Summary
Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.
Abstract
O transplante de células da retina é uma abordagem terapêutica promissora, que poderia restaurar a arquitetura da retina e estabilizar ou mesmo melhorar as capacidades visuais da retina degenerada. No entanto, o progresso na terapia de reposição celular atualmente enfrenta os desafios de exigir uma fonte pronta para uso de retinas humanas padronizadas e de alta qualidade. Portanto, um protocolo fácil e estável é necessário para os experimentos. Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado, baseado em um método de auto-organização com o uso de moléculas exógenas e reagente A, bem como excisão manual para gerar os organoides tridimensionais da retina humana (RO). As RO derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) expressam marcadores específicos para fotorreceptores. Com a adição de COCO, um antagonista multifuncional, a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores é significativamente aumentada. O uso eficiente deste sistema, que tem os benefícios de linhagens celulares e células primárias, e sem os problemas de fornecimento associados a este último, poderia produzir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Assim, a diferenciação de PSCs para RO fornece uma plataforma ótima e biorrelevante para modelagem de doenças, triagem de medicamentos e transplante de células.
Introduction
As células-tronco pluripotentes (PSCs) são caracterizadas por sua auto-renovação e capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas. Assim, os organoides derivados de PSCs tornaram-se um recurso importante na pesquisa em medicina regenerativa. A degeneração da retina é caracterizada pela perda de fotorreceptores (bastonetes e cones) e epitélio pigmentar da retina. A substituição das células da retina pode ser um tratamento encorajador para esta doença. No entanto, não é viável obter retinas humanas para pesquisa e terapia de doenças. Portanto, os organoides da retina (ROs) derivados de PSCs, que recapitulam de forma eficaz e bem-sucedida as células nativas da retina em várias camadas, são benéficos para a pesquisa básica e translacional 1,2,3. Nossa pesquisa se concentra na diferenciação de RO para fornecer células suficientes e de qualidade para estudar a degeneração da retina4.
Métodos para diferenciar ROs estão continuamente surgindo, com diferenciação de suspensão tridimensional (3D) pioneira pelo laboratório Sasai em 20125. Introduzimos a etiqueta CRX-tdTomato nas células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para rastrear especificamente as células precursoras dos fotorreceptores e modificamos o método com a adição de COCO, um antagonista multifuncional das vias Wnt, TGF-β e BMP6. Demonstrou-se que o COCO melhora eficientemente a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores 6,7.
Em conjunto, modificando o método clássico de diferenciação, desenvolvemos um protocolo acessível para colher abundantes precursores e cones de fotorreceptores de ROs humanas para análise da doença retiniana associada aos fotorreceptores através de investigações laboratoriais e para posterior aplicação/transplante clínico.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. As hESCs H9 foram obtidas do WiCell Research Institute e geneticamente modificadas para a linhagem celular marcada com tdTomato.
1. Geração de ROs humanas
- Cultive os hESCs em condições livres de alimentadores.
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
NOTA: Preparar 3 mL de reagente B pré-aquecido (Tabela de Materiais) e transferir as células criopreservadas (1 mL) para 3 mL de meio fresco. Não pipete as hESCs para células únicas. - Centrifugar a 200 x g durante 5 min e remover o sobrenadante.
- Semeia as células na placa revestida com A do reagente com 2 mL de reagente B e troque 2 mL de reagente B diariamente. Células de passagem quando atingem aproximadamente 80% de confluência (geralmente em torno de 4 dias).
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
- Dia 0
- Dissociar as hESCs de uma suspensão unicelular utilizando o meio I (Tabela 1). Preparar o meio I misturando o seguinte: 20% (v/v) de reposição sérica KnockOut (KSR), solução de aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (PS), 0,1 mM β-mercaptoetanol e meio essencial mínimo de Glasgow Eagle (GMEM).
NOTA: Antes do início da dissociação, preparar o meio I e transferir 12 mL do meio I com 20 μM Y-27632 para uma placa de Petri de 10 cm, 500 μL de reagente C (Tabela de Materiais) contendo 0,05 mg/mL de reagente D (Tabela de Materiais) e 20 μM Y-27632 em um tubo de 1,5 mL. Execute as etapas acima no escuro, pois o componente IWR1e no meio I é sensível à luz. - Lave as hESCs com o tampão salino tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido 1x da Dulbecco.
- Adicionar o reagente preparado de 500 μL (no tubo de 1,5 ml) e incubar as hESCs durante 3,5 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Retire as células agitando o lado e o fundo da placa por alguns segundos e adicione 500 μL de meio preparado I da placa de Petri na placa hESC.
