Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62364
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد العينات المبردة ونقل البلورات إلى المحطة النهائية الفراغية على خط الشعاع I23 في Diamond Light Source ، لتجارب علم البلورات بالأشعة السينية الجزيئية الكبيرة طويلة الطول الموجي.

Abstract

يستغل علم البلورات الجزيئية الكبيرة طويل الطول الموجي (MX) خصائص التشتت الشاذة للعناصر ، مثل الكبريت أو الفوسفور أو البوتاسيوم أو الكلور أو الكالسيوم ، والتي غالبا ما تكون موجودة أصلا في الجزيئات الكبيرة. وهذا يتيح الحل الهيكلي المباشر للبروتينات والأحماض النووية عن طريق المراحل التجريبية دون الحاجة إلى وضع علامات إضافية. للقضاء على امتصاص الهواء الكبير للأشعة السينية في نظام الطول الموجي هذا ، يتم إجراء هذه التجارب في بيئة فراغية. Beamline I23 في Diamond Light Source ، المملكة المتحدة ، هي أول أداة سنكروترون من نوعها ، مصممة ومحسنة لتجارب MX في نطاق الطول الموجي الطويل نحو 5 Å.

لجعل هذا ممكنا ، يحيط وعاء فراغ كبير بجميع مكونات المحطة النهائية لبيئة العينة. تتطلب ضرورة الاحتفاظ بالعينات في درجات حرارة مبردة أثناء التخزين وجمع البيانات في الفراغ استخدام حاملات عينات موصلة حراريا. وهذا يسهل إزالة الحرارة بكفاءة لضمان تبريد العينات إلى حوالي 50 كلفن. يصف البروتوكول الحالي الإجراءات المستخدمة لإعداد العينات ونقل العينات إلى فراغ على خط الشعاع I23. لضمان التوحيد في الممارسات والأساليب التي تم وضعها بالفعل داخل مجتمع علم البلورات الجزيئي الكبير ، يمكن إجراء تبريد العينات إلى درجة حرارة النيتروجين السائل في أي بيئة مختبرية مجهزة بأدوات MX القياسية.

ولا يتطلب تخزين العينات ونقلها بالتبريد سوى معدات قياسية متاحة تجاريا. هناك حاجة إلى معدات متخصصة لنقل البلورات المبردة بالتبريد من النيتروجين السائل إلى محطة نهاية التفريغ. تم تطوير أدوات مخصصة للتعامل مع العينات ونظام نقل مبرد مخصص (CTS) في المنزل. تظهر بيانات الحيود التي تم جمعها على العينات المعدة باستخدام هذا البروتوكول إحصاءات دمج ممتازة ، مما يشير إلى أن جودة العينات لا تتغير أثناء الإجراء. وهذا يفتح فرصا فريدة ل MX داخل الفراغ في نطاق الطول الموجي الذي يتجاوز خطوط شعاع السنكروترون القياسية.

Introduction

يستخدم حيود الأشعة السينية طويل الطول الموجي لتسخير خصائص التشتت الشاذة لذرات ضوئية محددة موجودة أصلا في الجزيئات الكبيرة. هذا يساعد على حل مشكلة الطور البلوري وتأكيد هوية وموقع هذه العناصر داخل الجزيئات الكبيرة بشكل لا لبس فيه. بينما في الأيام الأولى لعلم البلورات الجزيئية الكبيرة، تم حل هياكل دي نوفو عن طريق استبدال متساوي الشكل متعدد1، مع ظهور خطوط شعاع الأشعة السينية القابلة للضبط في السنكروترونات، أصبحت المراحل التجريبية القائمة على تقنيات الحيود الشاذة متعددة الطول الموجي والطول الموجي الواحد (SAD) هي الطرق السائدة2 . وقد اعتمدت كلتا الطريقتين تاريخيا على الإشارة متساوية الشكل أو الشاذة من المعادن الثقيلة، والتي تحتاج إلى إدخالها بشكل مصطنع في البلورات عن طريق التبلور المشترك أو نقع الكريستال3. يمكن لنهج التجربة والخطأ والنتائج التي لا يمكن التنبؤ بها أن تجعل هذه التجارب تستغرق وقتا طويلا بشكل محبط. يعد دمج سيلينو-ميثيونين أثناء التعبير عن البروتين4 طريقة أنيقة للغاية للتغلب على هذه القيود واستغلال الحيود الشاذ عند أطوال موجية قصيرة، على الرغم من أنه يمكن أن يكون صعبا للغاية في أنظمة التعبير عن البروتين حقيقية النواة.

يعد MX ذو الطول الموجي الطويل جذابا للغاية لتحديد البنية من خلال تجارب SAD الأصلية5,6 نظرا لراحة استخدام البلورات مباشرة من تجربة تبلور ناجحة دون مزيد من المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوصول إلى حواف امتصاص العناصر ذات الأهمية البيولوجية العالية ، مثل الكالسيوم والبوتاسيوم والكلور والكبريت والفوسفور ، يفتح الفرصة لتحديد مواقع هذه العناصر مباشرة في الجزيئات الكبيرة7،8،9،10. في الدقة المتوسطة والمنخفضة ، يمكن أن يكون تعيين العناصر استنادا إلى كثافة الإلكترون 2Fo-Fc والبيئة الكيميائية أمرا صعبا ، خاصة بالنسبة للعناصر ذات العدد المماثل من الإلكترونات أو الأيونات ضعيفة الارتباط ذات الإشغالات الجزئية. يمكن حل هذه الالتباسات عن طريق جمع البيانات أسفل وفوق حافة الامتصاص لعنصر الاهتمام وتفسير الفرق الشاذ الناتج عن النموذج المرحلي خرائط فورييه11،12. ويمكن أن يساعد تحديد مواقع ذرات الكبريت في هذه الخرائط أيضا في بناء النماذج في خرائط كثافة الإلكترونات منخفضة الدقة13. ولوحظت حواف امتصاص هذه العناصر الضوئية بأطوال موجية تتراوح بين λ = 3 و 6 Å (انظر الشكل 1، الأعلى). لقد كان نطاق الطول الموجي هذا أبعد بكثير من قدرات أي خط شعاع MX سنكروترون ، ويتطلب التشغيل الفعال في هذا النطاق التغلب على العديد من التحديات التقنية ، كما هو موضح أدناه.

