Summary
我们开发了一种新颖的功能丧失方法，该方法涉及通过使用 卵 电穿孔和Tol2转座子系统将人工微RNA序列引入和基因组整合到鸡胚胎中。该技术为发育过程中的基因功能研究提供了一种强大而稳定的基因敲低方法。
Abstract
长期以来，小鸡视网膜一直是发育神经生物学中重要的模型系统，其优点包括体积大、发育迅速以及可视化和实验操作的可访问性。然而，其主要技术局限性是缺乏用于基因功能分析的强有力的功能丧失方法。该协议描述了一种在发育中的鸡视网膜中进行基因沉默的方法，该方法涉及通过使用Tol2转座子系统进行人工microRNA（miRNA）的转基因表达。在这种方法中，将包含EmGFP（翡翠绿色荧光蛋白）标记物表达盒和针对靶基因的人工前miRNA序列的Tol2转座子质粒引入胚胎小鸡视网膜中，并通过 卵内 电穿孔构建Tol2转座酶表达。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化从转座子载体中切除表达盒并将其整合到宿主染色体中，从而导致miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，我们已经证明，Nel（一种在神经发育中发挥多种功能的糖蛋白）的表达可以通过使用该技术在发育中的小鸡视网膜中显着抑制。我们的结果表明，这种方法诱导了对基因表达的稳定和强大的抑制，从而为视网膜发育的研究提供了一种有效的功能丧失方法。
Introduction
脊椎动物视网膜是研究神经发育的重要模型系统。尽管视网膜位于外围位置，但在解剖学和发育上是中枢神经系统的延伸，视神经由视网膜神经节细胞的轴突组成，代表中枢神经系统内的束。小鸡视网膜作为研究神经发育分子机制的模型系统具有显著优势：体型大，发育迅速;它与人类视网膜具有结构和功能相似性;它很容易用于可视化和实验操作。利用鸡视网膜广泛研究了神经发育过程中细胞增殖和分化、形态发生和轴突引导的分子机制。
在过去的二十年中，卵子电穿孔已成功用于将异位基因引入发育中的雏鸡胚胎中的细胞中。该技术允许标记发育中的细胞，细胞命运追踪，细胞迁移和轴突束的追踪，以及异位基因表达，用于基因功能的体内分析。卵内电穿孔在鸡胚胎中有效表达异位基因的条件已经确立1,2,3。
尽管有这些优点，但缺乏用于基因功能研究的稳定功能丧失技术一直是雏鸡胚胎的主要技术限制。虽然用小干扰RNA（siRNA）4或短发夹RNA（shRNA）5的表达载体电穿孔的鸡胚胎显示出靶基因的敲低，但这些方法中的基因抑制是短暂的，因为一旦细胞失去引入的RNA或DNA，这种影响就会消失。通过RCAS（R转换Competent A型肉瘤-白血病病毒（ASLV）长末端重复（LTR）与S板受体）逆转录病毒系统将siRNA递送到雏鸡胚胎中可以实现更稳定的基因抑制6。病毒载体整合到宿主基因组中，异位基因稳定表达。然而，逆转录病毒只能在细胞周期的有丝分裂（M）阶段整合到分裂细胞的基因组中，这可能会对可以应用这种功能丧失方法的发育阶段和/或细胞类型施加限制。此外，RCAS对转基因的表达似乎比卵电穿孔诱导的表达更慢且更不稳定7。
转座子是从基因组上的一个位置移动到另一个位置的遗传元件。Tol2元件是hAT转座元件家族的成员，包含一个编码转座酶的内部基因，该转座酶催化Tol2元件8的转座子反应。当携带基因表达盒的质粒载体被引入具有Tol2转座酶表达构建体的脊椎动物细胞中时，将携带基因表达盒的质粒载体，两侧是Tol2元件的左端和右端序列（分别为200 bp和150 bp），将表达盒从质粒中切除并整合到宿主基因组中，从而支持异位基因的稳定表达（图1).已经表明，Tol2转座元件可以非常有效地诱导不同脊椎动物物种的基因转位，包括斑马鱼9,10，青蛙11，小鸡12和小鼠13，因此是一种有用的转基因和插入诱变方法。Tol2转座子系统已成功用于通过从长双链RNA14加工的siRNA的基因组整合来条件敲低靶基因。
