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Methodenartikel

Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung

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DOI:

10.3791/62269

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4. März 2021

 ,  ,  , 
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.

Zusammenfassung

Organoide bieten eine vielversprechende Plattform, um Krankheitsmechanismen und Behandlungen direkt im Kontext von menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen zu untersuchen. Reife humane Netzhautorganoide werden verwendet, um potenzielle pharmazeutische Behandlungen für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu untersuchen.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass MacTel durch erhöhte Konzentrationen einer atypischen Lipidspezies, der Desoxysphingolipide (DesoxySLs), verursacht werden kann. Diese Lipide sind toxisch für die Netzhaut und können den Photorezeptorverlust verursachen, der bei MacTel-Patienten auftritt. Um Medikamente auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Toxizität von DesoxySL-Photorezeptoren zu verhindern, erzeugten wir humane Netzhautorganoide aus einer nicht-MacTel-induzierten pluripotenten Stammzelllinie (iPSC) und reiften sie bis zu einem postmitotischen Alter, in dem sie alle von der neuronalen Linie abgeleiteten Zellen der Netzhaut entwickeln, einschließlich funktionell reifer Photorezeptoren. Die retinalen Organoide wurden mit einem DesoxySL-Metaboliten behandelt und die Apoptose innerhalb der Photorezeptorschicht mittels Immunhistochemie gemessen. Unter Verwendung dieses Toxizitätsmodells wurden pharmakologische Verbindungen, die den DesoxySL-induzierten Photorezeptortod verhindern, untersucht. Mit einem gezielten Kandidatenansatz stellten wir fest, dass Fenofibrat, ein Medikament, das üblicherweise zur Behandlung von hohem Cholesterinspiegel und Triglyceriden verschrieben wird, auch die DesoxySL-Toxizität in den Zellen der Netzhaut verhindern kann.

Das Toxizitäts-Screening identifizierte erfolgreich ein von der FDA zugelassenes Medikament, das den Tod von Photorezeptoren verhindern kann. Dies ist aufgrund des getesteten hochgradig krankheitsrelevanten Modells ein direkt umsetzbarer Befund. Diese Plattform kann leicht modifiziert werden, um eine beliebige Anzahl von metabolischen Stressoren und potenziellen pharmakologischen Interventionen für die zukünftige Behandlungsforschung bei Netzhauterkrankungen zu testen.

Einleitung

Die Modellierung menschlicher Krankheiten in Zellkultur- und Tiermodellen hat unschätzbare Werkzeuge für die Entdeckung, Modifikation und Validierung pharmakologischer Therapeutika geliefert, die es ihnen ermöglichen, vom Wirkstoffkandidaten zur zugelassenen Therapie zu gelangen. Obwohl eine Kombination von In-vitro- und nicht-humanen In-vivo-Modellen seit langem ein wichtiger Bestandteil der Arzneimittelentwicklungspipeline ist, können sie häufig nicht die klinische Leistung neuartiger Arzneimittelkandidaten vorhersagen1. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Technologien, die die Lücke zwischen vereinfachenden humanzellulären Monokulturen und klinischen Studien schließen. Jüngste technologische Fortschritte bei selbstorganisierten dreidimensionalen Gewebekulturen, Organoiden, haben ihre Treue zu den von ihnen modellierten Geweben verbessert, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der präklinischen Arzneimittelentwicklungspipelinemacht 2.

Ein großer Vorteil der menschlichen Zellkultur gegenüber nicht-menschlichen In-vivo-Modellen ist die Fähigkeit, die spezifischen Feinheiten des menschlichen Stoffwechsels zu replizieren, die selbst zwischen Wirbeltieren höherer Ordnung wie Menschen und Mäusen erheblich variieren können3. Diese Spezifität kann jedoch durch einen Verlust der Gewebekomplexität überschattet werden; Dies ist der Fall bei Netzhautgewebe, wo mehrere Zelltypen kompliziert miteinander verwoben sind und ein einzigartiges symbiotisches metabolisches Zusammenspiel zwischen zellulären Subtypen aufweisen, das in einer Monokultur nicht repliziert werdenkann 4. Humane Organoide, die ein Faksimile komplexer menschlicher Gewebe mit der Zugänglichkeit und Skalierbarkeit von Zellkulturen liefern, haben das Potenzial, die Mängel dieser Krankheitsmodellierungsplattformen zu überwinden.

Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide haben sich bei der Modellierung des komplexen Gewebes der menschlichen neuralen Netzhaut als besonders zuverlässig erwiesen5. Dies hat das retinale Organoidmodell zu einer vielversprechenden Technologie für die Erforschung und Behandlung von Netzhauterkrankungen gemacht 6,7. Bisher konzentrierte sich ein Großteil der Krankheitsmodellierung in Netzhautorganoiden auf monogene Netzhauterkrankungen, bei denen Netzhautorganoide von iPS-Zelllinien mit krankheitsverursachenden genetischen Varianten abgeleitet werden7. Dies sind im Allgemeinen hochpenetrante Mutationen, die sich als Entwicklungsphänotypen manifestieren. Weniger Arbeit wurde effektiv an alternden Krankheiten durchgeführt, bei denen genetische Mutationen und Umweltstressoren sich auf Gewebe auswirken, das sich normal entwickelt hat. Neurodegenerative Erkrankungen des Alterns können eine komplexe genetische Vererbung und Beiträge von Umweltstressoren haben, die mit Kurzzeitzellkulturen von Natur aus schwer zu modellieren sind. In vielen Fällen können diese komplexen Krankheiten jedoch auf gemeinsamen zellulären oder metabolischen Stressoren zusammentreffen, die, wenn sie an einem voll entwickelten menschlichen Gewebe getestet werden, aussagekräftige Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen des Alterns liefern können8.