Beamline I23 في Diamond Light Source، المملكة المتحدة، هو أداة فريدة من نوعها، مصممة خصيصا لتسهيل تجارب MX ذات الطول الموجي الطويل، قابلة للضبط في نطاق الطول الموجي بين λ = 1.13 و 5.9 Å (نطاق الطاقة بين E = 2.1 و 11 keV). من خلال العمل في بيئة عالية الفراغ14، يتم التخلص من امتصاص الهواء وتشتته، وبالتالي تعزيز كفاءة تجارب الحيود ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. وتحيط محطة نهاية فراغية كبيرة بجميع مكونات بيئة العينة، بما في ذلك كاشف بيلاتوس 12M شبه الأسطواني، ومقياس goniometer متعدد المحاور، وأنظمة العرض والتجميع عبر الإنترنت، فضلا عن المعدات المخصصة لنقل العينات وتخزينها (الشكل 2). تم تحسين كل قطعة من المعدات لضمان إمكانية جمع أفضل بيانات الطول الموجي الطويل جودة. يمكن لكاشف Pilatus 12M المنحني أن يتجمع إلى زوايا حيود تبلغ 2θ = ±100 درجة ، مما يؤدي إلى بيانات حيود عالية الدقة بما فيه الكفاية حتى في أطول الأطوال الموجية (الشكل 1 ، أسفل). تم اختيار وحدات الكشف البالغ عددها 120 وحدة خصيصا للتوافق مع الطاقة المنخفضة وتم توفير المعايرة لوضع كسب إضافي فائق الارتفاع.

أدنى عتبة كاشف ممكنة هي 1.8 كيلو فولت ، مما يؤدي إلى زيادة تأثيرات الزاوية والحافة للطاقات الأقل من 3.6 كيلو فولت ويمكن ملاحظة جودة البيانات المعرضة للخطر عند أطول الأطوال الموجية ، خاصة بالنسبة لبلورات الفسيفساء المنخفضة. يجب أن يؤخذ هذا التأثير بالاقتران مع انخفاض الكفاءة الكمومية للكاشف15 في الاعتبار عند التخطيط للتجربة. يتيح مقياس goniometer متعدد المحاور إعادة توجيه البلورات للسماح باستراتيجيات جمع البيانات التي تزيد من جودة وقوة الإشارة الشاذة ، بالإضافة إلى اكتمال البيانات الشاذة التي تم جمعها. امتصاص العينة هو عامل مقيد للتجارب، وخاصة في أطول الأطوال الموجية. تعمل تصحيحات الامتصاص ، كما تم تنفيذها في حزم برامج معالجة MX شائعة الاستخدام 16,17 ، بشكل جيد إلى أطوال موجية حول 3 Å. وستتطلب الأطوال الموجية الأطول تصحيحات امتصاص تحليلية تستند إلى عمليات إعادة البناء المقطعي18 أو الاستئصال بالليزر لإزالة المواد غير المنحرفة وقطع البلورات إلى أشكال محددة جيدا19. وسيساعد هذا الأخير أيضا في تقليل حجم البلورات الأكبر حجما لأن تجارب حيود الأشعة السينية بأطوال موجية أطول تكون أكثر كفاءة للبلورات الأصغر14. يتم التعامل مع التحدي المتمثل في الاحتفاظ بالعينات في درجات حرارة مبردة أثناء جمع البيانات عن طريق التبريد الموصل ، حيث أن استخدام أجهزة تيار الغاز البارد مفتوحة التدفق لا يتوافق مع بيئة التفريغ. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مواد موصلة حراريا ، مثل النحاس ، لتوصيل العينة بمبرد تبريد أنبوب النبض. إن دبابيس SPINE القياسية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المستخدمة في جميع أنحاء MX ، بالإضافة إلى أي حوامل عينات أخرى متاحة تجاريا ، ليست مناسبة ل MX ذات الطول الموجي الطويل في الفراغ بسبب ضعف الموصلية الحرارية.

يجب أن تكون حاملات العينات (SHs) ل MX في الفراغ جزءا أساسيا من المسار الحراري لإزالة الحرارة (الشكل 3A). وعلى هذا النحو، فإنها تتكون من جسم ودبوس نحاسي موصل حراريا وتشمل ميزتين مهمتين: قاعدة مغناطيسية قوية لضمان وجود رابط حراري كاف لرأس مقياس التونيو البارد، وحامل عينة، مصنوع من البوليميد، لتقليل امتصاص الأشعة السينية وتشتتها20. وبذلت جهود لضمان أن تكون تجربة المستخدم في حصاد البلورات والتبريد الفلاش متطابقة تقريبا مع تلك المرتبطة بممارسات MX القياسية. نظرا لأن I23 SHs المخصصة غير متوافقة بشكل مباشر مع خطوط شعاع السنكروترون الأخرى ، يتم استخدام محول من الفولاذ المقاوم للصدأ للتوافق مع العصي المغناطيسية التي تحصد الكريستال وواجهات goniometer الحالية على خطوط شعاع MX الأخرى (الشكل 3B). يعد المحول مهما أيضا للاستفادة من مرافق التشغيل الآلي على خطوط الحزم الأخرى من Diamond MX ، والتي تستند إلى رؤوس القابض الآلي من نوع ALS21 وتخطيطات القاعدة على غرار unipuck22 ، إذا كان اختلاف العينة يتطلب فحصا مسبقا سريعا لاختيار أفضل البلورات المنحرفة. يمكن تقسيم بروتوكول إعداد العينة وتحميلها إلى مرحلتين:

المرحلة 1: حصاد البلورات والتجميد السريع الذي يقوم به المستخدمون في مختبراتهم الخاصة

بعد تقييم مدى ملاءمة المشروع لجمع بيانات I23 ، يتم إرسال حاملي العينات الذين لديهم حلقات مطابقة لأحجام البلورات (مجمعة مسبقا مع المحولات) إلى مختبرات المستخدم لحصاد الكريستال. لمنع أي ضرر ، لا ينبغي فصل SHs والمحولات ويجب استخدامها كوحدة واحدة لغرض صيد البلورات ذات الحلقات ذات الحجم المناسب باستخدام عصي مغناطيسية قياسية لحصاد الكريستال. كما هو شائع في MX ، يتم تنفيذ هذه المهمة يدويا تحت المجهر ، ويتم تبريد البلورات على الفور في dewar رغوة مع النيتروجين السائل 23. بسبب عدم تطابق القوى المغناطيسية ، فإن SHs غير متوافقة حاليا مع unipucks. ويتحقق التخزين والشحن باستخدام أجهزة التجميع (انظر جدول المواد)، التي تكون متاحة للمستخدمين عند الطلب، إلى جانب إدراج الشاحن الجاف المتوافق (الشكل 3 جيم). تشترك هذه الكرات في نفس اللوحة الأساسية مع unipucks المستخدمة على نطاق واسع وتسمح بالفحص المسبق السريع للعينات في خطوط شعاع Diamond MX الأخرى. يعد إعارة هذه المعدات للمستخدمين حاليا أفضل ترتيب ، حتى يتوفر حاملو العينات حسب الطلب تجاريا. يتطلب النقل إلى خط الشعاع الشاحنين الجاف القياسي المستخدم في مجتمع MX.

المرحلة 2: نقل العينات المبردة بالتبريد إلى محطة نهاية التفريغ

بمجرد وصول العينات إلى خط الشعاع ، يتم إعدادها لنقلها إلى المحطة الطرفية للفراغ. وهذا ينطوي على إزالة SHs من combipucks والفصل من المحولات. يتم إدخال العينات البيولوجية إلى الفراغ بشكل روتيني في مجال المجهر الإلكتروني المبرد. تم تكييف بعض المفاهيم الراسخة لنقل عينات I23. باختصار ، يتم نقل SHs تحت النيتروجين السائل إلى كتل النقل (الشكل 3D). تتمتع هذه الكتل بموصلية حرارية ممتازة وكتلة حرارية كبيرة ، مما يمنع البلورات من الوصول إلى درجة حرارة التزجج عندما تكون في فراغ. يتم تحميل ما يصل إلى أربع كتل ، بسعة أربع عينات لكل منها ، تحت النيتروجين السائل في عفريت كتلة (الشكل 3H) ، والذي يستخدم إما لنقل العينات إلى نظام النقل المبرد (CTS) أو للتخزين في dewars النيتروجين السائل بين التجارب.

ويتألف نظام النقل المبرد الذي تم تطويره في مصدر ضوء الماس من تجميعين فرعيين، هما محطة العينات والمكوك (الشكل 4 ألف). تتكون محطة العينات من حمام نيتروجين سائل للتخزين المؤقت لبلورات البروتين ولها ميزات محددة لضمان السلامة والسماح بتجربة سهلة الاستخدام (الشكل 5). يتم التحكم في CTS بواسطة وحدة تحكم منطقية قابلة للبرمجة عبر واجهة شاشة تعمل باللمس سهلة الاستخدام. تحتوي محطة العينات على صمامات ثنائية باعثة للضوء مدمجة للحصول على تصور أفضل ومجموعة من السخانات التي يتم التحكم فيها في حلقة مغلقة لأتمتة تجفيف حمام النيتروجين السائل بمجرد نقل العينات. كما أن لديها مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار لضمان السلامة والأداء الفعال للنظام. تحتوي محطة العينات على أجهزة مخصصة لتوفير واجهة كهربائية موثوقة للتفاعل مع المكوك للعمليات ، مثل الضخ إلى فراغ خشن لنقل العينات ، بالإضافة إلى مراقبة مستويات النيتروجين السائل ودرجة الحرارة داخل المكوك.

المكوك (الشكل 6) هو جهاز محمول يستخدم لالتقاط كتلة نقل من حمام النيتروجين السائل في محطة العينات ونقلها داخل بيئة مبردة وفراغية إلى المحطة النهائية. ويشمل ديوار النيتروجين السائل للحفاظ على العينات باردة أثناء النقل ، ومراقبة مستوى السائل في dewar ، ومجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار للتشغيل وسلامة المستخدم. تم تجهيز ذراع النقل بمحرك مغناطيسي ويتضمن أخاديد آلية لتوجيه المستخدمين في تحميل وتفريغ كتل النقل بأمان في المحطة النهائية. يتم النقل من المكوك إلى وعاء التفريغ عبر قفل الهواء. القفل الهوائي هو واجهة للمكوك على المحطة النهائية تستخدم لإخلاء الفضاء البيني بين المكوك والمحطة النهائية ، قبل فتح صمامات تفريغ المكوك والمحطة النهائية. تسلسلات الضخ والتنفيس مؤتمتة بالكامل ويمكن تشغيلها عبر شاشة كبيرة تعمل باللمس مع واجهة سهلة الاستخدام (الشكل 4C). يستخدم البروتوكول الحالي لنقل بلورة الثوماتين إلى محطة نهاية الفراغ لجمع البيانات.

