Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.
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Methodenartikel
Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Organoide bieten eine vielversprechende Plattform, um Krankheitsmechanismen und Behandlungen direkt im Kontext von menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen zu untersuchen. Reife humane Netzhautorganoide werden verwendet, um potenzielle pharmazeutische Behandlungen für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu untersuchen.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass MacTel durch erhöhte Konzentrationen einer atypischen Lipidspezies, der Desoxysphingolipide (DesoxySLs), verursacht werden kann. Diese Lipide sind toxisch für die Netzhaut und können den Photorezeptorverlust verursachen, der bei MacTel-Patienten auftritt. Um Medikamente auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Toxizität von DesoxySL-Photorezeptoren zu verhindern, erzeugten wir humane Netzhautorganoide aus einer nicht-MacTel-induzierten pluripotenten Stammzelllinie (iPSC) und reiften sie bis zu einem postmitotischen Alter, in dem sie alle von der neuronalen Linie abgeleiteten Zellen der Netzhaut entwickeln, einschließlich funktionell reifer Photorezeptoren. Die retinalen Organoide wurden mit einem DesoxySL-Metaboliten behandelt und die Apoptose innerhalb der Photorezeptorschicht mittels Immunhistochemie gemessen. Unter Verwendung dieses Toxizitätsmodells wurden pharmakologische Verbindungen, die den DesoxySL-induzierten Photorezeptortod verhindern, untersucht. Mit einem gezielten Kandidatenansatz stellten wir fest, dass Fenofibrat, ein Medikament, das üblicherweise zur Behandlung von hohem Cholesterinspiegel und Triglyceriden verschrieben wird, auch die DesoxySL-Toxizität in den Zellen der Netzhaut verhindern kann.
Das Toxizitäts-Screening identifizierte erfolgreich ein von der FDA zugelassenes Medikament, das den Tod von Photorezeptoren verhindern kann. Dies ist aufgrund des getesteten hochgradig krankheitsrelevanten Modells ein direkt umsetzbarer Befund. Diese Plattform kann leicht modifiziert werden, um eine beliebige Anzahl von metabolischen Stressoren und potenziellen pharmakologischen Interventionen für die zukünftige Behandlungsforschung bei Netzhauterkrankungen zu testen.
Einleitung
Die Modellierung menschlicher Krankheiten in Zellkultur- und Tiermodellen hat unschätzbare Werkzeuge für die Entdeckung, Modifikation und Validierung pharmakologischer Therapeutika geliefert, die es ihnen ermöglichen, vom Wirkstoffkandidaten zur zugelassenen Therapie zu gelangen. Obwohl eine Kombination von In-vitro- und nicht-humanen In-vivo-Modellen seit langem ein wichtiger Bestandteil der Arzneimittelentwicklungspipeline ist, können sie häufig nicht die klinische Leistung neuartiger Arzneimittelkandidaten vorhersagen1. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Technologien, die die Lücke zwischen vereinfachenden humanzellulären Mo....
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Protokoll
1. Auftauen, Durchlässigkeit und Expansion von iPS-Zellen/ES-Zellen
HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zellkultivierungsschritte Best Practices, um eine sterile Zellkultur zu erhalten.
- Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit Basalmembranmatrixmedium.
- Um 1x dieses Mediums herzustellen, befolgen Sie die Produktspezifikationen oder verdünnen Sie 75 μl Kaltmatrixmedium mit 9 mL DMEM/F12. 1,5 ml frisch zubereitetes 1x Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte geben. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Saugen Sie das Basalmembranmatrixmedium ab und spülen Sie jedes Gut mit 3 ml DMEM/F12 aus. 2 ml DMEM/F12 zugeben und ....
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Ergebnisse
Retinale Organoide wurden aus einer Nicht-MacTel-Kontroll-iPSC-Linie erzeugt. Nachdem die Organoide 26 Wochen in Kultur erreicht hatten, wurden sie ausgewählt und in Versuchsgruppen aufgeteilt. Organoide wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von DesoxySA behandelt, um festzustellen, ob DesoxySA für Photorezeptoren toxisch ist. Es wurden vier Konzentrationen von DesoxySA von 0 bis 1 μM getestet (Abbildung 2) und Organoide wurden 8 Tage lang behandelt, wobei die Medien jeden zweiten Tag.......
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Diskussion
Variationen des Differenzierungsprotokolls
Seit der Erfindung selbstformender optischer Becher durch Yoshiki Sasais Gruppe20 haben viele Labore Protokolle entwickelt, um Netzhautorganoide zu erzeugen, die bei fast jedem Schritt variieren können 5,18,19,21. Eine vollständige Liste der Protokolle findet sich in Capowski et al.22........
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Offenlegungen
Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Unterstützt vom Lowy Medical Research Institute. Wir bedanken uns bei der Familie Lowy für die Unterstützung des MacTel-Projekts. Wir danken Mari Gantner, Mike Dorrell und Lea Scheppke für ihren intellektuellen Input und ihre Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyerkolben | VWR | 89095-258 | |
| 1-Deoxysphinganin | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Saccharose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, Pulver | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Esel Anti-Kaninchen Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| Eselsserum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Hitzeinaktiviertes | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrat | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert | Corning | 356230 | |
| MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stammzellentechnologien | 85850 | |
| N2 Ergänzung | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyd | Thermo-Fisher | 28906 | |
| Kaninchen Anti-Recoverin Antikörper | Millipore | AB5585 | |
| Natriumcitrat | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurin | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. Verbindung | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Platten | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vakuumfiltrationssystem | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-Eindeckmedium | Vektor Labs | H-1000 | |
| Wachsstift-ImmEdge | Vektor Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochlorid (Gesteinsinhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referenzen
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