Die spät einsetzende degenerative Makulaerkrankung, Makulateleangiektasien Typ II (MacTel), ist ein gutes Beispiel für eine genetisch komplexe neurodegenerative Erkrankung, die auf einem gemeinsamen Stoffwechseldefekt beruht. MacTel ist eine seltene degenerative Erkrankung des Alterns der Netzhaut, die zu einem Verlust des Photorezeptors und der Müller-Glia in der Makula führt, was zu einem fortschreitenden Verlust des zentralen Sehens führt9,10,11,12,13. Bei MacTel führt eine unbestimmte, möglicherweise multifaktorielle genetische Vererbung zu einer häufigen Verringerung des zirkulierenden Serins bei Patienten, was zu einem Anstieg einer neurotoxischen Lipidspezies namens Desoxysphingolipide (DesoxySL) führt14,15. Um zu beweisen, dass die Akkumulation von DesoxySL für die Netzhaut toxisch ist, und um potenzielle pharmazeutische Therapeutika zu validieren, haben wir dieses Protokoll entwickelt, um die Photorezeptor-Toxizität in menschlichen Netzhautorganoiden zu untersuchen14.

Hier skizzieren wir ein spezifisches Protokoll zur Differenzierung menschlicher Netzhautorganoide, zur Etablierung eines Toxizitäts- und Rettungstests unter Verwendung von Organoiden und zur Quantifizierung der Ergebnisse. Wir liefern ein erfolgreiches Beispiel, in dem wir die gewebespezifische Toxizität eines vermuteten krankheitserregenden Wirkstoffs, DesoxySL, bestimmen und die Verwendung eines sicheren Generikums, Fenofibrat, für die potenzielle Behandlung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität validieren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Fenofibrat den Abbau von DesoxySL erhöhen und das zirkulierende DesoxySL bei Patienten senken kann, seine Wirksamkeit bei der Verringerung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität wurde jedoch nicht getestet16,17. Obwohl wir ein konkretes Beispiel präsentieren, kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkung einer beliebigen Anzahl von metabolischen/umweltbedingten Stressoren und potenziellen therapeutischen Medikamenten auf das Netzhautgewebe zu bewerten.

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Protokoll

1. Auftauen, Durchlässigkeit und Expansion von iPS-Zellen/ES-Zellen

HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zellkultivierungsschritte Best Practices, um eine sterile Zellkultur zu erhalten.

  1. Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit Basalmembranmatrixmedium.
    1. Um 1x dieses Mediums herzustellen, befolgen Sie die Produktspezifikationen oder verdünnen Sie 75 μl Kaltmatrixmedium mit 9 mL DMEM/F12. 1,5 ml frisch zubereitetes 1x Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte geben. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
    2. Saugen Sie das Basalmembranmatrixmedium ab und spülen Sie jedes Gut mit 3 ml DMEM/F12 aus. 2 ml DMEM/F12 zugeben und bis zur Verwendung bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie den Teller an dem Tag, an dem er zubereitet wird.
  2. Bereiten Sie eine 10-mM-Stammlösung des Gesteinsinhibitors (Y-27632-Dihydrochlorid) in PBS vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
  3. Eine Durchstechflasche mit iPS-Zellen/ES-Zellen wird in DMEM/F12-Medium aufgetaut und bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in mTeSR-Medium. Platte 1 Durchstechflasche mit Zellen auf eine beschichtete 6-Well-Vertiefung in mTeSR-Medien mit 10 μM Gesteinsinhibitor (Y-27632-Dihydrochlorid) geben und über Nacht im Inkubator inkubieren. Saugen Sie am nächsten Tag die Medien ab und fügen Sie nur mTeSR hinzu.
    HINWEIS: Wechseln Sie das Medium jeden Tag bis zur Übergabe.
  4. Bereiten Sie 0,5 mM EDTA in PBS vor, indem Sie 500 μl 0,5 M EDTA in 500 ml PBS verdünnen.
  5. Passage Zellen, wenn sie 80-90% Konfluenz erreichen. Spalten Sie die Zellen 1:3 oder 1:6 pro Well, abhängig von der Wachstumsrate der Zellen.
    1. Um anhaftende Zellen von der Platte zu entfernen, saugen Sie das Medium ab und inkubieren Sie es mit 0,5 mM EDTA in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Inkubation die EDTA-Lösung und heben Sie die Zellen ab, indem Sie 1 ml mTeSR-Medium mit einer p1000-Pipette kräftig auf die Zellen ausstoßen.
    2. Saugen Sie das mTeSR-Medium und die Zellen bis zu 5x weiter auf und stoßen Sie sie kräftig aus, um die anhaftenden verbleibenden Zellen zu entfernen. Plattenzellen auf einer frischen, mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte mit mTeSR-Medium. Tauschen Sie die Medien täglich aus, bis die Platten wieder 80-100% Konfluenz erreichen.
  6. Sobald sich die Zellen zu einer vollen 6-Well-Platte ausgedehnt haben und eine Konfluenz von 80-100% erreicht haben, legen Sie eine Vertiefung beiseite, um die Zelllinie für nachfolgende Differenzierungen zu erweitern oder für die Kryokonservierung einzufrieren. Verwenden Sie die verbleibenden fünf Vertiefungen, um den Differenzierungsprozess zu beginnen, indem Sie embryoide Körper herstellen.

2. Herstellung von embryoiden Körpern (EBs)

HINWEIS: Die Rezepte für EB-Bildung und Differenzierungsmedien stammen aus Protokollen in Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 und Zhong et al.19.