Protocol

1. حصاد الكريستال

ملاحظة: استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة: النظارات الواقية والقفازات، حيثما أمكن ذلك.

  1. بعد وصول SHs إلى مختبر المستخدم في combipucks (الشكل 3C) ، افصل الغطاء عن قاعدة الكومبيبوك بحيث تظل SHs متصلة بالقاعدة ، ويتم الاحتفاظ بالقوارير في الغطاء.
  2. اغمر الغطاء بقوارير في النيتروجين السائل. قم بتوصيل محول SH + (الشكل 3B ، على اليمين) بعصا مغناطيسية ، وحصاد بلورات كالمعتاد.
  3. قم بتبريد كل عينة مباشرة في الكومبيبوك ، مع ملاحظة موضع العينة. لإغلاق العفريت ، استخدم عصا عفريت لتوصيل القاعدة بالغطاء.
  4. انقل الكومبيبوك من النيتروجين السائل إلى الشاحن الجاف أو ديوار تخزين النيتروجين السائل. شحن الشاحن الجاف إلى دايموند (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).

2. نقل العينات إلى فراغ

  1. تحميل SH من combipuck إلى كتلة النقل
    1. ضع قاعدة عفريت الكتلة (الشكل 3H) المملوءة بالفعل بكتل نقل فارغة (الشكل 3D) على قاعدة الدعم الخاصة بها داخل النيتروجين السائل في حاوية رغوية (الشكل 3J-b).
      ملاحظة: اتجاه كتل النقل مهم لدقة نقل العينات داخل وعاء التفريغ. على هذا النحو ، يجب وضع الكتل على قاعدة عفريت الكتلة للتأكد من أن الدبوس المميز بسهم في الشكل 3D على يسار الكتلة.
    2. ضع عفريت القارورة في حاوية الرغوة المملوءة بالنيتروجين السائل ، مع التأكد من تثبيت قاعدة العفريت على الحامل المغناطيسي داخل حاوية الرغوة (الشكل 3J-a).
    3. قم بتبريد جميع الأدوات اللازمة مسبقا في النيتروجين السائل. استخدم أداة فاصل العفريت الموضحة في الشكل 3G على الإعداد العالي H لفصل الغطاء عن القاعدة ، بحيث تظل القاعدة متصلة بالحامل المغناطيسي وتتعرض SHs داخل النيتروجين السائل.
    4. لإزالة كل SH من المحول الخاص به ، استخدم عصا الفاصل (الشكل 3F) لالتقاط SH من قاعدة combipuck ، ووضعها في الموضع المناسب لكتلة النقل في الوضع الأفقي للدوار في الشكل 3J-b.
      1. ضع عصا الفاصل فوق محول SH + إلى أقصى حد ممكن ، مع التأكد من أن العصا عمودية ، لتجنب لمس العينة.
      2. حرك الذراع الصغيرة الموجودة على عصا الفاصل لأسفل باستخدام الإبهام حتى ينقر ، لتأمين SH من الداخل وسحب SH من المحول.
      3. اخفض الفاصل فوق موضع الكتلة المطلوب، مع التأكد من أن أحد الشقوق الثلاثة يتناسب مع الفتحة المركزية للكتلة.
      4. حرر SH عن طريق تحريك الرافعة احتياطيا. كرر هذه الخطوات لكل SH.
    5. لتحميل العينات في كتلة العينة التالية، استخدم أداة المفتاح الدوار (الشكل 3E) لتدوير كتلة فارغة في الموضع الأفقي.
    6. قم بتوصيل أداة فاصل العفريت الموضحة في الشكل 3G باستخدام الإعداد المنخفض L بغطاء عفريت الكتلة عن طريق الشد في اتجاه عقارب الساعة.
    7. بمجرد نقل جميع SHs ، لإغلاق عفريت الكتلة ، ضع الغطاء في النيتروجين السائل وانتظر حتى تتوازن درجة الحرارة ، ثم قم بتركيب الغطاء فوق القاعدة كما في الشكل 3I. مع توصيل أداة الفصل، ارفعها برفق للتحرر من الدوار.
    8. في هذه المرحلة ، يمكن نقل عفريت الكتلة إلى CTS (الشكل 4B) أو إلى dewar تخزين النيتروجين السائل.
  2. تحميل كتل النقل في وعاء التفريغ
    1. تأكد من أن المكوك متصل بشكل آمن بالمحطة. افتح صمامات غاز النيتروجين والهواء ، وتأكد من تدفق الغازات. قم بتشغيل CTS.
    2. إذا لم تظهر أي رسائل تحذير على الشاشة ، فتابع تبريد كل من الحمام والمكوك بالنيتروجين السائل. ضع القمع المرفق في منفذ التعبئة على المكوك ، وصب النيتروجين السائل ببطء في القمع أثناء مراقبة المستوى على الشاشة. توقف عندما يتحول المؤشر من الأحمر إلى الأزرق.
      ملاحظة: يكون المكوك جاهزا للاستخدام عندما تكون درجة حرارة المقعد البارد المعروض على الشاشة التي تعمل باللمس أقل من 100 كلفن. يمكن ملء حمام محطة العينات في وقت واحد باستخدام القمع الصحيح إلى المستوى المحدد على جدار الحمام أو 100٪ على شاشة مستوى النيتروجين السائل. يجب مراقبة مستويات النيتروجين السائل وأجهزة استشعار درجة الحرارة باستمرار طوال فترة التشغيل ؛ ستكون هناك حاجة إلى العديد من عمليات التعبئة.