该协议描述了雏鸡胚胎中的功能丧失方法，该方法涉及通过Tol2转座子系统引入人工microRNA（miRNA）15,16。在这种方法中，将EmGFP（翡翠绿色荧光蛋白）标记物的表达盒和针对靶基因的人工miRNA克隆到Tol2转座子载体中。然后将Tol2转座子构建体通过卵电穿孔将Tol2转座酶表达构建体引入胚胎小鸡视网膜中。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化从转座子载体中切除表达盒并将其整合到宿主染色体中，从而导致miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，我们成功地敲低了Nel的表达，Nel是一种主要在神经系统中表达的细胞外糖蛋白，在发育中的小鸡视网膜中（见代表性结果）。我们的结果表明，通过该技术可以在卵中实现稳定有效的基因抑制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. miRNA表达载体的构建
注意：构建miRNA表达载体的程序（步骤1.1-1.3,1.5-1.6）针对miRNA表达试剂盒进行了优化，即带有EmGFP的Block-iT Pol II miR RNA表达试剂盒，如前所述15,16。该试剂盒提供了旨在允许miRNA表达的表达载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA）、对照载体（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA阴性对照质粒）、辅助试剂和生产miRNA表达载体的说明（参见材料表）17。
- 设计针对靶基因编码前miRNA的单链DNA寡核苷酸：使用在线工具RNAi Designer设计单链DNA寡核苷酸（“上链”寡核苷酸（靶前miRNA）和“底链”寡核苷酸（顶链寡核苷酸的补体））（见材料表）。有关单链寡核苷酸所需的特征（图2A）和靶序列示例（图2B），请参见图2。
注意：建议为给定的靶基因生成5-10个pre-miRNA序列，并在 体外 筛选敲低活性（步骤1.4）。 - 对上链和底链寡核苷酸进行退火以生成双链寡核苷酸
- 在无菌0.5 mL微量离心管中设置以下退火反应（表1）。
- 将反应混合物在95°C孵育4分钟。通过让反应混合物冷却至室温（RT）5-10分钟，对上链和底链寡核苷酸进行退火以生成双链寡核苷酸。短暂离心样品（~5秒）。
注意：退火的寡核苷酸可以在-20°C下储存至少一年而不会降解。
- 将双链寡核苷酸克隆到 miRNA 表达载体中（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA（在 miRNA 表达试剂盒中提供））：根据制造商手册17，将单个双链寡核苷酸克隆到线性化的 miRNA 表达载体中。
- 敲低效果评估
注意：建议在将单个miRNA序列应用于蛋之前，在体外测试其基因抑制效率。敲低效率可以通过将miRNA表达质粒转染到表达靶基因的细胞系中来测试。或者，可以将单个miRNA表达质粒共转染到具有靶基因表达构建体的细胞系中。对于编码未在其天然状态下膜锚定的蛋白质（例如，可溶性蛋白质）的靶基因，碱性磷酸酶（AP）融合蛋白可用于监测靶蛋白的表达。编码靶蛋白的cDNA序列可以在框架中融合到AP标签载体（APtag-1-APtag-5;参见材料表）中的人胎盘碱性磷酸酶并引入细胞18。当在培养细胞（例如HEK293T细胞）中表达时，AP标记的靶蛋白以高水平分泌到培养基中，因此可以通过测量miRNA转染细胞培养基中AP活性的降低来评估miRNA序列的敲低效应（子步骤1.4.1-1.4.4）。- HEK293T细胞在24孔板（8 x 104 细胞/孔）中培养过夜。用具有AP标记靶蛋白的表达质粒的单个miRNA表达构建体瞬时转染细胞。使用 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA 阴性质粒（在 miRNA 表达试剂盒中提供）作为对照。（如果使用稳定表达AP标记靶蛋白的细胞系，则仅使用单个miRNA表达构建体转染细胞。
注意：转染使用常规脂质转染试剂（见 材料表）。 - 转染后48-72小时收集条件培养基，并在65°C水浴中加热灭活内源性AP活性5分钟。在台式微量离心机中以最大速度旋转碎片5分钟。
- 用10mM HEPES，pH 7.0缓冲上清液，并将其通过0.45μm过滤器。
- 取 100 μL（用于在读板器中测量）或 500 μL（用于分光光度计）的上清液，并加入等量的 2x AP 底物缓冲液（表 2）。通过在读板器或分光光度计中测量OD405 来检查AP活性。
注意：如果条件培养基的AP活性太高而无法准确测量，请用HBAH缓冲液（Hanks平衡盐溶液（HBSS），0.5mg / mL牛血清白蛋白，20mM HEPES（pH 7.0））或其他含有载体蛋白的缓冲液稀释。不要使用含磷酸盐的缓冲液（例如PBS），因为无机磷酸盐是AP的竞争性抑制剂。
- HEK293T细胞在24孔板（8 x 104 细胞/孔）中培养过夜。用具有AP标记靶蛋白的表达质粒的单个miRNA表达构建体瞬时转染细胞。使用 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA 阴性质粒（在 miRNA 表达试剂盒中提供）作为对照。（如果使用稳定表达AP标记靶蛋白的细胞系，则仅使用单个miRNA表达构建体转染细胞。
- miRNA序列的链化
注意：敲低效果可以通过将不同的miRNA链向同一靶基因或重复相同的miRNA来增强。miRNA 表达载体支持多个前 miRNA 序列及其共顺反子表达的链17。- 根据制造商的说明，将两个不同的前miRNA序列（针对相同的靶基因）链起来，这些序列在 体外 测定（步骤1.4）中显示出最高的敲低活性17。
- 使用步骤1.4中所述的体外测定评估链状构建 体 的基因抑制效率。如果三个或更多前miRNA序列显示出类似的高敲低活性，请测试两个序列的不同组合，并使用显示最高敲低活性的组合（参见 代表性结果）。
- 将EmGFP-pre-miRNA表达盒转移到Tol2转座子载体
注意：将含有EmGFP cDNA和两个前miRNA序列的表达盒转移到Tol2转座子载体（pT2K-CAGGS载体，参见 材料表）中。为此，使用具有人工限制性内切酶位点的引物对表达盒（包括从CMV启动子的3'端到miRNA表达载体的miRNA逆转序引物位点）进行PCR扩增，并将PCR产物克隆到Tol2转座子载体中。Tol2转座子载体包含无处不在的CAGGS启动子，其驱动插入表达盒的表达。CAGGS启动子和表达盒两侧是Tol2序列（图1）。- EmGFP-pre-miRNA表达盒的PCR扩增：遵循 表3中所述的反应设置和热循环条件。
- 将凝胶纯化的PCR产物（约1.3 kb）连接到限制性内切酶酶解的Tol2转座子载体中。将质粒电穿孔到感受态大肠杆菌细胞中（参见 材料表）并选择重组体（pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA构建体）。
- 使用常规maxiprep试剂盒制备质粒（参见 材料表）。分别通过限制性图分析和用于PCR的引物检查质粒的结构和序列。
2. 种蛋储存和孵化
- 从当地农场或商业供应商处购买受精白腿角（Gallus gallus）卵。
注意：在孵化前，鸡蛋可以在12-16°C或4°C下保存长达1周，在孵化过程中不会显着失去活力或发育延迟。 - 在鸡蛋上标记孵化的开始日期，并标记鸡蛋的顶部（胚胎将放置的位置）。在38°C的水平位置孵育受精卵，直到胚胎达到汉堡和汉密尔顿（HH）阶段10（33-38小时）-11（40-45小时）19。
3. 卵内 电穿孔
- 卵内电穿孔的制备
- 制备0.25%快速绿色溶液：将25mg快速绿色FCF溶解在10mL PBS中。使用0.2μm注射器过滤器过滤溶液。溶液可以存储在室温中。
- DNA混合物：通过将单个pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA质粒（子步骤1.6.3）与Tol2转座酶表达质粒（pCAGGS-T2TP载体;参见 材料表）（每个5μg/μL）以2：1的比例混合来制备注射溶液。加入 1/10 体积的 0.25% 快速绿色溶液以可视化注射区域。
注意：最佳DNA浓度可能因构建体而异。 - 设置显微注射装置（图3A，B）：显微注射装置由以下内容组成（见材料表）：汉密尔顿注射器，18 G针头（针头长度= 2“），PVC（聚氯乙烯）管（2厘米长），微量移液器针（可以通过用微量移液器拉动欧米茄点纤维（1毫米外径X 0.75毫米内径）拉毛细管制成）。
- 用重矿物油填充汉密尔顿注射器。将18G针头连接到注射器上，并通过按下注射器柱塞用油填充针头的内部空间。
- 将一根 2 厘米长的 PVC 管连接到针头的末端，并在管子中填充油。
- 将拉动的微量移液器针头连接到管子上。用细镊子将微量移液器针头的尖端折断至10-20μm直径，以形成一个小开口。用油填充整个针头。
注意：应注意不要在系统中捕获任何气泡，因为它们会抑制DNA溶液的流动。
- 将 5 μL 彩色 DNA 混合物（子步骤 3.1.2）放入无菌培养皿中。在解剖显微镜下，将微量移液器针头的尖端放入无菌培养皿上的DNA溶液中，然后将溶液缓慢吸入针头中。
- 等到针头内外的压力平衡（以避免空气进入针头），然后将针尖从DNA溶液中取出。将针尖浸没在小烧杯中的无菌PBS中，直到注射。
- 设置电穿孔设备（图3A，C）：
- 在显微操纵器上设置一对带有电极支架的铂电极。将电极尖端之间的间距调整为2 mm（图3C，E）。
- 用电缆将电极连接到方波脉冲发生器（见 材料表）。
- 显微注射DNA溶液（图3D）
- 从培养箱中取出鸡蛋，用浸泡在70%乙醇中的薄纸擦拭鸡蛋表面。
- 将 18 G 针头连接到 10 mL 注射器上。将针头插入鸡蛋的钝端，向下倾斜（45°），以免损坏蛋黄。
- 从鸡蛋中取出 2-3 mL 白蛋白。用一块透明胶带密封孔。通过用光“烛光”鸡蛋来确认胚胎和卵黄碱膜与壳分离。
- 用剪刀和镊子从鸡蛋顶部取出一块蛋壳（直径2-3厘米的圆圈），露出胚胎。任何时候不要窗口超过五个鸡蛋，以防止在电穿孔过程中胚胎变干。
注意：如果在不破裂鸡蛋的情况下很难打开窗户，则可以在取出一块蛋壳之前用胶带或透明胶带覆盖鸡蛋的整个顶部。 - 将针尖从其近端以45°角插入视囊泡，并通过缓慢按下（或敲击）柱塞直到蓝色溶液充满腔来注射DNA混合物（图3D）。
注意：或者，可以使用压力显微注射系统（参见 材料表）来注射DNA溶液。 - 取出针头并将其尖端放回PBS。
- 电穿孔（图3E）
- 电穿孔器的脉冲参数设置如下： 电压： 15 V， 脉冲长度： 50 ms， 脉冲间隔： 950 ms， 脉冲数： 5
- 在胚胎上方的玻璃膜上加入几滴HBSS。使用垂直于胚胎前后轴的显微操纵器将电极降低到HBSS中。
注意：或者，此过程可以在不添加HBSS的情况下完成，因为白蛋白是一种良好的电导体，可以有效地电穿孔。 - 将电极放在视囊泡的任一侧（前（鼻）侧和后（颞）侧）（图3E）。确保电极不接触胚胎或血管。施加脉冲电场。
- 取下电极并用水浸泡的无菌棉签轻轻清洁电极，以避免白蛋白积聚。
- 用透明胶带密封窗口，然后重新孵育胚胎，直到所需的发育阶段。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
构建Tol2转座子构建体，用于表达针对Nel的人工miRNA
Nel（Neural Epidermal Growth Factor （EGF）-Like;也称为Nell2）是一种细胞外糖蛋白。它与血小板反应素-1具有结构相似性，主要在神经系统中表达20,21。我们之前已经证明Nel调节视网膜神经节细胞的分化和存活15，并作为视网膜轴突22,23,24的抑制引导线索。在发育中的雏鸡视网膜中，在HH15（胚胎日（E）2.5）的推定色素上皮中检测到Nel表达。在HH20（E3.5）下，在新分化的视网膜神经节细胞中也观察到Nel表达。Nel在色素上皮和视网膜神经节细胞中的强烈表达至少持续到E1815。
为了检查Nel在视网膜神经节细胞发育中的功能，通过使用卵电穿孔和Tol2转座子系统将人工miRNA引入发育中的视网膜来敲低Nel基因的表达15,16。首先，使用在线RNAi设计工具（参见材料表），为鸡Nel cDNA（GenBank入藏号：NM_001030740.1）蛋白质编码区域中的10个潜在靶序列设计了成对的单链DNA寡核苷酸。将寡核苷酸对退火并单独克隆到miRNA表达载体中。然后，将单个构建体转染到稳定表达Nel-AP的HEK293T细胞中，并通过测量培养基中的AP活性来评估其敲低效率。使用pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA阴性质粒作为对照（图4A）。
根据制造商的说明，选择了三个显示出最高敲低效应的Nel前miRNA序列（分别针对鸡Nel cDNA的核苷酸482-502、910-930和2461-2481），并将两个前miRNA序列串联克隆到miRNA表达载体（pcDNA6.2-GW / EmGFP-2x Nel pre-miRNA）中17。编码两个前miRNA和EmGFP的表达盒通过PCR扩增，两端都有一个人工EcoRI位点（5′-GGGAATTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′和5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′），并克隆到pT2K-CAGGS载体（pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA）中。通过使用用于PCR的引物确认表达盒的序列。将pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel前miRNA构建体与Tol2转座酶表达载体（pCAGGS-T2TP）单独共转染到稳定表达Nel-AP的HEK293T细胞中，并通过测定培养基中的AP活性来评估对Nel-AP表达的抑制作用。如图 4B所示，两个miRNA序列的链化显著提高了敲低效率。至少在转染后13天之前观察到Nel-AP表达的强抑制（超过90%）（图4B）。
稳定抑制发育中的雏鸡视网膜中的Nel表达
通过卵电穿孔在HH9-11下将pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel前miRNA构建体（包含鸡Nel cDNA的核苷酸482-502和2461-2481的靶序列）与转座酶表达载体（pCAGGS-T2TP）共转染到雏鸡视网膜的颞侧或鼻侧（图3，图5A）。从E4.5或E8视网膜制备切片，并使用抗Nel抗体22通过免疫组织化学评估对Nel表达的影响。在E4.5，表达EmGFP的细胞中Nel在视网膜色素上皮中的表达显着降低（图5B-D）。在E8，在视网膜神经节细胞中也明显观察到Nel表达的降低（图5E-I）。Nel表达的显着抑制至少持续到E18（数据未显示）。对照miRNA的引入不影响视网膜中的Nel表达（图5J-O）。
图 1：转座酶转座 Tol2 侧翼 cDNA 的转位。 示意图显示了用于EmGFP的Tol2侧翼表达盒的转位，并通过转座酶链连接了两个前miRNA序列（2x前miRNA）。当将含有表达盒（pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA构建体）的Tol2转座子载体引入具有Tol2转座酶表达构建体（pCAGGS-T2TP）的细胞中时，Tol2侧翼表达盒从载体中切除并通过转座酶活性整合到宿主基因组中。EmGFP和miRNA的表达由无处不在的启动子CAGGS驱动。这个数字是从Nakamoto等人15修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：工程化前miRNA的结构 。 （A）设计的pre-miRNA序列基于小鼠miR-155序列17。上链寡核苷酸包含（从5'端到3'端）四核苷酸突出（TGCT（蓝色））、反义靶序列（21个核苷酸）、末端环序列（红色）和义目标序列（19个核苷酸）。反义靶序列代表成熟的miRNA序列。底链寡核苷酸包含一个四核苷酸5'悬垂（CCTG（蓝色））和上链寡核苷酸的反向补体序列，但在3'端缺少四核苷酸悬垂（AGCA-3'：上链寡核苷酸的5'-TGCT的反向补体）。检测靶序列缺少靶序列的核苷酸9和10。反义靶序列中的“额外”两个核苷酸在成熟miRNA分子的茎环结构中形成内部环，这导致更高的敲低率17。（B）针对鸡Nel的目标序列示例。显示了鸡Nel基因靶序列（GenBank入库号NM_001030740.1，核苷酸482-502）的顶部和底部链中的义和反义序列。 请点击此处查看此图的大图。
图3： 在卵子 显微注射和电穿孔中 。 （A）用于 卵子 显微注射和电穿孔的工作站。（1）解剖显微镜。（2）注射装置。（3）电穿孔设备。（4）双鹅颈显微镜照明器。（5）电穿孔器。（二）注射器具。带有18G针头（7）的汉密尔顿注射器（6）连接到PVC管（8）和拉动的微量移液器针头（9）并设置在显微操纵器（10）上。设备的内部空间充满重矿物油。（三）电穿孔装置。一组带有电极支架（12）的铂电极（11）设置在显微操纵器（13）上。电极通过电缆（14）连接到电穿孔器。（D）在HH 10-11处将DNA混合物溶液显微注射到视囊泡中。将拉出的微量移液器针从其近端插入视囊泡中。将含有快速绿色（蓝色）的DNA混合物溶液注入视囊泡中，直到染料充满整个管腔。（E）电穿孔进入视囊泡。电极平行放置（电极之间的距离为2mm），并且以某种方式使注射的视囊泡位于电极之间：一个电极位于视囊泡的前（鼻）表面附近，另一个电极位于后脑水平的胚胎后部。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：单个或链式前 miRNA 序列的 体外 评估对 Nel 基因抑制效率。 （A）单个前miRNA序列的敲低效应。显示了五种代表性构建体（反义靶序列对应于鸡Nel cDNA（GenBank入藏号：NM_001030740.1）的核苷酸编号482-502,910-930,1106-1126,1663-1683和2461-2481）的结果。将单个miRNA表达构建体（pcDNA6.2-GW / EmGFP-Nel pre-miRNA）转染到稳定表达Nel-AP的HEK293T细胞中。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA阴性质粒用作对照。通过测量转染后48-96小时培养基中的AP活性来评估Nel-AP的表达。三种Nel前miRNA表达构建体（分别针对核苷酸482-502、910-930和2461-2481）显示出对Nel表达的显著抑制。（B）链前miRNA序列的敲低效应。将三个最有效的前miRNA序列中的两个（针对核苷酸482-502,910-930和2461-2481）串联克隆到pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR载体中，并将表达盒（包含两个前miRNA序列和EmGFP cDNA）转移到pT2K-CAGGS载体（pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA）。将pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel前miRNA构建体与Tol2转座酶（pCAGGS-T2TP）的表达载体单独共转染到稳定表达Nel-AP的HEK293T细胞中，并通过测量转染后2至13天培养基中的AP活性来评估Nel-AP的表达。与未链的单个前miRNA序列相比，所有三种组合（482-502/910-930、482-502/2461-2481、910-930/2461-2481）均显示出增强的抑制活性。从第2天到至少第13天观察到Nel-AP表达的显着抑制。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：通过 Tol2 转座子介导的 miRNA 转基因整合，发育中的鸡网膜中 Nel 表达的稳定敲低。将包含两个Nel前miRNA序列和EmGFP（pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA （482-502）-Nel pre-miRNA （2461-2481））（A-I）或表达不相关的miRNA和EmGFP（J-O）的表达盒的Tol2转座子构建体与转座酶表达载体（pCAGGS-T2TP）共转染到视囊泡的颞半部或鼻半部通过卵形在HH9-HH11（E1.5）下电穿孔。在E4.5（B-D，J-L）或E8（E-I，M-O）制备视网膜切片，并使用抗Nel抗体（红色）通过免疫组织化学检查Nel基因抑制的效率。由于DNA带负电，转基因被电穿孔到阳极侧的组织;因此，只有一半的视网膜被标记为EmGFP（转染（TF）侧，绿色）。（A）EmGFP标记基因在E4.5处在视网膜颞半部的表达。视裂（白色箭头）表示转染和未转染（对照）侧之间的边界。（B-I）RNAi敲低发育中的小鸡视网膜中Nel表达。（乙-四）在E4.5时，表达EmGFP（C，D）的视网膜色素上皮（PE）细胞中的Nel表达显着降低（B，D）。注意Nel免疫染色和D中EmGFP表达的互补模式。NR，神经视网膜。（E-I）在E8处，转染侧（F，G）的视网膜色素上皮和神经节细胞层（GCL）中的Nel表达（E，G）降低。（H， I）转染区域和相应对照区域（以E为单位）（用小矩形表示）的更高放大倍率视图。（D，G）合并了左侧两个图像的图像。（J-O）对照miRNA的表达。阴性对照构建体的引入不影响Nel在E4.5（J-L）或E8（M-O）视网膜中的表达。（L，O）合并了左侧两个图像的图像。转染侧和对照侧之间的边界由C、F、K和N中的虚线表示。 比例尺，50μm.（A）和（B-I）分别由Nakamoto，M.和Nakamoto，C 16和Nakamoto et al.15修改。请点击此处查看此图的大图。
| 退火反应装置 | |
| 顶链寡核苷酸（200 μM 在 TE 缓冲液中） | 5 μL （终浓度 50 μM） |
| 底链寡核苷酸（TE缓冲液中的200μM） | 5 μL （终浓度 50 μM） |
| 10x 寡核苷酸退火缓冲液* | 2 微升 |
| 不含脱氧核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶的水* | 8 微升 |
| 总 | 20 微升 |
| *在miRNA表达试剂盒中提供（见 材料表） | |
表1：退火反应设置
| 2x AP 基板缓冲器 | |
| 10 M 二乙醇胺 （pH 9.8） | 4毫升 |
| 1 M 氯化镁2 | 10 微升 |
| L-高精氨酸 | 45毫克 |
| 牛血清白蛋白 （BSA） | 10毫克 |
| 对硝基苯磷酸酯 | 63毫克 |
| H2O | 添加以构成 20 mL 的总体积 |
表 2：2x AP 基板缓冲器。溶液应等分储存在-20°C，并避光，因为对硝基苯磷酸盐对光敏感。
| 反应设置 | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x 前 miRNA 质粒（来自第 1.5 节） 或 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA 阴性对照质粒*（0.1 μg/μL） |
1 微升 | ||
| 10x Pfu 缓冲液 | 5 微升 | ||
| dNTP 混合物（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 10 mM） | 1 微升 | ||
| EmGFP 正向引物* （5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM） | 1 微升 | ||
| miRNA逆转录引物* （5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM） | 1 微升 | ||
| Pfu DNA 聚合酶（5 单位/μL） | 0.5 微升 | ||
| H2O | 40.5 微升 | ||
| 总体积 | 50 微升 | ||
| * 在 miRNA 表达试剂盒中提供。 | |||
| 热循环条件 | |||
| 94 °C | 5 分钟 | ||
| 以下 30 个循环： | |||
| 94 °C | 45 秒 | ||
| 58 °C | 1 分钟 | ||
| 72 °C | 2 分钟 | ||
| 72 °C | 10 分钟 | ||
表3：反应设置和热循环条件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议提供了通过使用 卵 电穿孔和 Tol2 转座子系统中人工 miRNA 的转基因表达在发育中的鸡视网膜中基因沉默的详细指南。
以下因素对于成功执行此技术至关重要。首先，使用经证实具有强大敲低效果的miRNA序列至关重要。在将它们应用于 卵 电穿孔之前，在 体外 测定中测试单个前 miRNA 序列的基因抑制效率（步骤 1.4），并链上显示最高敲低活性的两个前 miRNA 序列（步骤 1.5）。其次，重要的是在插入微量移液器针头注射DNA溶液时不要损伤视囊泡和周围的神经组织。胚胎的过度损伤可能导致胚胎畸形和死亡。为避免组织损伤，请将微量移液器以正确的方向引入视囊泡。微量移液器针头的更小和更锋利的尖端将使视囊泡的穿透更平滑，并导致更少的组织损伤。然而，尖端非常小的针头难以加载和释放DNA溶液。在这里描述的研究中，使用了尖端开口直径为10-20μm的针头。第三，确保用DNA溶液填充整个视囊泡（通过快速绿色的扩散可视化）。第四，将电极放置在最佳位置，将DNA靶向视囊泡的所需区域（例如，颞侧，鼻侧）。带负电荷的DNA分子将向阳极侧移动;因此，电极的精确放置和方向对最终结果至关重要。最后，使用最佳DNA浓度和电穿孔参数。
如果在电穿孔24小时后未观察到荧光信号，应考虑以下因素：（1）确认电穿孔质粒具有正确的序列。（2）重新检查单个质粒的浓度和纯度。（3）确保DNA溶液充满视囊泡的腔，并且不会扩散到神经管中。（4）检查所用电穿孔参数是否正确。（5）在施加电脉冲时检查电极是否与玻璃膜接触。
在该协议中， 卵内 电穿孔和转座子介导的基因整合方法的组合提供了几个明显的优势。首先，它支持miRNA的稳定生产，从而持续抑制靶基因。雏鸡视网膜的发育从E1.5开始，一直持续到孵化（视网膜神经节细胞在E2到E9期间产生）。对于基因功能的功能丧失分析，在此期间应稳定维持人工miRNA的表达。使用常规表达载体表达RNAi序列通常是瞬时的，因为表达构建体无法有效地整合到染色体中。然而，在这里描述的方法中，表达盒的染色体整合是由共电穿孔转座酶的活性介导的，这导致转基因的稳定表达。
其次，在该方法中，相同的CAGGS启动子诱导转染细胞中多个miRNA序列和EmGFP标记的共顺反子表达，从而规避启动子干扰的风险，这是含有两个启动子的逆转录病毒载体的常见并发症之一，以获得双基因表达25。
最后，与具有复制能力的逆转录病毒载体不同，通过这种方法电穿孔的转基因不会转移到邻近细胞。因此，通过使用适当类型的电极并将其放置在正确的位置，可以更精确地控制转染面积。
尽管具有上述优点，但当前的方法也具有卵电穿孔 固有 的局限性。例如，胚胎之间的转染和基因抑制速率可能不同，可能需要转染相对大量的胚胎进行分析。此外，在发育后期阶段（例如E4-E5）电穿孔到 卵子中的 胚胎视网膜具有实验困难，因为眼睛在这些阶段位于心脏附近，这增加了电穿孔后心脏骤停的风险。
这里描述的系统允许在发育中的雏鸡视网膜中进行快速而强大的基因抑制。这种方法也可以应用于雏鸡胚胎的其他部分，包括神经和非神经组织。因此，我们期望该系统有助于阐明雏鸡发育的分子机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
pT2K-CAGGS和pCAGGS-T2TP载体分别由Yoshiko Takahashi（日本京都京都大学）和Koichi Kawakami（日本三岛国立遗传学研究所）提供。我们感谢Michael Berberoglu对手稿的重要阅读。这项工作得到了皇家学会和生物技术与生物科学研究委员会（BBSRC）（英国）对M.N.的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