  1. Bereiten Sie 1x Dispase-Lösung und neuronale Induktionsmedien (NIM) wie unten beschrieben vor.
    1. Bereiten Sie 10 mg/ml 5-fache Stammlösung von Dispase vor, indem Sie das Pulver in DMEM/F12 auflösen. Sterilfilter mit einem 0,22 μm Filter. 1 ml Aliquote bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
    2. Bereiten Sie mit der 5-fachen Dispase-Lösung 1 ml/Well von 2 mg/ml Dispase in DMEM/F12 vor. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 37 °C erwärmt.
    3. Bereiten Sie NIM vor, indem Sie DMEM/F12 mit 1% N2-Supplement, 1% MEM NEAA und 2 mg/ml Heparin bei 180 U/mg ergänzen. NIM kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
  2. Bereiten Sie 16 ml einer 3:1-Mischung aus mTeSR:NIM (12 ml: 4 ml) Lösung vor und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie differenzierte Zellen und fügen Sie warme Dispase-Lösung hinzu.
    1. Entfernen Sie differenzierende Zellen aus der Zellkultur der iPS-Zellen/ES-Zellen. Kratzen Sie unter einem Dissektionsbereich undurchsichtige weiße Kolonien mit einer p10-Pipettenspitze ab. Absaugen des mTeSR-Mediums aus den Kulturbrunnen. Dadurch werden die differenzierten Klumpen entfernt, die gerade abgekratzt wurden.
    2. Sofort die vorgewärmte Dispase-Lösung zugeben und bei 37 °C inkubieren, bis sich die meisten Ränder der Zellkolonien unter dem Mikroskop zu kräuseln beginnen. Dies dauert 4-8 Minuten.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für Zellen in Dispase muss für jedes Labor bestimmt werden. Die Dauer kann je nach Zelllinie unterschiedlich sein und für Zellen, die 3 Tage oder länger plattiert wurden, ist eine längere Inkubation erforderlich. Langsam wachsende iPS-Zellen/ES-Zellen, die länger als 3 Tage brauchen, um die Konfluenz zu erreichen, beginnen mit größerer Stärke an der Platte zu haften, was das Abheben der Zellen erschwert. Versuchen Sie bei langsam wachsenden Zellen, die Zellen im Verhältnis 1:2 zu passieren, um sich in eine vollständige 6-Well-Platte zu expandieren, um die Zeit von der Beschichtung bis zur Konfluenz zu verkürzen.
  4. Saugen Sie die Lösung ab und fügen Sie vorsichtig mindestens 2 ml DMEM/F12-Medium pro Vertiefung hinzu. Geben Sie DMEM/F12-Medium langsam an die Seite der Vertiefung und achten Sie darauf, dass sich die Zellen nicht entfernen.
    1. Aspirieren Sie DMEM/F12 Medium und geben Sie dann kräftig frische 1 ml DMEM/F12 direkt auf die Zellen, um die Zellkolonien von der Platte zu heben. Mit einer p1000-Pipette wird DMEM/F12 wiederholt bis zu 5x in die Vertiefung gesaugt und kräftig ausgestoßen, um so viele Zellkolonien wie möglich zu entfernen.
      ANMERKUNG: Differenzierte/differenzierte iPS-Zellen/ES-Zellen haften stärker an der Platte als undifferenzierte iPS-Zellen/ES-Zellen. Zellen, die sich beim wiederholten Pipettieren nicht lösen, bleiben am besten zurück. Übermäßiges Pipettieren tötet Zellen ab und verringert die Effizienz der EB-Produktion. Zellklumpen haben zwischen 100-400 Zellen pro Klumpen.
  5. Übertragen Sie die schwimmenden Kolonien in ein konisches 15-ml-Röhrchen und spülen Sie die Vertiefungen mit einem zusätzlichen 1-ml-DMEM/F12-Medium pro Vertiefung, um alle verbleibenden schwimmenden Kolonien aufzufangen.
  6. Lassen Sie die schwimmenden Kolonien nicht länger als 5 Minuten durch die Schwerkraft absetzen. Sobald Sie sich abgesetzt haben, entfernen Sie alle bis auf 1-2 ml Überstand. Achten Sie darauf, das weiche Pellet am Boden nicht zu bewegen.
  7. Resuspendieren Sie das Pellet in vorgewärmtem 3:1 mTeSR:NIM-Medium und geben Sie es in einen T75-Kolben mit extrem niedrigem Aufsatz. Inkubieren Sie über Nacht, damit sich EBs bilden können. Dies wird als Tag 0 der Differenzierung betrachtet.
  8. Wechseln Sie allmählich zu NIM, um mit der Differenzierung von EBs in neuronale Vorläuferzellen zu beginnen.
    1. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium und ersetzen Sie es durch 10 ml 1:1 mTeSR:NIM-Medium. Um Medien aus der frei schwebenden EB-Kultur zu entfernen, kippen Sie den Kolben nach oben, so dass sich die EBs in der unteren Ecke des Kolbens sammeln. Saugen Sie den Überstand ab und achten Sie darauf, dass Sie keines der EBs im Pellet unten absaugen.
    2. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 10 ml 1:3 mTeSR:NIM-Medium.
    3. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch ein vollständiges NIM-Medium. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage mit NIM-Medium bis 7 Tage nach der Dispase-Behandlung.