    3. بمجرد أن تكون درجة حرارة المقعد البارد للمكوك أقل من 100 كلفن واستقرار مستويات النيتروجين السائل في المكوك والحمام ، قم بنقل عفريت كتلة من النيتروجين السائل إلى حمام CTS باستخدام أداة فاصل العفريت المرفقة. قم بإزالة غطاء عفريت الكتلة ، وأغلق غطاء حمام CTS.
    4. لإدخال كتلة في المكوك، افتح صمام CTS، إن لم يكن مفتوحا بالفعل، عن طريق الضغط على زر فتح صمام المكوك على الشاشة. افتح مقبض المكوك عن طريق تدوير 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة ، ودفعه نحو الحمام بحيث يفرض المسار الموجه على المقبض المسار الصحيح للسفر نحو الحمام. بمجرد أن يصبح غطاء الكتلة مرئيا داخل الحمام ، اترك الغطاء ليبرد. بعد توقف فقاعات النيتروجين السائل حول الغطاء ، تقدم إلى كتلة النقل.
    5. لقفل كتلة النقل على المكوك، قم بتدوير المقبض بزاوية 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة.
    6. اسحب المقبض إلى الوضع الخلفي الأصلي ، ثم "قفله" في مكانه عن طريق تدوير 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة.
    7. اضغط على إغلاق صمام ومضخة المكوك على شاشة العرض لبدء إخلاء المكوك.
    8. بمجرد عرض الرسالة Shuttle الجاهزة للفصل على الشاشة التي تعمل باللمس ، اضغط على الذراع أسفل المكوك ، وارفعها بعناية باستخدام المقبض الموجود في الأعلى.
    9. احمل المكوك إلى قفل الهواء على المحطة الطرفية للفراغ في وضع مستقيم.
    10. قم بتوصيل المكوك بقفل الهواء في المحطة الطرفية للفراغ.
      ملاحظة: بمجرد توصيلها بشكل آمن، ستؤكد الشاشة التي تعمل باللمس في المحطة الطرفية حالة المكوك والتشابك.
    11. حدد موضع كتلة فارغة داخل الوعاء عن طريق الضغط على الزر المقابل على الشاشة التي تعمل باللمس ونقل فندق العينة إلى موضع التحميل الصحيح.
    12. بمجرد أن يصبح الفندق النموذجي في موضعه ، سيصبح الزر " فتح" نشطا. اضغط على هذا الزر لبدء تسلسل التعشيق الفراغي.
      ملاحظة: ستبدأ المضخة، وسيتم عرض التقدم المحرز على الشاشة. قد يستغرق هذا ما يصل إلى دقيقتين لإكماله.
    13. بعد اكتمال التسلسل ، ستتغير الحالة إلى Airlock مفتوح ، ويتم النقل قيد التقدم. قم بلف المقبض 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة لفتح القضيب ، وادفع القضيب برفق إلى الوعاء بحيث يفرض المسار الموجه مرة أخرى المسار الصحيح للسفر نحو موقع الفندق النموذجي. باستخدام موجز الفيديو المعروض على الشاشة للإرشاد ، أدخل الكتلة ببطء في الفندق ، مما يضمن تنشيط ضوء موضع الكتلة على شاشة اللمس. بمجرد تنشيطه ، قم بتدوير المقبض 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة لتحرير الكتلة ، واسحب القضيب من الوعاء. بمجرد التراجع الكامل ، قم بتدوير المقبض 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة لقفل القضيب.
    14. بمجرد قفل القضيب ، سيصبح زر الإغلاق نشطا. اضغط على هذا لإغلاق صمام تفريغ المحطة النهائية ، وتنفيس المسافة بين المكوك والسفينة إلى الضغط الجوي ، في انتظار ما يصل إلى 20 ثانية للاكتمال.
    15. انتظر حتى تظهر الشاشة الحالة على ما يرام لإزالة المكوك بمجرد اكتمال التسلسل. عند هذه النقطة، قم بإزالة المكوك، والعودة إلى CTS لتكرار العملية للكتلة التالية.
    16. لإعداد الكتلة التالية للنقل ، قم بتدوير عفريت الكتلة داخل الحمام. ادفع مفتاح الدوران المدمج في الجزء العلوي من غطاء الأكريليك لأسفل في القفل الموجود في وسط عفريت الكتلة. أثناء الضغط عليه لأسفل، أدر المفتاح لوضع الكتلة المطلوبة في وضع الالتقاط.
    17. بمجرد نقل جميع الكتل ، تأكد من فتح صمام المكوك أثناء تثبيته على CTS. اضغط على زر الخبز على الشاشة التي تعمل باللمس ، وحدد كل من الحمام والمكوك ، ثم اضغط على خبز.
      ملاحظة: يؤدي ذلك إلى تسخين كل من المكوك والحمام لغلي النيتروجين السائل وبالتالي تبخير أي ثلج / تكثيف متراكم قبل الاستخدام التالي. بمجرد بدء الخبز ، يمكن إيقاف تشغيل الغاز والهواء.

