Summary
使用自组织方法，我们开发了一种添加COCO的协议，可以显着增加光感受器的产生。
Abstract
视网膜细胞移植是一种很有前途的治疗方法，它可以恢复视网膜结构并稳定甚至改善退化视网膜的视觉能力。然而，细胞替代疗法的进展目前面临着需要高质量和标准化人类视网膜的现成来源的挑战。因此，实验需要一个简单稳定的方案。在这里，我们开发了一种优化的方案，基于自组织方法，使用外源性分子和试剂A以及手动切除来生成三维人视网膜类器官（RO）。人多能干细胞（PSCs）衍生的RO表达光感受器的特异性标志物。随着多功能拮抗剂COCO的加入，光感受器前体和锥细胞的分化效率显着提高。该系统的有效使用具有细胞系和原代细胞的优点，并且没有与后者相关的来源问题，可以产生汇合的视网膜细胞，尤其是光感受器。因此，PSCs与RO的分化为疾病建模，药物筛选和细胞移植提供了最佳的生物相关平台。
Introduction
多能干细胞（PSC）的特点是其自我更新和分化成各种体细胞的能力。因此，源自PSCs的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性的特征是光感受器（视杆细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮的丧失。视网膜细胞置换可能是这种疾病的一种令人鼓舞的治疗方法。然而，获得人类视网膜用于疾病研究和治疗是不可行的。因此，源自 PSC 的视网膜类器官 （RO） 可有效且成功地概括多层天然视网膜细胞，有利于基础和转化研究1，2，3。我们的研究重点是RO分化，为研究视网膜变性提供充足和优质的细胞4。
区分RO的方法不断涌现，Sasai实验室于2012年率先采用三维（3D）悬浮液区分5。我们在人类胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标签，以特异性跟踪感光器前体细胞，并通过添加COCO（Wnt，TGF-β和BMP途径的多功能拮抗剂6）来修改方法。COCO已被证明可以有效地提高感光器前体和视锥细胞的分化效率6，7。
总之，通过修改经典的分化方法，我们开发了一种可访问的方案，可以从人类RO中收集丰富的感光器前体和视锥细胞，以通过实验室调查分析与感光器相关的视网膜疾病，并用于进一步的临床应用/移植。
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Protocol
本研究获得首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 hESCs是从WiCell研究所获得的，并经过基因工程改造为tdTomato标记的细胞系。
1. 人类RO的产生
- 在无饲养层条件下培养hESC。
- 按照制造商的说明，在 37 °C 下用 1 mL 的 0.1 mg/mL 试剂 A（材料表）涂覆 6 孔板的一个孔至少半小时。解冻 1x106 hESC 的等分试样。
注意：准备 3 mL 预热试剂 B（材料表），并将冷冻保存的细胞 （1 mL） 转移到 3 mL 新鲜培养基中。不要将hESC移液到单个细胞。 - 以200× g 离心5分钟，除去上清液。
- 将细胞接种到装有 2 mL 试剂 B 的试剂 A 包被板中，每天更换 2 mL 试剂 B。当达到约80%汇合度（通常约4天）时传代细胞。
- 按照制造商的说明，在 37 °C 下用 1 mL 的 0.1 mg/mL 试剂 A（材料表）涂覆 6 孔板的一个孔至少半小时。解冻 1x106 hESC 的等分试样。
- 第 0 天
- 使用培养基I将hESC解离为单细胞悬液（表1）。通过混合以下物质制备培养基 I：20% （v/v） 敲除血清替代 （KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液 （NEAA）、1 mM 丙酮酸、3 μM IWR-1-内切 （IWR1e）、30 ng/mL COCO、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 （PS）、0.1 mM β-巯基乙醇和格拉斯哥鹰氏最小必需培养基 （GMEM）。