3. Plattierung von EBs und Einleitung der neuronalen Netzhautdifferenzierung

  1. Eine Woche nach der Dispase-Behandlung werden frei schwebende EBs auf eine 6-Well-Platte aufgetragen, die mit wachstumsfaktorreduziertem Basalmembran-Matrixmedium beschichtet ist. Informationen zum Beschichten der Platte finden Sie in Schritt 1.1.
    1. Verbrauchte Medien aus EBs absaugen und durch 12 ml NIM ersetzen.
    2. Stellen Sie eine gleichmäßige Verteilung der EBs in jede Vertiefung sicher, indem Sie die EB-haltigen Medien rühren, um die EBs zu resuspendieren, dann schnell 1/6 des Mediums (2 ml) entfernen und in eine Vertiefung dosieren. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Vertiefungen.
    3. Schütteln Sie die Platte vor der Inkubation vorsichtig hin und her und dann von einer Seite zur anderen, um die EBs gleichmäßig zu verteilen. Wenn die EBs in der Mitte verklumpen, werden sie sich nicht richtig differenzieren.
      HINWEIS: Die Beschichtungsdichte ist entscheidend für die Differenzierung. Stellen Sie sicher, dass Sie mehr als 30 EBs pro Vertiefung plattieren. Wenn die EB-Produktion nicht effizient war, verteilen Sie EBs auf weniger Bohrlöcher.
  2. Wechseln Sie die Medien täglich mit dem NIM-Medium. Halten Sie den Medienstand in den Vertiefungen bei ~ 3 ml. Entfernen Sie beim Wechseln des Mediums alle Medien bis auf 1 ml, um die plattierten EBs nicht auszutrocknen, und fügen Sie 2 ml Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung hinzu, um die Zellen nicht von der Platte abzuheben.
  3. Beginnen Sie neun Tage nach der Beschichtung der EBs innerhalb von zwei Tagen mit der Umstellung des Mediums von NIM auf Retinal Differentiation Media (RDM).
    1. Bereiten Sie RDM vor, indem Sie Folgendes mischen: 48% DMEM/F12 (1:1) und 48% DMEM, ergänzt mit 2% B27-Präparat ohne Vitamin A, 1% MEM NEAA und 1% Pen-Streptokokken. Filter sterilisieren mit 0,20 μm Filter. RDM kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
    2. Schalten Sie am ersten Tag das Medium auf eine 1:1-Mischung aus NIM:RDM um. Ändern Sie am zweiten Tag das Medium auf RDM. Alle folgenden Tage, füttern Zellen RDM.
      HINWEIS: In den nächsten Wochen bilden plattierte EBs neurale Netzhautvorläuferzellen, die beginnen, sichtbar pigmentiertes RPE zu erzeugen.

4. Herstellung von frei schwebenden Organoiden und Pflege von frei schwebenden Organoidkulturen

  1. Fragmentierte EBs 28 Tage nach der ersten Dispase-Behandlung (21 Tage nach der EB-Beschichtung) mit einem sterilen Skalpell, um ein 1-2 mm2-Gitter in plattierte EBs zu schneiden. Dadurch werden die Vorläuferkolonien der Netzhaut in kleine Stücke getrennt, so dass sie später in der Entwicklung nicht zu groß werden und durch unzureichenden Nährstoffaustausch in ihrem Zentrum nicht zu groß werden.
  2. Lösen Sie plattierte EBs.
    1. Geben Sie dazu zunächst weitere 2 ml RDM in jede Vertiefung. Dann saugen Sie ~1000 μl Medium mit einer p1000-Pipette aus den Vertiefungen ab. Werfen Sie nun das Medium mit Gewalt direkt auf plattierte EBs aus, wobei die Spitze vollständig eingetaucht ist.
    2. Wiederholen Sie dies, bis alle Zellen von der Platte abgehoben wurden. Lassen Sie die Spitze während des Auswerfens des Mediums unter Wasser und schieben Sie den Pipettenkolben nicht über den ersten Anschlag hinaus, um Blasen zu vermeiden.
  3. Resuspendieren Sie im Entstehen begriffen abgelöste EB-Stücke in einen sterilen 125-ml-Erlenmeyerkolben aus Kunststoff und füllen Sie den Kolben mit ~40 ml RDM-Medien. Stellen Sie den Kolben auf einen Orbitalschüttler, der in einem Standardinkubator platziert ist. Stellen Sie die Schütteldrehzahl auf 130-140 U/min ein (Drehzahleinstellung 3).
    HINWEIS: Die Kultivierung von Organoiden auf einem Shaker verhindert, dass sie zusammenkleben, während sie mit einer höheren Konzentration von Organoiden kultiviert werden. Bioreaktoren erreichen auch die gleichen Ziele, aber ein Shaker ist billiger.
  4. Füttern Sie Organoide mit einem teilweisen Medienwechsel und ersetzen Sie etwa 12 ml RDM 2-3 Mal pro Woche, je nachdem, wie gelb das Medium wird. Frühe Organoide benötigen nicht viel Fütterung, aber wenn sie wachsen, benötigen sie häufigere Medienwechsel mit mehr Medien.
  5. Beschneiden Sie die Organoide alle zwei Wochen, um nicht-retinale, überwachsene und absterbende Organoide zu entfernen. Dies verhindert die Verschwendung von Medien und verbessert die Gesundheit der verbleibenden Netzhautorganoide.
    1. Übertragen Sie die Zellen aus ihrem Kolben mit einer 5-ml-Pipette auf eine 6-Well-Platte oder eine 10-cm-Schale. Bewahren Sie Organoide auf, die ein geschichtetes Neuroepithel aufweisen (Abbildung 1A, Sternchen). Diese Organoide sind transparent und weiß.
    2. Sortieren und entfernen Sie schlecht geformte oder überwachsene Netzhautorganoide und nicht-retinale Organoide mit einer 5-ml-Pipette. Diese sind in der Regel undurchsichtig und gelblich (Abbildung 1A). Entfernen Sie auch alles, was nicht wie ein geschichtetes Neuroepithel aussieht. Die ersten Schnitte sind arbeitsintensiv, werden aber jedes Mal viel einfacher, wenn die Organoide größer und homogener werden (Abbildung 1B).

