Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

Zusammenfassung

Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.

Zusammenfassung

Die physiologischen und pathophysiologischen Rollen extrazellulärer Vesikel (EVs) werden zunehmend anerkannt, was das EV-Feld zu einem sich schnell entwickelnden Forschungsgebiet macht. Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile haben, die sich auf die nachgelagerte Ausbeute und Reinheit von Elektrofahrzeugen auswirken. Daher ist die Charakterisierung der EV-Vorbereitung, die aus einer bestimmten Quelle durch eine gewählte Methode isoliert wurde, wichtig für die Interpretation der nachgelagerten Ergebnisse und den Vergleich der Ergebnisse zwischen Labors. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung der Größe und Menge von Elektrofahrzeugen, die durch Krankheitszustände oder als Reaktion auf äußere Bedingungen verändert werden können. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine der führenden Technologien für die Hochdurchsatzanalyse einzelner Elektrofahrzeuge. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Größenbestimmung von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe und menschlichem Plasma der Maus isoliert wurden, wobei eine bahnbrechende Technologie für NTA verwendet wurde, die große Fortschritte auf diesem Gebiet darstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode reproduzierbare und valide Daten zur Gesamtpartikelkonzentration und -größenverteilung für EVs liefern kann, die mit verschiedenen Methoden aus verschiedenen Quellen isoliert wurden, wie durch die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Anpassung dieses Instruments an NTA wird die Notwendigkeit einer Standardisierung von NTA-Methoden adressieren, um die Strenge und Reproduzierbarkeit in der EV-Forschung zu erhöhen.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine (0,03-2 μm) membrangebundene Vesikel, die von fast allen Zelltypen abgesondert werden¹. Sie werden oft als "Exosomen", "Mikrovesikel" oder "apoptotische Körper" bezeichnet, abhängig von ihrem Freisetzungsmechanismus und ihrer Größe^2. Während man anfangs dachte, dass EVs nur ein Mittel sind, um Abfälle aus der Zelle zu entfernen, um die Homöostase^{aufrechtzuerhalten 3,}wissen wir jetzt, dass sie auch an der interzellulären Kommunikation durch Transfer von molekularem Material - einschließlich DNA, RNA (mRNA, microRNA), Lipiden und Proteinen^4<....

Protokoll

Alle Arbeiten mit diesen Proben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und des Institutional Review Board durchgeführt. Eine schematische Übersicht über die NTA-Methode ist in Abbildung 2dargestellt.

Abbildung 2: Überblick über die NTA-Methode mit dem Partikelverfolgungsinstrument. Die Probe wird vorbereitet und in das Instrument eingelegt. Die NTA-Software wir....

Ergebnisse

Vor dieser Demonstration wurde zunächst die Kalibrierung des Instruments getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten durch Messung der Größenverteilung von Polystyrolperlenstandards sicherzustellen. Wir haben die Größenverteilung von 100 nm und 400 nm Perlen mit den Standardaufzeichnungsparametern und den in diesem Protokoll empfohlenen Verarbeitungseinstellungen getestet (Abbildung 8).

Für den 100 nm Polystyrolperlenstandard wurde eine Konzentration von 4,205.......

Diskussion

Hier demonstrieren wir ein Protokoll für NTA von Elektrofahrzeugen, um die Größenverteilung eines breiten Spektrums von Partikelgrößen gleichzeitig zu messen und die Gesamtkonzentration von Elektrofahrzeugen in einer polydispersen Probe zu messen. In dieser Studie wurden periguronadales Fettgewebe und menschliches Plasma der Maus als Quelle für EVs verwendet. EVs, die aus anderen Geweben oder biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser und Zellkulturüberstand isoliert wurden, können je.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Zum Verdünnen von Proben
100 nm Kügelchenstandard	Thermo Scientific	3100A	Zum Testen der ViewSizer 3000 Kalibrierung
400 nm Kügelchenstandard	Thermo Scientific	3400A	Zum Testen der ViewSizer 3000
Zentrifugalfiltereinheit	Amicon	UFC901024	Zum Filtern von PBS Verdünnungsmittel
Sammelröhrchen, 2 mL	Qiagen	19201	Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma
Druckluft-Staubwedel	DustOff	DPSJB-12	Zum Reinigen von Küvetteneinsatz
	HORIBA	Scientific-Bereitgestellt	mit dem Kauf von ViewSizer 3000
Küvettenvorrichtung	HORIBA Scientific-Zum		Ausrichten des magnetischen Rührstabs beim Platzieren der Einsätze in der Küvette; Geliefert mit dem Kauf von ViewSizer 3000
De-ionisiertes Wasser	VWR	02-0201-1000	Zum Reinigen von Küvetten
Desktop-Computer mit Monitor, Tastatur, Maus und allen erforderlichen Kabeln		Dell-Bereitgestellt	beim Kauf von ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore	Sigma-Zum	Reinigen von Küvetten
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma
Glasszintillationsfläschchen mit Deckel	Thermo Scientific	B780020	Zur Reinigung von Küvetten
"Hook" Werkzeug	Excelta-Geliefert		mit dem Kauf von ViewSizer 3000
Fusselfreies Mikrofasertuch	Texwipe	TX629	Zum Reinigen von Küvetten und zum Abdecken der Arbeitsfläche
Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL	Eppendorf	22363344	Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln im menschlichen Plasma
Rührstab	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quarzküvette mit Kappe	Agilent Technologies	AG1000-0544	Ursprünglich mit dem Kauf von ViewSizer 3000
geliefert ViewSizer 3000	HORIBA Scientific-Nanoparticle		Tracking Instrument