NOTA: Prepare um tubo de 1,5 mL com 900 μL de 1x DPBS e use um hemocitômetro para contagem celular. - Colha as células em um novo tubo de 1,5 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo e, em seguida, retire 100 μL do tubo e, em seguida, adicione ao tubo com 900 μL de DPBS para contagem de células.
- Dispersar a suspensão celular esquerda de 900 μL e, em seguida, diluir as células com o meio preparado I na placa de Petri para 9 x 104 células/mL.
NOTA: O volume total do meio é de 12 mL; 1,08 x 106 células são necessárias no total. - Adicionar 100 μL de suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços não aderente, com fundo em V (Tabela de Materiais).
NOTA: Use uma pipeta multicanal para encurtar o tempo e garantir que cada poço contenha um número de célula equivalente. Agite a placa de Petri de cada vez antes de remover as porções de 100 μL. É importante que as células sejam uniformemente distribuídas. - Gire levemente a placa de 96 poços em um agitador de baixa velocidade por 5 minutos e, em seguida, incube a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Mantenha a placa no escuro. Defina o dia como dia 0.
- Dissociar as hESCs de uma suspensão unicelular utilizando o meio I (Tabela 1). Preparar o meio I misturando o seguinte: 20% (v/v) de reposição sérica KnockOut (KSR), solução de aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (PS), 0,1 mM β-mercaptoetanol e meio essencial mínimo de Glasgow Eagle (GMEM).
- Dia 2
- Adicione 1% de reagente A (Tabela de Materiais). Preparar o reagente A (concentração proteica de 10 mg/mL) adicionando 133,4 μL de reagente A em 2 mL de meio I.
NOTA: Manter o reagente A a 4 °C durante a noite antes da utilização para obter uma fusão completa e uniforme. Observe as informações do produto e pesquise o número de catálogo e o número de lote no site oficial da empresa para ter a concentração de proteína do reagente A, pois cada frasco de reagente A está em uma concentração de proteína diferente. Se a concentração de proteína for baixa, um aumento do volume de reagente A seria útil. - Adicionar 20 μL de reagente A preparado a cada poço e pipetar duas vezes no centro para espalhar as células mortas.
NOTA: Mantenha o reagente A e a placa de 96 poços em condições frias e complete todas as etapas no gelo. Coloque o prato no escuro.
- Adicione 1% de reagente A (Tabela de Materiais). Preparar o reagente A (concentração proteica de 10 mg/mL) adicionando 133,4 μL de reagente A em 2 mL de meio I.
- Dia 2-12
- Limpar o fundo da placa de 96 poços e incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 6. No dia 6, mude metade do meio removendo 58 μL do meio de cada poço e adicionando 60 μL de meio I.
NOTA: Use uma pipeta multicanal para concluir a meia mudança média. Conduza esta etapa com cuidado para garantir que nenhuma pelota de célula seja removida do poço. Aspirar o meio em uma placa de Petri limpa de 10 cm. Se houver pellets de células dentro, adicione-os de volta à placa de 96 poços.
- Limpar o fundo da placa de 96 poços e incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 6. No dia 6, mude metade do meio removendo 58 μL do meio de cada poço e adicionando 60 μL de meio I.
- Dias 12-18
- Alterar o médio para o médio II (Tabela 1) no dia 12. Preparar o meio II utilizando o reagente A a 1% (v/v) misturando o seguinte: 10% de soro fetal bovino (FBS), NEAA de 0,1 mM, piruvato de 1 mM, penicilina de 100 U/mL, estreptomicina de 100 μg/mL, β-mercaptoetanol de 100 mM, dicloridrato SAG de 100 nM e GMEM. Armazene-o em condições frias e escuras.
- Colha os pellets de células em um tubo cônico de 15 mL da placa de 96 poços e deixe que os pellets se depositem naturalmente por 5 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Remova o meio e os pellets suavemente sob a superfície para evitar bolhas. - Remova o sobrenadante enquanto cuida dos organoides. Transferir os agregados celulares para uma placa de suspensão de 10 cm contendo 18 mL de meio preparado II com o reagente A.
NOTA: Não adicione o meio preparado II ao prato de 10 cm de antecedência, uma vez que o reagente A deve estar a 4 °C. - Incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 18.
- A partir do dia 18
- Alterar o médio para o médio III (Tabela 1). Preparar o meio III em condições escuras misturando o seguinte: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM de ácido retinóico (AR), 100 μM de taurina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 1:1 mistura de meio águia modificado (DMEM)/mistura de nutrientes F-12 da Dulbecco.