5. Erhaltung reifer Organoide und Differenzierung zu einem postmitotischen Netzhautgewebe

  1. Am Tag 56 (Woche 8) nach der ersten Dispase-Behandlung für die EB-Bildung (28 Tage nach der Kultivierung der gelösten EBs in einem Kolben) werden die organoiden Medien auf RDM+ umgestellt. Dadurch werden voll ausgereifte Organoide als Netzhautgewebe mit zusätzlichen Nährstoffen versorgt.
    1. Bereiten Sie 100 mM Taurin in PBS vor. Aliquote bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
    2. Bereiten Sie RDM+ vor, indem Sie RDM mit 10 % FBS, 100 μM Taurin und 2 mM handelsüblichem Glutamin ergänzen. Filter sterilisieren mit 0,20 μm Filter.
    3. Wechseln Sie RDM+ Medien weiterhin 2-3 Mal pro Woche.
  2. In den Wochen 17-18 (nach der Dispase-Behandlung) werden die Organoide aus dem Erlenmeyerkolben mit einer 5-ml-Pipette auf eine 6-Well-Platte mit extrem niedriger Befestigung übertragen. In der ersten Woche die Organoide täglich beschneiden und voneinander trennen, bis die Organoide nicht mehr zusammenkleben. Die optimale Dichte beträgt 10-15 Organoide pro Well. Wechseln Sie das Medium 2-3 mal pro Woche.
    HINWEIS: Reduzieren Sie die Anzahl der Organoide pro Vertiefung, wenn die Organoide häufig aneinander haften oder wenn sich das Medium zwischen den Medienwechseln sehr gelb färbt.
  3. Erwarten Sie, dass Organoide in Woche 185 vollständig post-mitotisch werden, wenn neuronale Netzhautzellen überall vorhanden sind. Überprüfen Sie bis Woche 24 die Bildung rudimentärer äußerer Segmente an der Außenseite des Organoids. Stellen Sie in Woche 26-28 sicher, dass die äußeren Segmente an der Außenseite der Organoide dick sind (Abbildung 1C). Führen Sie Toxizitätstests nach Woche 26 durch, wenn Organoide definierte äußere Segmente haben, die einen reifen Differenzierungszustand anzeigen.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur gut differenzierte Netzhautorganoide für den Toxizitätstest. Die Durchführung von Toxizitätstests an Organoiden mit genau definierten äußeren Segmenten ermöglicht deren Identifizierung.

6. Desoxysphinganin (DeoxySA) und medikamentöse Behandlung

HINWEIS: Hier wird eine einzelne Behandlung mit Fenofibrat zur Beseitigung der DesoxySA-Toxizität über einen Zeitraum von 4 Tagen vorgestellt (Abbildung 2). Die Konzentration von DesoxySA, das Organoiden zugesetzt wird, die Dauer der DeoxySA-Behandlung mit Organoiden und die Art des Arzneimittels, das zur Rettung der Toxizität14 verwendet wird, können jedoch gemäß den experimentellen Anforderungen zur Bestimmung der Toxizität und der Toxizitätsrettung geändert werden.

  1. Bereiten Sie 1 mM Stammlösung von DesoxySA in Ethanol vor. 1 Monat bei -20 °C lagern. Alternativ kann eine Stammlösung von DesoxySA in DMSO hergestellt werden.
  2. Führen Sie eine serielle Verdünnung von DeoxySA durch, um eine geeignete toxische Konzentration von DeoxySA für die Arzneimittelrettung zu bestimmen.
    HINWEIS: Bestimmen Sie zunächst eine Konzentration von DesoxySA, die zu einem ausreichenden Zelltod führt, um einen Rettungseffekt zu messen. Wenn die Konzentration zu hoch ist, führt die toxische Reaktion zum Zerfall des Organoids und es wird keine Rettung beobachtet. Wenn die toxische Reaktion zu gering ist, wird es schwierig sein, einen signifikanten Rettungseffekt zu beobachten. Die toxische Reaktion von DesoxySA kann von Labor zu Labor und von Charge zu Charge von DesoxySA variieren.
    1. 1 mM DesoxySA-Stammlösung wird auf Konzentrationen von 0,5 μM, 1 μM und 2 μM in jeweils 3 ml RDM+ verdünnt. Fügen Sie RDM+ 3 μl Ethanol hinzu, um eine Kontrollbehandlung vorzubereiten.
    2. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine sterile Sonde, um 4 Gruppen von Organoiden mit mindestens 5 Organoiden pro Gruppe auszuwählen. Teilen Sie die Gruppen in separate Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz auf. Wählen Sie Organoide aus, die ungefähr die gleiche Größe und Form haben.
    3. Saugen Sie so viel RDM+ wie möglich aus den Organoiden ab. Fügen Sie zu jeder Vertiefung von Organoiden eine Konzentration DesoxySA in RDM+ hinzu. Fügen Sie der vierten Vertiefung von Organoiden die Fahrzeugkontrolle hinzu.
    4. Ersetzen Sie das Medium nach zwei Tagen Kultur in DesoxySA oder Vehikel durch frisch zubereitete entsprechende DesoxySA-Verdünnungen in RDM+.
    5. Fahren Sie am vierten Behandlungstag mit Schritt 7 fort, um Organoide auf Zelltod zu verarbeiten und zu testen. Sobald eine DesoxySA-Konzentration ausgewählt wurde, fahren Sie mit Schritt 6.3 fort, um mit Fenofibrat zu behandeln.
      HINWEIS: Der Zielzelltod in der ausgewählten DeoxySA-Behandlungsgruppe beträgt 5 - 20 TUNEL-positive Zellen pro 10.000 μm2. Die Organoide sollten sich im Verlauf der Behandlung nicht durch Berührung einer Sonde auflösen.
  3. Behandeln Sie Organoide mit der ausgewählten toxischen Dosis von DesoxySA und Fenofibrat.
    1. Bereiten Sie eine 40-mM-Stammlösung von Fenofibrat in DMSO vor. Bei -20 °C bis zu 1 Jahr lagern.
    2. Bereiten Sie die medikamentösen Behandlungsmedien vor: In 3 ml RDM+ 1 mM DesoxySA-Stammlösung auf 1 μM DesoxySA und 40 mM Fenofibrat-Stammlösung auf 20 μM verdünnen.
    3. DeoxySA-Behandlungsmedien vorbereiten: In 3 ml RDM+ 1 mM DesoxySA-Stammlösung auf 1 μM DesoxySA verdünnen und 1,5 μl DMSO zugeben.
    4. Bereiten Sie die Kontrollmedien vor: In 3 ml RDM+ 3 μl Ethanol und 1,5 μl DMSO geben.
    5. Wählen Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit einer sterilen Sonde drei Gruppen von Organoiden mit mindestens fünf Organoiden pro Gruppe aus. Teilen Sie die Gruppen in separate Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz auf.
    6. Fügen Sie die vorbereiteten Behandlungen (DesoxySA, DeoxySA + Fenofibrat oder Kontrolle) zu den Organoiden hinzu. Wechseln Sie nach zwei Tagen das Medium in den Vertiefungen mit frisch zubereitetem RDM+, ergänzt mit entsprechenden DesoxySA / Fenofibrat / Kontrolllösungen.
    7. Fahren Sie am vierten Behandlungstag mit Schritt 7 fort, um Organoide zu verarbeiten und auf Zelltod zu untersuchen (Abbildung 2).