Representative Results

تم إدخال بلورة ثوماتين إلى محطة نهاية الفراغ باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه. تم جمع بيانات الحيود عند طول موجي قدره 2.7552 Å (E = 4500 eV) كصور 3600 مع زيادة دوران قدرها 0.1 درجة وتعريض 0.1 ثانية لكل صورة. تم تعديل حجم الحزمة إلى 150 ميكرومتر × 150 ميكرومتر وخفضت إلى 10٪ من الإرسال ، مع قياس تدفق مقابل قدره 7.1 × 109 فوتونات / ثانية. يعتمد اختيار λ = 2.7552 Å على حل وسط بين الزيادة في تأثيرات الإشارة الشاذة وامتصاص العينات وانخفاض الدقة إلى أطوال موجية أطول. على الرغم من أنها ليست قريبة من حافة الامتصاص النظري للكبريت (λ = 5.0095 Å) ، عند هذا الطول الموجي ، فإن المساهمة الوهمية في عامل تشتت الكبريت f" هي 1.57 e- ، وهو عامل 1.6-2.1 أكبر مقارنة بالأطوال الموجية بين 1.7 و 2 Å. تسمح الإشارات الشاذة الأقوى الناتجة عن ذلك بمراحل S-SAD الناجحة للمشاريع الأكثر تحديا.

وقد أجريت بالفعل مجموعة متنوعة من التجارب المرحلية الصعبة على خط الشعاع I2324,25,26,27 ، مع البيانات التي تم جمعها عند هذا الطول الموجي. في حين أن التدرج بواسطة S-SAD ممكن باستخدام أطوال موجية أقصر بكثير ، إلا أن هذا يتطلب في كثير من الأحيان بناء إشارة شاذة من خلال دمج البيانات من العديد من البلورات متساوية الشكل للوصول إلى قيم متعددة أكثر من 10028. نظرا للإشارة الشاذة المحسنة عند الأطوال الموجية الأطول ، فإن معظم مشاريع التدرج التي تم حلها على I23 تتطلب فقط بيانات من بلورة واحدة. تظهر صورة حيود تمثيلية في الشكل 7، إلى اليسار. أنتجت معالجة البيانات باستخدام Xia2-3dii29 إحصاءات دمج ممتازة ، على النحو المبين في الجدول 1. يوضح الشكل 7 ، إلى اليمين ، جزءا من صورة حيود تمثيلية من مجموعة بيانات الثوماتين ويوضح الخلفية المنخفضة المحيطة بانعكاسات براغ ، مما يساهم في قيم I/σ (I) الكبيرة التي لوحظت عادة في إعداد الفراغ ، مما يضمن وصول الأشعة السينية المتناثرة بواسطة العينة فقط إلى الكاشف.

يرجع الحد الأقصى للدقة القابلة للتحقيق البالغ 1.8 Å إلى هندسة الكاشف والطول الموجي المختار لإشعاع الأشعة السينية. أسفرت مجموعة البيانات عن إشارة شاذة قوية للغاية ، تنعكس في منتصف ميل معلمة الاحتمال الطبيعي الشاذ البالغة 2.677 ، مما يسهل حل الهيكل بواسطة خط أنابيب التدرج التلقائي CRANK2. مكنت الجودة العالية لخريطة كثافة الإلكترون الناتجة من بناء نموذج أوتوماتيكي ناجح بواسطة وحدة Buccaneer30 داخل CRANK231 ، مع وضع صحيح ل 100٪ من تسلسل الأحماض الأمينية للثاوماتين. تكشف خريطة فورييه للفرق الشاذ المرحلي ، المحسوبة باستخدام ANODE11 ، عن 16 ذرة كبريت جيدة الترتيب وذرة كبريت واحدة من Cys159 مع تشكيلين بديلين ، كما هو مؤكد من خلال 18 ارتفاعا كبيرا للقمم في مواقع المبعثرات الشاذة في الجدول 2. تشكل بقايا السيستين ال 16 داخل الثوماتين 8 جسور ثاني كبريتيد ، وكلها مرئية بوضوح في خريطة 2Fo-Fc (الشكل 8).

