Methodenartikel

Funktionelle Beurteilung der intestinalen Tight-Junction-Barriere und der Ionenpermeabilität im heimischen Gewebe durch Ussing-Chamber-Technik

DOI:

10.3791/62468

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26. Mai 2021

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1Laboratory of Physiology, Graduate School of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Darmepithel verleiht nicht nur Nährstoffaufnahme, sondern auch Schutz vor schädlichen Substanzen. Die apikal-epithelste interzelluläre Verbindung, d. h. die Tight Junction, reguliert die parazelluläre Durchlässigkeit von gelösten Stoffen und Ionen. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Schleimhautblättern und zur Beurteilung der Ionenselektivität von Tight Junctions mittels Ussing-Kammertechnik beschrieben.

Zusammenfassung

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Die Ussing-Kammertechnik wurde erstmals 1951 vom dänischen Wissenschaftler Hans Ussing erfunden, um den transzellulären Transport von Natrium über die Froschhaut zu untersuchen. Seitdem wurde diese Technik auf viele verschiedene Gewebe angewendet, um die physiologischen Parameter des Transports über Membranen hinweg zu untersuchen. Die Ussing-Kammermethode ist anderen Methoden vorzuziehen, da natives Gewebe verwendet werden kann, wodurch es besser auf das anwendbar ist, was in vivo geschieht. Da jedoch natives Gewebe verwendet wird, ist der Durchsatz gering, die Zeit ist begrenzt und die Gewebevorbereitung erfordert Geschick und Training. Diese Kammern wurden verwendet, um spezifische Transporterproteine in verschiedenen Geweben zu untersuchen, Krankheitspathophysiologie wie bei Mukoviszidose zu verstehen, den Transport und die Aufnahme von Medikamenten zu untersuchen und insbesondere zum Verständnis des Nährstofftransports im Darm beizutragen. Angesichts des gesamten epithelialen Transportprozesses eines Gewebes sind nicht nur transepitheliale Bahnen, sondern auch parazelluläre Wege wichtig. Tight Junctions sind eine Schlüsseldeterminante der gewebespezifischen parazellulären Permeabilität im Darm. In diesem Artikel wird die Ussing-Kammertechnik verwendet, um die parazelluläre Permselektivität von Ionen durch Messung der transepithelialen Leitfähigkeit und der Verdünnungspotentiale zu bewerten.

Einleitung

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Die Ussing-Kammermethode wurde erstmals von dem dänischen Wissenschaftler Hans Ussing entwickelt. Ussing verwendete es zunächst, um den Kurzschlussstrom des Natriumtransports über die Froschhaut zu messen, nachdem beobachtet wurde, dass NaCl gegen einen steilen Konzentrationsgradienten über die Haut transportiert werden konnte1. Sein System bestand aus der Froschhaut, die zwischen zwei Kammern mit Zugang zu beiden Seiten der Haut montiert war. Jede Kammer enthielt Ringer-Lösung, die zirkuliert und belüftet wurde. Zwei schmale Agar-Ringer-Brücken, die sich in der Nähe der Haut befinden und mit gesättigten KCl-Kalomel-Elektroden verbunden sind, m....

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Protokoll

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Alle Tiere, die in diesen Experimenten verwendet wurden, wurden in der Tierpflegeeinrichtung der Universität von Shizuoka untergebracht und die Experimente wurden gemäß den Richtlinien für Tierversuche der Universität Shizuoka durchgeführt. Alle Experimente wurden mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee an der University of Shizuoka (Genehmigungen # 205272 und # 656-2303) durchgeführt.

1. Herstellung von NaCl-Elektroden

HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten Elektroden bestehen aus konzentriertem NaCl oder KCl. Die KCl/Calomel-Elektroden werden kommerziell eingekauft. Stellen Sie vor Beginn des E....

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Ergebnisse

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Die in diesem Papier gezeigten Ergebnisse sind Ergebnisse, die Teil eines größeren Projekts waren, das abgeschlossen wurde (siehe Referenz 4,23,24).

Die transepitheliale elektrische Leitfähigkeit des Dünndarms ist bei Cldn15-/- Mäusen erniedrigt.
Der transmuköse Ausgangsleitwert (unter Kurzschlussbedingungen) de.......