7. Einbettung und Kryosektion von Organoiden

  1. Bereiten Sie frische 4% PFA zu, indem Sie 1 ml 16% PFA-Ampulle zu 3 ml PBS hinzufügen.
  2. Entfernen Sie RDM+-Medien von Organoiden und spülen Sie sie einmal mit PBS aus. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich aus Organoiden. 2 ml frisch zubereitetes 4% PFA (in PBS) zu den Organoiden geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Nach 15-minütiger Inkubation werden die Organoide zweimal mit 2 ml PBS gespült und dann 10 Minuten lang in PBS gewaschen.
    HINWEIS: Führen Sie die Fixierung in einem chemischen Abzug durch und entsorgen Sie die PFA-Lösung und zwei nachfolgende PBS-Spülungen in einen entsprechend gekennzeichneten PFA-Abfallbehälter, der im Abzug gelagert ist.
  4. Aspirieren Sie alle PBS und fügen Sie dann 20% Saccharose in PBS zu den festen Organoiden hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Organoide in die Saccharoselösung gemischt werden und nicht in einer PBS-Blase verbleiben. Halten Sie die Organoide in der Saccharoselösung, bis sie auf den Boden der Saccharoselösung sinken, d.h. ~1 h bei Raumtemperatur. Fixierte Organoide können über Nacht bei 4 °C in Saccharoselösung gelagert werden.
  5. Einbetten der Organoide in OCT-Lösung in eine Kryosektionsform. Mehrere Organoide pro Bedingung können in eine Form eingebettet werden. Richten Sie die Organoide so aus, dass ihre besten Netzhautregionen auf dem Kryostaten geschnitten werden und die Mitte der Organoide alle ungefähr in der gleichen Ebene liegt. Die eingebetteten Organoide werden bei -20 °C eingefroren. Eingebettete Organoide können jahrelang bei -80 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Organoide sind in gefrorenen OCT schwer zu erkennen; Richten Sie RPE-Cluster auf die Seite der Form aus, die der Klinge zugewandt ist, um die Identifizierung von Organoiden zu erleichtern.
  6. Kryosektionsorganoide in 10-14 μm dicke Schnitte und kleben Schnitte auf Poly-L-Lysin-behandelte Objektträger. Überprüfen Sie während der Kryosektion wiederholt die Objektträger unter einem Mikroskop, um Schnitte zu identifizieren, die die Mitte der Organoide enthalten. Sammeln Sie nur die mittleren Scheiben der Organoide, in denen alle Schichten gleichmäßig dargestellt sind (Abbildung 2A-C, Abbildung 3). Einmal geschnitten, können Objektträger jahrelang in einer Objektträgerbox bei -80 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Scheiben, die an den Enden des Organoids entnommen werden, überproben die äußersten Photorezeptoren und sind für die Quantifizierung nicht geeignet. Durchschnittlich große Organoide liefern 10-15 Scheiben der Mitte des Organoids, die einen Querschnitt der geschichteten Netzhautschichten darstellen.