Figure 1
الشكل 1: بيانات حيود عالية الدقة من تجارب MX ذات الطول الموجي الطويل. (أ) قيم مخطط f" مقابل الطاقة، مع الإشارة إلى حواف امتصاص العناصر الضوئية التي يمكن الوصول إليها على خط الشعاع I23. (ب) أقصى دقة يمكن تحقيقها في زوايا كاشف P12M مقابل الطاقة. اختصار: MX = علم البلورات الجزيئي الكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقطع أفقي من خلال وعاء التفريغ مع جميع مكونات المحطة النهائية. اختصار: OAV = نظام عرض على المحور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أدوات مناولة العينات . (A) I23 حامل العينة. (B) دبوس MX القياسي للعمود الفقري (يسار) بجوار حامل عينة I23 مع محول (يمين). (C) غطاء وقاعدة كومبيبوك مع حاملات عينات I23 (أزرق). كتلة غطاء عفريت وقاعدة مع كتلتين نقل (ذهبي). قصب الشاحن الجاف ، المتوافق مع كل من الكومبيبوك والكرات كتلة ، مرئي في الخلف. (د) كتلة نقل مع أربعة حاملي عينات I23. (ه) الأداة الرئيسية المستخدمة لتدوير قاعدة عفريت الكتلة. (و) عصا الفاصل. (G) أداة فاصل Puck مع سهمين يظهران الإعدادات العالية والمنخفضة. (ح) قاعدة عفريت كتلة مع أربع كتل Cu فارغة. (I) غطاء لعفريت كتلة. (ي) حاوية رغوة مع جميع الأدوات اللازمة لنقل حاملي العينات من قواعد كومبيبوك إلى كتل النحاس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نظام النقل المبرد. (أ) محطة عينة CTS مع مكوك مرفق ومسارات التحويل المستخدمة للتعبئة. (ب ) عفريت كتلة مع كتلتي نقل موضوعتين داخل شاشة اللمس الخاصة ببرنامج التحكم CTS. (C) CTS. اختصار: CTS = نظام النقل بالتبريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: محطة عينات نظام النقل المبردة. الاختصارات: مصابيح LED = الثنائيات الباعثة للضوء. LN2 = النيتروجين السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مكوك نظام النقل المبرد. الاختصارات: مصابيح LED = الثنائيات الباعثة للضوء. LN2 = النيتروجين السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: صور الحيود على اليسار، صورة حيود من مجموعة البيانات التي تم جمعها على بلورة الثوماتين. على اليمين، بقعة حيود محاطة بوحدات بكسل خلفية منخفضة العدد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: حل هيكل Thaumatin مع خط أنابيب أوتوماتيكي CRANK2 (الإعدادات الافتراضية ، لا يوجد صقل لاحق). (A) نظرة عامة على thaumatin مع خريطة 2Fo-Fc عند 1.6σ (أزرق) وفرق شاذ مرحلي خريطة فورييه عند 5σ محسوبة في ANODE (أخضر). (ب) نظرة عامة على الثاوماتين تبين فقط الفرق الشاذ المرحلي خريطة فورييه عند 5σ. (ج) منظر عن قرب لجسر ثاني كبريتيد موجود في ثوماتين مع خريطة 2Fo-Fc عند 1.6σ (أزرق) واختلاف شاذ مرحلي خريطة فورييه عند 5σ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم ثوماتين
الطول الموجي لجمع البيانات (Å) (الطاقة (eV)) 2.7552 (4500)
عدد الصور × حجم الوتد (°) 3600 × 0.1
سبيس جروب ص 41212
ثوابت خلية الوحدة
(أ = ب، ج) (Å) 57.8, 150.2
(α = β = γ) (°) 90
القرار (Å) 150.22–1.80 (1.84–1.80)
اكتمال 96.3 (81.1)
إيسا 36.48
رمياس 0.042 (0.118)
ربيم 0.01 (0.049)
CC1/2 1 (0.989)
I/σ(I) 57.9 (14.7)
تعدد 15.0 (5.4)
منتصف المنحدر 2.677

الجدول 1: إحصاءات جمع البيانات وتجهيزها للثوماتين عند الطول الموجي 2.755 Å عند خط الشعاع I23, DLS. بالنسبة للدقة والاكتمال و Rmerge و Rmeas و Rpim و CC1/2 و I/σ(I) والتعدد، يتم عرض الأصداف عالية الدقة بين قوسين. اختصار: DLS = مصدر ضوء الماس.

أقرب ذرة ذروة الارتفاع (سيغما)
CYS9 25.83
CYS56 25.03
MET112 24.54
CYS149 24.37
CYS126 24.21
CYS145 24.2
CYS134 23.6
CYS177 23.48
CYS204 23.43
CYS66 23.17
CYS164 22.54
CYS193 22.15
CYS158 21.51
CYS77 21.21
CYS121 20.8
CYS71 19.17
CYS159_1 12.27
CYS159_2 8.34

الجدول 2: الفرق الشاذ ارتفاع ذروة خريطة فورييه كما تم حسابه بواسطة ANODE باستخدام النموذج المرحلي والمبني تلقائيا من CRANK2.

Discussion

تم تطوير البروتوكول الحالي للامتثال لمتطلبات إعداد العينات لتجارب MX ذات الطول الموجي الطويل في الفراغ على خط الشعاع I23. وقد تم استخدامه على خط الشعاع خلال العام الماضي وساهم في الانتهاء بنجاح من مشاريع متعددة. وكما هو مبين في النتائج المعروضة هنا، يتيح البروتوكول نقلا آمنا وموثوقا به للعينات إلى المحطة النهائية للتفريغ مع الحفاظ على جودة حيود العين. وهو جانب هام لتشغيل خط الشعاع وسيرافقه تدريب شخصي للمستعملين من قبل موظفي خط الشعاع. وتجدر الإشارة إلى بعض الخطوات باعتبارها حاسمة الأهمية لإنجاز الإجراء بنجاح وأمان: فنقل العينات من قواعد التجميع إلى كتل العينات يتطلب الدقة والاهتمام لتجنب إتلاف العينات (انظر الخطوة 2-1-4)؛ ونقل العينات من قواعد التجميع إلى كتل العينات يتطلب دقة واهتماما لتجنب إتلاف العينات (انظر الخطوة 2-1-4)؛ ونقل العينات من قواعد التجميع إلى كتل العينات يتطلب دقة واهتماما لتجنب إتلاف العينات (انظر الخطوة 2-1-4)؛ ونقل العينات من قواعد التجميع إلى كتل العينات يتطلب دقة واهتماما لتجنب إتلاف العينات (انظر الخطوة 2-1-4)؛ ونقل العينات من قواعد التجميع إلى كتل العينات يتطلب دقة واهتماما لتجنب إتلاف العينات (انظر الخطوة 2- رصد مستوى النيتروجين السائل في جميع المراحل مهم لمنع تعرض العينات للهواء أو الاتصال الوثيق بالأجزاء التي لا يتم تبريدها بشكل صحيح (2.1.3 و 2.2.2) ؛ الانتظار حتى يتم الانتهاء تماما من تسلسل الإغلاق (2.2.14) ، قبل إزالة المكوك من المحطة النهائية (2.2.15) ، لتجنب تدهور فراغ المحطة النهائية.

