieren Sie die seitlichen Peritonealansätze der Bauchdecke, um das rechte und linke Retroperitoneum freizulegen.
- Identifizieren und sezieren Sie unverblümt sowohl Nierenarterien als auch Venen.
- Ligatieren Sie sowohl Nierenarterien als auch Venen mit einer 2-0-Seidennähte und führen Sie bilaterale Nephrektomien durch, um ganze Gewebeproben für die histologische und metabolische Analyse zu sammeln.
- Euthanasie das Tier mit der bevorzugten Methode der Euthanasie (z.B. Exsanguination, Pentobarbital)
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Ergebnisse
Funktionalanalysis
Die repräsentativen Ergebnisse dieser Studie stammen von 6 Tieren und die gezeigten Daten sind mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Die Nierenfunktion wird durch Bestimmung der Urinausscheidung, der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR), des Plasmakreatins und des Blutharnstoffstickstoffs (BUN) beurteilt. Die Biomarker der Nierenfunktion werden mit einem tragbaren chemischen Analysator bewertet. eGFR wird nach folgender Formel berechnet: eGFR =1,879 × BW1,092<...
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Diskussion
AKI ist eine häufige klinische Erkrankung, von der bis zu 50% der hospitalisierten erwachsenen Patienten weltweit betroffensind 6,12. Ein klinisch relevantes Tiermodell wird benötigt, um die Pathophysiologie der Krankheit und mögliche therapeutische Ziele weiter zu untersuchen. Obwohl es mehrere murine Modelle gibt, die AKI replizieren, ahmen diese ihre jeweiligen klinischen Szenarien und die Anatomie der menschlichen Niere nicht vollständig nach. Diese Studie sc...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Arthur Nedder für seine Hilfe und Anleitung. Diese Arbeit wurde vom Richard A. and Susan F. Smith President's Innovation Award, Michael B. Klein and Family, der Sidman Family Foundation, der Michael B. Rukin Charitable Foundation, dem Kenneth C. Griffin Charitable Research Fund und dem Boston Investment Council unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,9% Natriumchlorid-Injektion, USP, 100 ml Viaflex-Kunststoffbehälter | Baxter | 2B1302 | Für die Hydratation von Tieren |
| Kontrastmittel 100,0 ml Injektionsmedium btl ioversal 74% | CARDINAL HEALTH 133311 | Zur Visualisierung des Gefäßsystems | |
| Bard Bardia Geschlossenes System Urindrainagebeutel | BARD Inc 802001 | Für die Urinsammlung | |
| BD Vacutainer K2 EDTA | BD | 367841 | Zur Lagerung von Blutproben |
| BD Vacutainer Lithium-Heparin | BD | 366667 | Zur Lagerung von Blutproben |
| Betadine | Henry Schein | 6906950 | Zur Hautdesinfektion |
| Bookwalker Retraktor | Codman | Zur Hautretraktion | |
| Bupivacain 0,25% | Hospira | An der Inzisionsstelle zur Analgesie | |
| verabreichenBuprenorphin SR | Zoo Pharm | 10mg/ml Flasche, Dosis: 0,2mg/kg | |
| SC Cath angio 5,0 Fr x100,0 cm 0,038 in JR4 | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 7523-21 | Zur Identifizierung der Nierenarterien |
| Endotrachealtubus mit Manschette | Emdamed | Zur Einrichtung eines sicheren Atemwegs für die Dauer der Operation | |
| EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Sauerstoffsättigungsmonitor | GE Healthcare Madison | Zur Überwachung der Sauerstoffsättigung | |
| Encore 26 Inflator | BOSTON SCIENTIFIC | 710113 | Zum Aufblasen der Ballonkatheter |
| Ethanol 95% (Ethylalkohol) | Henry Schein | Zur Hautdesinfektion | |
| Fentanyl-Pflaster | Mylan | Dosis: 25-50mcg/h, TD | |
| Gold silikonbeschichtetes Foley | TELEFLEX MEDICAL INC | Für Urin Sammlung | |
| Heparin-Natrium | LEO Pharma A/S | Dosis: 200 IE/kg IV | |
| i33 Ultraschallgerät | Phillips | Verwenden Sie bei Bedarf eine Ultraschallführung für die Katharterisierung des Oberschenkelknochens | |
| Inqwire diagnostischer Führungsdraht - 0,035" (0,89 mm) - 260 cm (102") - 1,5 mm J-Spitze | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 6609-33 | Zur Führung der Ballonkatheter zu den Nierenarterien |
| Intravenöser Katheter, Größe 20 Gauge | Santa Cruz Biotechnology | Inc SC-360097 | Für die Flüssigkeitsverabreichung |
| Isofluran | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 21283620 | Dosis: 3%, INH |
| Metzenbaum stumpf gebogen 14,5 cm - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | Zum Dissektion und Schneiden von Gewebe |
| Einweg-Schallkopf-Kit für Neugeborene mit 30ml/h Spülvorrichtung und doppelten 4-Wege-Absperrhähnen für die kontinuierliche Überwachung | Argon Medical | 041588505A | Für die Druckmessung |
| Powerflex pro PTA Dilatationskatheter 6 x 20 mm - Schaftlänge (135cm) | CARDINAL HEALTH | 4400602X | Für den Verschluss der Nierenarterien |
| Drucküberwachungsleitungen mll/mll - 12" klar, mll/mll | Smiths Medical | B1571/MX571 | Für die Druckmessung |
| Behandlungspackung | Molnlycke Health Care | 97027809 | Chirurgische Abdecktücher, Mullbinden, Spritzen, Becher usw |
| Protamin | Henry Schein | 1044148 | Für die Heparinumkehr |
| Skalpellklinge - Größe #10 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-010 | Für die Hautschnitte |
| Hahn iv 4 way lrg Bohrung rotg männlich ll adptr strl | Peoplesoft | 1550 | Zum Verbinden von Schläuchen |
| Gerader seitlicher Retraktor | Codman | Für die Hautretraktion | |
| Naht perma hnd 18in 2-0 geflochten Seide blk | CARDINAL HEALTH 1 | A185H | Zum Nähen der Schnittstelle und zum Sichern Katheter |
| Spritze Kontrastmittelinjektion 10 ml fester männlicher Luer rot | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | MSS111-R | Zur Verabreichung des Kontrastmittels |
| Spritze medizinisch 60 ml ll plst strl ltx frei disp | CARDINAL HEALTH 1 | BF309653 | Zur Urinsammlung und Spülung des Angiokaths |
| Tilzolan (Tiletamin/Zolazepam) | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 07-893-1467 | Dosis: 4-6 mg/kg, IM |
| Xylazin | Putney, INC | Dosis: 1,1-2,2 mg/kg, IM |
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Nachdrucke und Genehmigungen