8. TUNEL-Färbung für apoptotische Zellen

  1. Tiefkühlobjektträger 30 min bei 37 °C auftauen. Durch die sofortige Platzierung der Objektträger bei 37 °C wird Kondensation verhindert. In reinem Wasser getränkte Gewebeproben können das Gewebe verzerren. Eine Inkubation bei 37 °C verbessert zudem die Haftung des Gewebes auf dem Objektträger.
  2. Erstellen Sie mit einem hydrophoben Stift einen durchgehenden Rand auf dem Objektträger um die Gewebeschnitte. Dies bietet eine Grenze und gewährleistet eine angemessene Fixierung und Antikörperinkubation mit kleinem Volumen an Lösungen. Fügen Sie ca. 100-200 μl hinzu (das Volumen füllt den hydrophoben Randbereich, ohne überzulaufen) frisch zubereitetes 4% PFA für 20 Minuten. Führen Sie die Fixierung in einem chemischen Abzug durch und entsorgen Sie die PFA-Lösung in einen entsprechend gekennzeichneten PFA-Abfallbehälter, der im Abzug gelagert ist.
  3. Spülen Sie die Objektträger einmal in PBS ab und waschen Sie sie dann 25 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Bereiten Sie die TUNEL-Mischung vor. Tauen Sie sowohl violette als auch blaue Fläschchen aus dem In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods auf. Entfernen Sie 100 μl violette Durchstechflaschenlösung (kann für eine Negativkontrolle verwendet werden) und kombinieren Sie die restlichen 450 μl Lösung aus der violetten Durchstechflasche mit 50 μl Lösung aus der blauen Durchstechflasche. Gut mischen und im Dunkeln aufbewahren. Jeder Satz Fläschchen (insgesamt 500 μl) kann 5-10 Objektträger färben.
  5. Gewebeschnitte permeabilisieren.
    1. Permeabilisierungslösung herstellen: PBS mit 0,1% TritonX-100 und 0,1% Natriumcitrat
    2. Entfernen Sie PBS von den Objektträgern und fügen Sie dann Permeabilisierungslösung zu den Proben hinzu. 2 min auf Eisblock oder bei 4 °C inkubieren. Anschließend einmal in PBS ausspülen und dann 10 Minuten in PBS waschen.
  6. Entfernen Sie PBS und trocknen Sie so viel Lösung wie möglich mit der Ecke eines gefalteten Taschentuchs ab. Geben Sie 50-100 μl der vorbereiteten TUNEL-Mischung in die Proben, abhängig von der Größe der vom hydrophoben Pen gezeichneten Fläche. Mit Glasdeckglas abdecken und bei 37 °C 1 h im Dunkeln inkubieren.
    HINWEIS: Alle Inkubationen und Waschvorgänge für die folgenden Schritte müssen im Dunkeln durchgeführt werden, um ein Ausbleichen von Fluorophoren zu verhindern. Verwenden Sie entweder eine dunkle Box oder decken Sie die Objektträger mit Alufolie ab, um das Licht auszublenden.
  7. Beschriften Sie die Photorezeptoren. Einmal mit PBS spülen und dann 20 Minuten in PBS waschen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie dann primären Recoverin-Antikörper (Kaninchen-Anti-Recoverin) hinzu, der 1:500 in PBS mit 0,1% Tween und 5% Eselserum verdünnt ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  8. Nach dem Entfernen des primären Antikörpers einmal in PBS spülen und dann 20 Minuten in PBS waschen. Fügen Sie sekundären Antikörper, Esel-Anti-Kaninchen mit einem orangefarbenen oder roten Fluorophor, verdünnt 1:1.000 in PBS mit 0,1% Tween und 5% Eselserum hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 h. Einmal mit PBS spülen und dann 20 Minuten in PBS waschen. DAPI bei 1:1000 in PBS zugeben, bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
  9. Einmal mit PBS spülen und dann 20 Minuten in PBS waschen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie das Montagemedium hinzu. Deckglas hinzufügen, mit Nagellack versiegeln und im Dunkeln trocknen lassen. Objektträger können bei 4 °C in einem dunklen Behälter bis zu 1 Woche gelagert werden.
    HINWEIS: Um die beste Bildqualität zu erzielen, nehmen Sie die Bilder am nächsten Tag auf.

9. Bildgebung von Organoidschnitten und Quantifizierung des Todes.

HINWEIS: Für die Bildgebung ist ein konfokales Mikroskop erforderlich, mit dem zwischen drei Fluorophorkanälen unterschieden werden kann. Dieses Experiment verwendet grüne (Alexa Fluor 488), orange (Alexa Fluor 555) und UV-Kanäle (DAPI). Jede Kombination von Fluorophoren kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Emissionen nicht in die anderen Kanäle gelangen.

  1. Lokalisieren Sie Netzhautschnitte für die Bildgebung und Quantifizierung. Verwenden Sie bei geringer Vergrößerung des Mikroskops (5x oder 10x) die Recoverin-Färbung, bei der das Zytoplasma der Photorezeptoren markiert wird, und die DAPI-Färbung, bei der die Kerne aller Zellen markiert werden, um eine Region des geschnittenen Organoids zu lokalisieren, die intakt, wohlgeformt und in einer Ebene ist, die einen repräsentativen Querschnitt des Organoids abtastet (Abbildung 2 und Abbildung 3 ). Finden Sie einen Abschnitt, der eine ausgeprägte äußere Kernschicht von Photorezeptoren aufweist, die mindestens einige Zellen dick ist, und eine separate und unterschiedliche Schicht von Kernen, die keine Recoverin-Färbung aufweisen (Abbildung 2 und Abbildung 3).
  2. Rahme das Bild ein. Erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops auf ein 20-faches Objektiv und rahmen Sie den Objektträger so ein, dass das Bild so viel wie möglich von der Photorezeptorschicht ausfüllt (Abbildung 3).
  3. Stellen Sie die Z-Ebene ein. Wenn Sie ein Mikroskop verwenden, das Z-Stapel abbildet, legen Sie die oberen und unteren Grenzen des Z-Bereichs fest, um die gesamte Tiefe der Schicht abzubilden. Verwenden Sie die gleiche Z-Stapeldicke für alle Bilder in einem Versuchssatz, so dass in allen Proben die gleiche Menge an Gewebe untersucht wird. Wenn Sie kein Mikroskop verwenden, das Z-Stapel abbildet, fokussieren Sie das Bild auf die Mitte des Schnitts.
  4. Stellen Sie alle drei Kanäle von Fluorophoren in einer Z-Stapel-Aufnahme dar. Alle drei Kanäle sind erforderlich, um eine sterbende Zelle eindeutig zu identifizieren. Stellen Sie sich einen Bereich pro Organoid vor.
  5. Speichern Sie den Bildsatz in einem Dateiformat, das das Verhältnis von Fläche zu Pixel beibehält.

10. Quantifizierung sterbender Zellen

  1. Öffnen Sie Bildstapel in der FIDSCHI-Software (Image J). Stellen Sie im Fenster " Importoptionen für Bioformate" sicher, dass keine Kästchen im Abschnitt "In separate Fenster aufteilen" ausgewählt sind. Das Scrollen zwischen ausgerichteten Bildkanälen ist entscheidend für die ordnungsgemäße Identifizierung von Zellen.
  2. Reduzieren Sie das Z-Stack-Image-Set, indem Sie auf Image > Stacks klicken und dann "Z-Projekt" aus dem Dropdown-Menü auswählen. Dadurch wird ein neues Bild für die Quantifizierung erstellt. Wenn die Organoide nicht in der Z-Serie abgebildet wurden, überspringen Sie diesen Schritt.
  3. Wählen Sie den Bildkanal aus, der die Recoverin-Färbung anzeigt (in diesem Beispiel rot). Klicken Sie auf das Polygonauswahlwerkzeug in der Symbolleiste und skizzieren Sie einen kontinuierlichen Bereich von Photorezeptoren im Bild (Abbildung 3A). Klicken Sie auf Analysieren > Messungen einstellen. Aktivieren Sie im Popup-Fenster "Messungen festlegen" das Kontrollkästchen neben "Fläche", klicken Sie auf "Analysieren" und wählen Sie "Messen", um die Fläche (oder drücken Sie "m" als Abkürzung) von Photorezeptoren zu messen, um sterbende Zellen zu zählen. Die Flächenmessung wird in einem Popup-Fenster angezeigt.
  4. Zählen Sie die TUNEL-positiven Kerne in der zuvor ausgewählten Photorezeptorregion (Abbildung 3B, C). Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktwerkzeug in der Symbolleiste und wählen Sie Mehrpunktwerkzeug. Klicken Sie nur im TUNEL-Kanal auf TUNEL-positive Färbung, die sich mit DAPI-positiven Kernen überschneidet, und auf Recoverin-Färbung. Wechseln Sie zwischen den Kanälen, um positive Zellen zu validieren.
  5. Teilen Sie die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen durch die Fläche, um einen normalisierten Wert für den Zelltod in Photorezeptoren pro Organoid zu erhalten (Abbildung 2D, E).

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Ergebnisse

Retinale Organoide wurden aus einer Nicht-MacTel-Kontroll-iPSC-Linie erzeugt. Nachdem die Organoide 26 Wochen in Kultur erreicht hatten, wurden sie ausgewählt und in Versuchsgruppen aufgeteilt. Organoide wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von DesoxySA behandelt, um festzustellen, ob DesoxySA für Photorezeptoren toxisch ist. Es wurden vier Konzentrationen von DesoxySA von 0 bis 1 μM getestet (Abbildung 2) und Organoide wurden 8 Tage lang behandelt, wobei die Medien jeden zweiten Tag...

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Diskussion

Variationen des Differenzierungsprotokolls
Seit der Erfindung selbstformender optischer Becher durch Yoshiki Sasais Gruppe20 haben viele Labore Protokolle entwickelt, um Netzhautorganoide zu erzeugen, die bei fast jedem Schritt variieren können 5,18,19,21. Eine vollständige Liste der Protokolle findet sich in Capowski et al.22....

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Offenlegungen

Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Unterstützt vom Lowy Medical Research Institute. Wir bedanken uns bei der Familie Lowy für die Unterstützung des MacTel-Projekts. Wir danken Mari Gantner, Mike Dorrell und Lea Scheppke für ihren intellektuellen Input und ihre Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5M EDTAInvitrogen15575020
125mL ErlenmeyerkolbenVWR89095-258
1-DeoxysphinganinAvanti860493
B27 Supplement, minus Vitamin AGibco12587010
Beaver 6900 Mini-BladeBeaver-VisitecBEAVER6900
D-(+)-SaccharoseVWR97061-432
DAPIThermo-fisherD1306
Dispase II, PulverGibco17105041
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatGibco11995073
DMEM/F12Gibco11330
Esel Anti-Kaninchen Ig-G, Alexa Fluor plus 555Thermo-fisherA32794
EselsserumSigmaD9663-10ML
FBS, HitzeinaktiviertesCorning45001-108
FenofibratSigmaF6020
GlutamaxGibco35050061
HeparinStemcell Technologies7980
In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods, FluorescinSigma11684795910
Matrigel, Wachstumsfaktor reduziertCorning356230
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren LösungGibco11140050
mTeSR 1Stammzellentechnologien85850
N2 ErgänzungGibco17502048
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Pierce 16% FormaldehydThermo-Fisher28906
Kaninchen Anti-Recoverin AntikörperMilliporeAB5585
NatriumcitratSigmaW302600
Steriflip Sterile Einweg-VakuumfiltereinheitenMilliporeSigmaSE1M179M6
TaurinSigmaT0625
Tissue Plus- O.C.T. VerbindungFisher Scientific23-730-571
Tissue-Tek CryomoldEMS62534-10
Triton X-100SigmaX100
Tween-20SigmaP1379
Ultra-Low Attachment 6 Well PlattenCorning29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-FlaskCorning3814
VakuumfiltrationssystemVWR10040-436
Vectashield-EindeckmediumVektor LabsH-1000
Wachsstift-ImmEdgeVektor LabsH-4000
Y-27632 Dihydrochlorid (Gesteinsinhibitor)SigmaY0503

Referenzen

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