بدأ تصور البروتوكول جنبا إلى جنب مع جهد هندسي يهدف إلى تطوير معدات مصممة لهذا الغرض لنقل بلورات البروتين إلى بيئة الفراغ. وكانت المنتجات النهائية لهذا المشروع هي CTS وأدوات مناولة العينات المرتبطة بها الموضحة أعلاه. يعد CTS تحسنا كبيرا عن سابقه ، Leica EM VCT10014 ، ويزيل قيودا متعددة ، مثل عدم وجود حماية للعينات وبيئة فراغ أثناء النقل ، وتراكم الجليد داخل حمام النيتروجين السائل ، وغياب واجهة مستخدم بديهية وميزات السلامة. الميزات الإضافية ل CTS التي تعمل على تحسين تجربة المستخدم هي مراقبة درجة الحرارة ومستوى النيتروجين السائل داخل المكوك ومحطة العينات ، وحمام بسعة أكبر يستوعب أربع كتل في وقت واحد ، بدلا من واحد ، وآلية ذاتية التوجيه لتشغيل المكوك. تم دمج CTS بالكامل في نظام التحكم في خط الشعاع مع واجهة شاشة تعمل باللمس سهلة الاستخدام وتعزيز الفراغ والسلامة الميكانيكية عند التفاعل مع المحطة النهائية.

Beamline I23 هو أول أداة سنكروترون MX طويلة الطول الموجي من نوعها ، وعلى هذا النحو ، فإن إدخال بلورات البروتين إلى بيئة عالية الفراغ وتخزينها في درجات حرارة مبردة ، قد تطلب جهودا كبيرة. وتتواصل حاليا إدخال تحسينات على أدوات وبروتوكول إعداد العينات، فضلا عن الجهود الرامية إلى تبسيط العمليات. كجزء من دعم المستخدم ، يتوفر موظفو beamline دائما للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ومن الأمثلة على أحد هذه السيناريوهات المسائل التي تعرض سلامة نظام التفريغ للخطر، مما يؤدي إلى صعوبات في توصيل المكوك أو إزالته من/إلى جهاز CTS أو القفل الهوائي للمحطة الطرفية. يتم إجراء مستويات مختلفة من الاختبارات على أساس أسبوعي ويومي ، وسيغطي تدريب المستخدم فحوصات إضافية لتجنب الإخفاقات المحتملة ، مثل الفحص البصري لحلقات O على الواجهات التي يعلق عليها المكوك. في حين أن بيئة الفراغ تفتح الفرصة لإجراء تجارب الحيود في نطاق الطول الموجي الذي لا يمكن الوصول إليه في خطوط الحزم الأخرى ، فإن خطوة النقل الإضافية تقلل من الإنتاجية الإجمالية للعينة.

النقل اليدوي مع أربع عينات فقط لكل كتلة نقل وما يصل إلى خمس كتل داخل وعاء التفريغ يحد من السعة الإجمالية إلى 20 عينة. ومن ثم، بالنسبة للمشاريع التي تحتوي على عينة كبيرة إلى تباين العينات، ينبغي فحص العينات مسبقا عند خطوط الحزم عالية الإنتاجية من دايموند، ومن ثم ينبغي نقل العينات الواعدة فقط لتجربة الطول الموجي الطويل المحسنة اللاحقة. في حين أن حاملي العينات وكتل النقل لم تتغير عن إدخالها الأولي قبل بضع سنوات ، فإن أدوات المناولة المعروضة هنا كلها تطورات جديدة. حاملات العينات المخصصة I23 غير قابلة للتغيير بسبب دورها في مفهوم التبريد لخط الحزمة. وعلى هذا النحو، يهدف تصميم أدوات مناولة العينات إلى إنشاء صلة بين هذا النوع الجديد من الحوامل والأدوات القياسية المتاحة تجاريا التي اعتمدها مجتمع مستخدمي MX لفترة طويلة، مثل الكومبوك، وصعوب حصاد الكريستال، ونظام النقل الجاف للشاحن. تضمن تصميمها مشاورات كبيرة مع مجتمع المستخدمين وتطلب عدة تكرارات لإكمالها. تمثل المعدات والأدوات والبروتوكول المعروض هنا نظاما بسيطا وقويا لنقل عينات المستخدم للتجارب في خط الشعاع I23 في Diamond Light Source. تفتح هذه الأداة لعلم البلورات الجزيئية الكبيرة طويل الطول الموجي في الفراغ فرصا جديدة للبيولوجيا الهيكلية.

Acknowledgments

نود أن نشكر آدم تايلور وآدم بريسكوت وكين جونز وأرفيندر بالاها وكيفن ويلكينسون على دعمهم في تطوير نظام نقل العينات المبردة (CTS). تم تمويل هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery (871037 المنحة) بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12M detector Dectris, Switzerland single-photon-counting X-ray detector
CombiPuck MiTeGen SKU: M-CBP-P1 Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples
Crystal-harvesting magnetic wand Molecular Dimensions MD7-411 Used for harvesting crystal
Dry Shipper (CX100) Molecular Dimensions MD7-21 Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples
Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) MiTeGen SKU: M-CBP-PTC1 Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples
Kapton polyimide sample mount made of Kapton polyimide
Perpsex lid acrylic lid with built-in rotation key
Thaumatin powder  Sigma-Aldrich T7638 Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).
  2. Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
  3. Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  4. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  5. Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).
  6. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).
  7. Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).
  8. Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
  9. Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).
  10. Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
  11. Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
  12. Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
  13. Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).
  14. Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).
  15. Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
  16. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  17. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  18. Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
  19. Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
  20. Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).
  21. Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
  22. The universal container project. , Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020).
  23. Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
  24. Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
  25. O'Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887 (2020).
  26. Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
  27. Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
  28. El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
  29. Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  30. Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
  31. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 170 ،
بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duman, R., Orr, C. M., Mykhaylyk,… More

Duman, R., Orr, C. M., Mykhaylyk, V., El Omari, K., Pocock, R., Grama, V., Wagner, A. Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (170), e62364, doi:10.3791/62364 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter