Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Zusammenfassung

Die Visualisierung des murinen Lungengewebes liefert wertvolle strukturelle und zelluläre Informationen über die darunter liegenden Atemwege und das Gefäßsystem. Die Erhaltung der Lungengefäße, die wirklich physiologische Bedingungen darstellt, stellt jedoch immer noch Herausforderungen dar. Darüber hinaus führt die empfindliche Konfiguration der murinen Lunge zu technischen Herausforderungen bei der Vorbereitung von Proben für qualitativ hochwertige Bilder, die sowohl die zelluläre Zusammensetzung als auch die Architektur bewahren. In ähnlicher Weise können zelluläre Kontraktilitätsassays durchgeführt werden, um das Potenzial von Zellen zu untersuchen, auf Vasokonstriktoren in vitrozu reagieren, aber diese Assays reproduzieren nicht die komplexe Umgebung der intakten Lunge. Im Gegensatz zu diesen technischen Fragestellungen kann die Precision-Cut Lung Slice (PCLS)-Methode als effiziente Alternative zur dreidimensionalen Visualisierung von Lungengewebe in drei Dimensionen ohne regionale Verzerrung eingesetzt werden und als Live-Surrogat-Kontraktilitätsmodell für bis zu 10 Tage dienen. Gewebe, das mit PCLS hergestellt wurde, hat Struktur und räumliche Orientierung bewahrt, was es ideal macht, um Krankheitsprozesse ex vivo zu untersuchen. Die Position von endogenen tdTomato-markierten Zellen in PCLS, die aus einem induzierbaren tdTomato-Reporter-Murinenmodell gewonnen wurden, kann durch konfokale Mikroskopie erfolgreich visualisiert werden. Nach der Exposition gegenüber Vasokonstriktoren zeigt PCLS die Erhaltung sowohl der Gefäßkontraktilität als auch der Lungenstruktur, die durch ein Zeitraffermodul erfasst werden kann. In Kombination mit den anderen Verfahren, wie der Western-Blot- und RNA-Analyse, kann PCLS zum umfassenden Verständnis von Signalkaskaden beitragen, die einer Vielzahl von Erkrankungen zugrunde liegen und zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen.

Einleitung

Fortschritte in der Präparation und Bildgebung von Lungengewebe, das zelluläre Komponenten bewahrt, ohne die anatomische Struktur zu beeinträchtigen, liefern ein detailliertes Verständnis von Lungenerkrankungen. Die Fähigkeit, Proteine, RNA und andere biologische Verbindungen unter Beibehaltung der physiologischen Struktur zu identifizieren, bietet wichtige Informationen über die räumliche Anordnung von Zellen, die das Verständnis der Pathophysiologie bei zahlreichen Lungenerkrankungen erweitern können. Diese detaillierten Bilder können zu einem besseren Verständnis von pulmonalen Gefäßerkrankungen wie der pulmonalen Arterienhypertonie führen, wenn sie auf Tiermodelle....

Protokoll

Die gesamte Tierpflege entsprach den Richtlinien des Boston Children's Hospital und den vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse sind Wildtyp C57/B6 Mäuse und Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato gekreuzte Mäuse.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereiten Sie die während des Experiments erforderliche Phosphatpufferlösung (1x PBS) und 2% ige Agaroselösung im Voraus vor.
   1. Mischen Sie 2 g Agarosepulver in 100 ml autoklaviertes Wasser. Erhitzen Sie es in der Mikrowelle einige Sekunden am Stück, bis die Lösung klar ist.
   2. Die Lösung bis zum Gebrauch in ein Wasserb....

Ergebnisse

Wenn es zu Zellen oder Gewebe hinzugefügt wird, wird das Lebensfähigkeitsreagenz durch die reduzierende Umgebung von lebensfähigem Gewebe modifiziert und färbt sich rosa / rot, wodurch es stark fluoreszierend wird. Die repräsentativen Farbveränderungen, die ab Tag 0-1 und Tag 9-10 festgestellt wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Wie bereits erwähnt, begann die Lösung blau und wurde über Nacht rosa, was die Lebensfähigkeit demonstrierte. Farbänderungen treten typischerweise innerhalb von.......

Diskussion

In diesem Manuskript wird eine verbesserte Methode zur Herstellung hochauflösender Bilder von murinem Lungengewebe beschrieben, die die Gefäßstruktur bewahrt und die experimentelle Flexibilität optimiert, insbesondere unter Verwendung der Anwendung von PCLS, um Mikroläuse aus Lungengewebe zu erhalten, die dreidimensional mit erhaltener Kontraktilität des Gefäßsystems betrachtet werden können. Unter Verwendung des Lebensfähigkeitsreagenzes zeigt das Protokoll, dass sorgfältig vorbereitete und konservierte Scheiben die Leb.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 ml fraktioniertes Heparin in der Spritze	BD	100 USP-Einheiten pro ml
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 Zoll Gauge Nadel mit stumpfem Ende für die Luftröhrenkanülierung	Cml Supply	90120050D
30cc Spritze	BD	309650
Anti Anti Lösung	Gibco	15240096
Automatisiertes Mikrotom mit vibrierender Klinge	Leica	VT1200S
Reagenz für die Zellviabilität (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Konfokal	Zeiss	880
Dulbecco' s Modified Eagle Medium und GLutaMAX, ergänzt mit 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mörser und Stößel	Amazon
RIPA Lyse- und Extraktionspuffer	Thermoscientific	89900
Chirurgisches Nahtmaterial 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagenz	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Geflügeltes Blutentnahmeset (Schmetterlingsnadel) 25-30G		25-30G

BD