注意：在解离开始之前，制备培养基I并将12 mL培养基I和20μM Y-27632转移到10 cm培养皿，500μL试剂C（材料表）中，其中含有0.05 mg / mL试剂D（材料表）和20 μM Y-27632在1.5 mL管中。在黑暗中执行上述步骤，因为介质I中的组分IWR1e对光敏感。 - 用预热的1x Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）缓冲液洗涤hESC。
- 加入准备好的 500 μL 试剂（在 1.5 mL 管中），并将 hESC 在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 3.5 分钟。
- 通过轻弹板的侧面和底部几秒钟来分离细胞，并从培养皿中加入 500 μL 准备好的培养基 I 到 hESC 板中。
注意：准备含有 900 μL 1x DPBS 的 1.5 mL 管，并使用血细胞计数器进行细胞计数。 - 在新的 1.5 mL 管中收获细胞，上下移液细胞悬液，然后从管中取出 100 μL，然后加入装有 900 μL DPBS 的试管中进行细胞计数。
- 分散左侧 900 μL 细胞悬液，然后在培养皿中用准备好的培养基 I 将细胞稀释至 9 x 104 个细胞/mL。
注意：培养基的总体积为 12 mL;总共需要 1.08 x 106 个单元格。 - 向非贴壁、V 底、96 孔板的每个孔中加入 100 μL 细胞悬液（材料表）。
注意：使用多通道移液器缩短时间，并确保每个孔包含等效的细胞数。每次摇动培养皿，然后取出 100 μL 份。重要的是细胞均匀分布。 - 在低速振荡器中轻轻旋转96孔板5分钟，然后在37°C和5%CO2下孵育。
注意：将盘子放在黑暗中。将日期设置为第 0 天。
- 使用培养基I将hESC解离为单细胞悬液（表1）。通过混合以下物质制备培养基 I：20% （v/v） 敲除血清替代 （KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液 （NEAA）、1 mM 丙酮酸、3 μM IWR-1-内切 （IWR1e）、30 ng/mL COCO、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 （PS）、0.1 mM β-巯基乙醇和格拉斯哥鹰氏最小必需培养基 （GMEM）。
- 第二天
- 加入1%试剂A（材料表）。通过将 133.4 μL 试剂 A 加入 2 mL 培养基 I 中来制备试剂 A（蛋白质浓度为 10 mg/mL）。
注意：使用前将试剂A保持在4°C过夜，以实现完全均匀的熔化。请注意产品信息，并在公司官方网站上搜索目录号和批号，以获得试剂A的蛋白质浓度，因为每瓶试剂A的蛋白质浓度不同。如果蛋白质浓度低，增加试剂A的体积会有所帮助。 - 向每个孔中加入 20 μL 准备好的试剂 A，并在中心移液两次以分散死细胞。
注意：在凉爽的条件下保持试剂A和96孔板，并在冰上完成所有步骤。将盘子放在黑暗中。
- 加入1%试剂A（材料表）。通过将 133.4 μL 试剂 A 加入 2 mL 培养基 I 中来制备试剂 A（蛋白质浓度为 10 mg/mL）。
- 第2-12天
- 清洁96孔板的底部，并在37°C和5%CO2 下孵育直至第6天。在第 6 天，通过从每个孔中取出 58 μL 培养基并加入 60 μL 培养基 I 来更换一半的培养基。
注意：使用多通道移液器完成半介质更换。轻轻地执行此步骤，以确保没有细胞沉淀从孔中取出。将培养基吸入干净的10厘米培养皿中。如果内部有细胞沉淀，请将它们加回 96 孔板。
- 清洁96孔板的底部，并在37°C和5%CO2 下孵育直至第6天。在第 6 天，通过从每个孔中取出 58 μL 培养基并加入 60 μL 培养基 I 来更换一半的培养基。
- 第12-18天
- 在第12天将培养基更换为培养基II（表1）。使用 1% （v/v） 试剂 A 混合以下内容制备培养基 II：10% 胎牛血清 （FBS）、0.1 mM NEAA、1 mM 丙酮酸、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.1 mM β-巯基乙醇、100 nM SAG 二盐酸盐和 GMEM。将其存放在阴凉和黑暗的条件下。
- 从 15 孔板的 96 mL 锥形管中收获细胞沉淀，并使沉淀在室温下自然沉降 5 分钟。