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Diskussion

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In diesem Experiment wurden Ussing-Kammern verwendet, um die elektrischen Basisparameter und das Verdünnungspotential von NaCl im Dünndarm von Cldn15-/- und WT-Mäusen zu messen. Bei der Durchführung von Ussing-Kammerexperimenten ist es sehr wichtig, zu überprüfen, ob die in den Experimenten verwendete Membranvorbereitung praktikabel ist. Dies geschieht in der Regel durch Zugabe von Glukose oder dem Adenylatcyclase-Aktivator Forskolin und durch Sehen, ob ein angemessener Anstieg des

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird von 17K00860 (zu HH) und 19K20152 (zu NI) unterstützt. WH möchte der Otsuka Toshimi Scholarship Foundation für ihre finanzielle Unterstützung von 2018-2021 danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#3 PolyethylenschlauchHibikiAußendurchmesser 1,0 mm; Innendurchmesser 0,5 mm
#7 PolyethylenschlauchHibikiAußendurchmesser 2,3 mm; Innendurchmesser 1,3 mm
10 mL VerriegelungsspritzeTerumoSS-10LZVerriegelungsspritzen sind notwendig, um zu verhindern, dass sich die Nadel beim Befüllen
19 g NadelTerumoNN-1938RBitte seien Sie vorsichtig bei der Arbeit mit Nadeln und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände
23 g NadelTerumoNN-2332RBitte seien Sie vorsichtig bei der Arbeit mit Nadeln und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände
5 mm StanzeNANA NAZum Stanzen von Löchern in Filterpapier und Parafilm-Akupunkturnadeln
SeirinNSWird als Präpariernadeln verwendet, um Gewebe an die Sezierplatte zu heften
AgarFujifilm Wako010-15815
KrokodilklemmenNANAVerbindet die Elektrode mit dem Verstärker
CaCl2Fujifilm Wako038-00445
D(-)-MannitolFujifilm Wako133-00845Dies wird verwendet, um die Osmolalitätsdifferenz in der Verdünnung zu korrigieren HEPES-Puffer
D(+)-GlukoseFujifilm Wako049-31165
PräpariersetSie benötigen eine Schere und eine gebogene Pinzette
PräparierplattenWir haben 10 cm Zellkulturplatten verwendet und mit Silikonkautschuk
DMSOSigma472301-500MLFür die Herstellung von Forskolin Stock
Elektrischer RekorderTOA ElectronicsPRR-5041Andere gleichwertige elektrische Rekorder sind im Handel erhältlich
Epithelspannungs-ZangenverstärkerNihon KohdenCEZ9100Andere gleichwertige Verstärker sind im Handel erhältlich
Filterpapier, in Quadrate geschnittenNANAGestanzt mit einem 5 mm Stanzer, zur Aufnahme
Darmvorbereitung feine PinzetteFast GeneFG-B50476Für stumpfe Dissektion der Muskelschicht
ForskolinAlomone LabsF-500Stellen Sie 10 mM Lagerbestand in DMSO her, die Endkonzentration beträgt 10 & Mikro; M
HEPESSigmaH4034-1KG
IndomethacinSigmaI7338-5GStellen Sie einen 1 mM Vorrat in 21 mM NaHCO3 her, die Endkonzentration beträgt 10 & Mikro; M
K2HPO4Fujifilm Wako164-04295
KClFujifilm Wako163-03545
KCl/Kalomel-ElektrodeAsch Japan Co.SCE-100
KH2PO4Kanto chemikalie32379-00
L(+)-GlutaminFujifilm Wako074-00522
MgCl2Fujifilm Wako135-00165
Mischgas (95% O2/5% CO2)Shizuoka Oxygen CompanyWird zum Blasen von Ringer-Lösung und -Kammern bei Verwendung von Ringer-Lösung
verwendetNaCl Fujifilm Wako191-01665
NaCl-ElektrodeNANAHandgefertigte Elektroden, die konzentrierten NaCl- und Silberdraht erfordern
NaHCO3Fujifilm Wako191-01305
O2 GasShizuoka Oxygen CompanyWird für Blasenkammern verwendet, wenn HEPES-Puffer
ParafilmBemisPM-996verwendet wird, um die Abdichtung von Ussing-Kammern
zu unterstützen pH-MessgerätDKK-TOA CorpHM-305HEPES-Puffer muss auf pH 7,4 bei 37 & Grad eingestellt werden; C
pH-Meter-ElektrodeDKK-TOA CorpGST-5311C
SilikonkautschukShinetsu ChemicalKE-12Wird zum Füllen von Dissektionsplatten
verwendet SilberdrahtWird zur Herstellung von NaCl-Elektroden
verwendet Kleine Gläser mit KunststoffdeckelnNANA Verwendung für NaCl-Elektroden
StereomikroskopZeissStemi 305Ein Stereomikroskop ermöglicht es Ihnen, die Tiefe zu sehen, so dass Sie das Gewebe leichter sezieren können
Tris (Trizma-Basis)SigmaT1503-1KGStellen Sie eine 1M-Lösung her, um den pH-Wert von HEPES-Puffern einzustellen
Ussing-KammernSanki Kagaku KougeiDiese Kammern sind maßgeschneiderte kontinuierliche Perfusionskammern mit einem Fensterdurchmesser von 5 mm
Wasserpumpe und HeizsystemTokyo Rikakikai Co. Ltd.NTT-110
löst überzogen einer

Referenzen

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  1. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
  2. Field, M.

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Schlagwörter

Tight JunctionsDarmbarriereparazellul re Permeabilit ttransepithelische Leitf higkeitVerd nnungspotenzialeClaudin 15 KnockoutKurzschlussstrom

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