- No dia 18, quando uma vesícula óptica semitransparente é gerada, corte os organoides usando uma faca microcirúrgica.
NOTA: Deixe o organoide, geralmente em quatro pedaços, em uma placa de Petri com meio II. Cada peça deve crescer em um copo óptico intacto nas semanas seguintes. - Agregar todos os pellets ao centro do prato. Colha as células em um tubo de falcão cônico de 15 mL e permita a sedimentação natural. Em seguida, remova suavemente o sobrenadante.
NOTA: Devido aos seus tamanhos, os organoides podem ser agregados no centro girando a placa de Petri em uma direção por 90° em um plano horizontal algumas vezes. - Suspender e dispersar os pellets em duas placas de Petri de 10 cm, com 18 mL de meio III por prato, e transferir suavemente os pratos para a incubadora para evitar a agregação celular. Continuar a cultura em meio III a 37 °C e 5% de CO2 e mudar o meio semanalmente. A CRX expressa após o dia 45 e até o dia 120, foi possível detectar o segmento externo do fotorreceptor.
2. Analisando ROs humanas
- Análise FACS
- Monte três organoides derivados de CRX-tdTomate e três H9 ES dos pratos usando as pontas cortadas de 1 mL. Lave os organoides com 1 mL de DPBS pré-aquecido (temperatura ambiente).
- Preparar o tampão de digestão misturando solução de tripsina-EDTA a 0,25% com 0,05 mg/ml de reagente D.
- Dissociar os organoides em células únicas utilizando o tampão de digestão preparado durante 8 minutos a 37 °C. Em seguida, adicione o mesmo volume de DPBS com FBS a 10% e 0,05 mg/mL de reagente D para inativar a reação.
- Suspenda e espalhe levemente as células e, em seguida, filtre usando um filtro celular de 100 μm e use um sistema de Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) na linha de laser de excitação de 561 nm e filtro 780/60 para analisar os sinais positivos CRX-tdTomato.
NOTA: CRX expressa inicialmente no dia 45 e aumenta com a maturação dos organoides. Dez mil células são usadas para cada teste, para cada ponto de tempo, pelo menos três repetições são concluídas.
- Quantificação da intensidade de fluorescência das ROs
- Prepare os organoides viáveis aleatoriamente para imagens.
NOTA: Defina os parâmetros e use os mesmos filtros e parâmetros para todos os monitores de intensidade de fluorescência. - Capture imagens e analise a intensidade média de fluorescência usando um software adequado (por exemplo, ImageJ).
- Importe as imagens e, em seguida, converta para 8 bits usando a | de Imagem Digite.
- Ajuste o limite usando os parâmetros padrão por Image | Ajustar | Limiar.
- Determine a área medida e, em seguida, avalie o valor cinza usando Analisar | Medida.
NOTA: Os valores médios no painel de resultados são a intensidade média de fluorescência da área medida.
- Prepare os organoides viáveis aleatoriamente para imagens.
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Representative Results
A ilustração esquemática retrata o protocolo de diferenciação para melhorar as células precursoras com COCO (Figura 1). De PSC a ROs, inúmeros detalhes podem causar variações de resultados. Recomenda-se registrar cada etapa e até mesmo o número de catálogo e o número de lote de cada meio para acompanhar todo o procedimento.
Aqui, fornecemos imagens de campo brilhante para os dias 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). No dia 6, os organoides geralmente têm cerca de 600 μm de diâmetro em uma placa de 96 poços, com conexões densas no interior e borda brilhante (Figura 2A). No dia 12, as estruturas ópticas semelhantes a vesículas são geradas inicialmente (Figura 2B). Do dia 12 ao dia 18, a presença de estruturas de vesículas ópticas é clara, e elas continuaram a crescer após o dia 18. Os organoides sem a arquitetura vesicular são descartados (Figura 2C). No dia 30, a arquitetura semelhante a uma vesícula é mais óbvia, e é mais fácil distinguir as ROs superiores das inferiores (Figura 2D-E). Os organoides que perdem a estrutura translúcida (asteriscos na Figura 2D-E), devem ser removidos nos dias seguintes.
Os organoides expressam a CRX, que é um marcador de precursores fotorreceptores, a partir do dia 45 (Figura 2F,2I). Outros marcadores precursores de fotorreceptores, como RCVRN e OTX2, também foram detectados positivamente no 45º dia (Figura 2G-H). A adição de COCO promove a geração de precursores fotorreceptores.