注意：在表面下轻轻取出培养基和颗粒以避免气泡。 - 在照顾类器官的同时去除上清液。将细胞聚集体转移到含有18mL制备的培养基II和试剂A的10cm悬浮培养皿中。
注意：不要提前将准备好的培养基II添加到10厘米的培养皿中，因为试剂A应在4°C下。 - 在37°C和5%CO2 下孵育至第18天。
- 从第18天开始
- 将培养基更换为培养基III（表1）。在黑暗条件下通过混合以下内容制备培养基III：10%FBS，1x补充剂1，0.5μM维甲酸（RA），100μM牛磺酸，100 U / mL青霉素，100 μg/ mL链霉素和Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）/营养混合物F-12的1：1混合物。
- 在第18天，当产生半透明光学囊泡时，使用显微手术刀切割类器官。
注意：将类器官（通常切成四块）在培养基II的培养皿中。在接下来的几周内，每一块都应该长成一个完整的光学杯。 - 将所有颗粒聚集到培养皿的中心。将细胞收获到 15 mL 锥形猎鹰管中并让其自然沉降。然后轻轻除去上清液。
注意：由于它们的大小，可以通过在水平面上将培养皿沿一个方向旋转90°几次来在中心聚集类器官。 - 将沉淀悬浮并分散在两个 10 cm 培养皿中，每培养皿含有 18 mL 培养基 III，并将培养皿轻轻转移到培养箱中以避免细胞聚集。继续在37°C和5%CO2 的培养基III中培养，并每周更换培养基。CRX在第45天之后表达，直到第120天，我们可以检测到感光器的外段。
2. 分析人体反渗透
- FACS 分析
- 使用切割的 1 mL 吸头从培养皿中组装三个 CRX-tdTomato 和三个 H9 ES 衍生类器官。用 1 mL 预热（室温）DPBS 洗涤类器官。
- 通过将 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液与 0.05 mg/mL 试剂 D 混合来制备消化缓冲液。
- 使用制备的消化缓冲液在37°C下解离8分钟，将类器官解离成单细胞。 然后加入相同体积的DPBS和10%FBS和0.05mg / mL试剂D以灭活反应。
- 轻轻悬浮和散射细胞，然后使用 100 μm 细胞过滤器过滤，并使用 561 nm 激发激光线和 780/60 滤光片的荧光激活细胞分选 （FACS） 系统来分析 CRX-tdTomato 阳性信号。
注意：CRX最初在第45天表达，并随着类器官的成熟而增加。每个测试使用一万个单元格，对于每个时间点，至少完成三次重复。
- RO的荧光强度定量
- 随机制备活类器官进行成像。
注意：设置参数，并对所有荧光强度监测仪使用相同的滤光片和参数。 - 捕获图像并使用合适的软件（例如ImageJ）分析平均荧光强度。
- 导入图像，然后使用图像|转换为 8 位 类型。
- 通过图像|使用默认参数调整阈值 调整|阈值。
- 确定测量区域，然后使用分析|评估灰度值 测量。
注意：结果面板中的平均值是测量区域的平均荧光强度。
- 随机制备活类器官进行成像。
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Representative Results
示意图描述了用COCO改善母离子细胞的分化方案（图1）。从 PSC 到 RO，许多细节都可能导致结果差异。建议记录每个步骤，甚至每种介质的目录号和批号，以跟踪整个过程。
在本文中，我们提供了第6、12、18和45天的明场图像（图2）。在第6天，类器官在96孔板中的直径通常在600μm左右，内部有密集的连接和明亮的边缘（图2A）。在第12天，最初产生视囊泡样结构（图2B）。从第12天到第18天，视囊泡结构的存在是明确的，并且在第18天后它们继续生长。丢弃没有囊泡样结构的类器官（图2C）。到第30天，囊泡样结构更加明显，并且更容易区分上位RO和劣质RO（图2D-E）。失去半透明结构的类器官（图2D-E中的星号）应在接下来的几天内去除。
类器官从第45天开始表达CRX，CRX是感光器前体的标志物（图2F，2I）。其他感光器前体标志物，如RCVRN和OTX2，在第45天也得到阳性检测（图2G-H）。COCO的添加促进了感光器前体的产生。
图1.逐步治疗 RO 与 hESC 分化的时间表。请点击此处查看此图的大图。
图2.人类视网膜类器官生成。 （A-B）早期视囊泡样结构形成在96孔板中。黑色箭头表示视囊泡样结构。（C）第18天在培养皿中悬浮培养的第一天。（D-E）在这个阶段观察到光学杯结构。星星显示下级类器官（F）第45天的明场图像。比例尺 = 400 μm。 （G-H） RCVRN （G） 和 OTX2 （H） 在第 45 天的免疫染色结果。比例尺 = 50 μm。 （I） TdTomato阳性信号表示（F）中第45天CRX的表达。比例尺 = 400 μm。 请点击此处查看此图的大图。
| 培养基 I （50 mL） | ||||||||
| KSR | G-MEM | 国家能源局 | 丙酮 酸 | b-ME | IWR1e | 可可 | 附言 | |
| 百分比 % 或最终浓度 | 20 | 78 | 0.1毫米 | 1 毫米米 | 0.1毫米 | 3微米 | 30 纳克/毫升 | 1 |
| 卷 | 10毫升 | 39毫升 | 0.5毫升 | 0.5毫升 | 90.9 微升 | 5 微升 | 10 微升 | 0.5毫升 |
| IWR1e的储存浓度为30mM。可可值为150微克/毫升。 | ||||||||
| 培养基 II （50 mL） | ||||||||
| FBS | G-MEM | 国家能源局 | 丙酮 酸 | b-ME | 下垂 | 附言 | ||
| 百分比 % 或最终浓度 | 10 | 88 | 0.1毫米 | 1 毫米米 | 0.1毫米 | 100 纳米 | 1 | |
| 卷 | 5毫升 | 44毫升 | 0.5毫升 | 0.5毫升 | 90.9 微升 | 2.5 微升 | 0.5毫升 | |
| SAG的储存浓度为2mM。 | ||||||||
| 培养基 III （50 mL） | ||||||||
| FBS | DMEM/F12- 谷氨酰胺 | 补编1 | RA | 牛磺酸 | 附言 | |||
| 百分比 % 或最终浓度 | 10 | 88 | 1 | 0.5微米 | 100微米 | 1 | ||
| 卷 | 5毫升 | 44毫升 | 0.5毫升 | 5 微升 | 50 微升 | 0.5毫升 | ||
| RA的储存浓度为5mM，牛磺酸为100mM。 | ||||||||
表 1：培养基 I、II 和 II 配方
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Discussion
视网膜类器官分化是产生充足功能性视网膜细胞的理想方法。RO是由多能干细胞朝向神经视网膜4，5，8，9产生的不同视网膜细胞（例如神经节细胞，双极细胞和光感受器）的复合物。虽然可以收获汇合的RO，但它很耗时，可能需要很长的培养期（长达180天）。然而，对于感光器移植，或研究锥杆或视杆-锥营养不良，在3D培养系统10中获得相对较高百分比的感光器是有利的。
在不中断正常发育过程的情况下监测类器官的发育也是具有挑战性的。因此，我们使用CRX，一种主要在光感受器前体中表达的锥杆同源盒蛋白，作为靶基因，在3D分化过程中追踪光感受器前体细胞。使用tdTomato系统，表达CRX的细胞可以通过红色荧光进行时空跟踪，而不会在其3D分化过程中中断视网膜化。利用CRX-tdTomato系统可以加速ROs中光感受器前体分化的药物筛选过程。
使用我们的方法，大约70%的类器官可以发育成视网膜类器官，其显示囊泡样结构。重要的是，通过高级类器官的切口，我们通常可以从96孔板中收获约100个视网膜类器官。此外，在RO成熟的早期阶段，COCO培养物会产生丰富的光感受器前体，这有助于通过途径调节11，12向某些细胞的直接分化发展。试剂A的蛋白质浓度对于分化至关重要。总之，早期充足的试剂A和聚集体以及第18天切割类器官对于收获高质量的丰富RO非常重要。该方法还促进了3D类器官中光感受细胞定向分化的发展，并有助于感光细胞的移植。
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Acknowledgments
我们感谢502实验室成员对稿件的技术支持和有益意见。这项工作得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划（2017YFA0105300）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
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