Figura 1. Calendário para o tratamento gradual da diferenciação da RO do hESC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Geração de organoides da retina humana. (A-B) Estrutura em estágio inicial semelhante a uma vesícula óptica formada em uma placa de 96 poços. As setas pretas indicam as estruturas ópticas semelhantes a vesículas. (C) O primeiro dia de cultura de suspensão em uma placa de Petri no dia 18. (D-E) Estruturas ópticas do copo são observadas nesta fase. As estrelas mostram os organoides inferiores (F) A imagem de campo brilhante no dia 45. Barras de escala = 400 μm. (G-H) Resultados da imunocoloração de RCVRN (G) e OTX2 (H) no dia 45. Barras de escala = 50 μm. (I) Sinais TdTomate-positivos indicam a expressão de CRX no dia 45 em (F). Barras de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Média I (50 mL) | ||||||||
| KSR | G-MEM | NEAA | Piruvato | b-ME | IWR1e | COCO | PS | |
| Percentagem % OU concentração final | 20 | 78 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 3 μM | 30 ng/mL | 1 |
| Volume | 10 mL | 39 mL | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 5 μL | 10 μL | 0,5 ml |
| A concentração de armazenamento de IWR1e é de 30 mM. COCO é de 150 μg/mL. | ||||||||
| Meio II (50 mL) | ||||||||
| FBS | G-MEM | NEAA | Piruvato | b-ME | SAG | PS | ||
| Percentagem % OU concentração final | 10 | 88 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 100 nM | 1 | |
| Volume | 5 mL | 44 mL | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 2,5 μL | 0,5 ml | |
| A concentração de armazenamento do SAG é de 2 mM. | ||||||||
| Médio III (50 mL) | ||||||||
| FBS | DMEM/F12- Glutamax | Suplemento 1 | RA | Taurina | PS | |||
| Percentagem % OU concentração final | 10 | 88 | 1 | 0,5 μM | 100 μM | 1 | ||
| Volume | 5 mL | 44 mL | 0,5 ml | 5 μL | 50 μL | 0,5 ml | ||
| A concentração de armazenamento de AR é de 5 mM, e a taurina é de 100 mM. | ||||||||
Tabela 1: Receitas médias I, II e II
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Discussion
A diferenciação organoide retiniana é um método desejável para a geração de amplas células funcionais da retina. A RO é um composto de diferentes células da retina, como células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, geradas por células-tronco pluripotentes em direção à retina neural 4,5,8,9. Embora as ROs confluentes possam ser colhidas, é demorado, o que pode exigir longos períodos de cultivo (até 180 dias). No entanto, para o transplante de fotorreceptores, ou para o estudo da distrofia cone-bastonete ou bastonete-cone, é vantajoso obter uma porcentagem relativamente alta de fotorreceptores no sistema de cultura 3D10.
Também é um desafio monitorar o desenvolvimento dos organoides sem interromper os processos normais de desenvolvimento. Portanto, utilizamos CRX, uma proteína homeobox de bastonete cônico, predominantemente expressa em precursores de fotorreceptores, como um gene alvo para rastrear células precursoras de fotorreceptores durante sua diferenciação 3D. Com o sistema tdTomato, as células que expressam CRX podem ser rastreadas espaço-temporalmente pela fluorescência vermelha sem interromper a retinalização durante sua diferenciação 3D. A utilização do sistema CRX-tdTomato poderia acelerar o processo de triagem de fármacos para diferenciação de precursores fotorreceptores nas ROs.
Usando nosso método, cerca de 70% dos organoides poderiam se transformar em organoides da retina, que exibem as estruturas semelhantes a vesículas. É importante ressaltar que, com a incisão de organoides superiores, geralmente poderíamos colher cerca de 100 organoides da retina de uma placa de 96 poços. Além disso, precursores fotorreceptores abundantes são gerados no estágio inicial da maturação da RO com a cultura COCO, o que auxilia na progressão para a diferenciação direta de certas células por meio da regulação da via11,12. A concentração proteica do reagente A é crucial para a diferenciação. No total, o reagente A suficiente com os agregados nos primeiros dias, bem como o corte dos organoides no dia 18 são importantes para colher ROs abundantes com alta qualidade. Este método também promove o desenvolvimento da diferenciação direcional de células fotorreceptoras em organoides 3D e contribui para o transplante de células fotorreceptoras.
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Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório 502 por seus apoios técnicos e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014) e pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
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