Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Zusammenfassung

Mikrostrukturierung ist eine etablierte Technik in der zellbiologischen Gemeinschaft, die verwendet wird, um Verbindungen zwischen der Morphologie und Funktion von Zellkompartimenten zu untersuchen und gleichzeitig Komplikationen zu umgehen, die sich aus natürlichen Zell-zu-Zell-Variationen ergeben. Um die Zellform zu standardisieren, werden die Zellen entweder in 3D-Formen eingeschlossen oder durch Klebeinseln auf Klebegeometrie kontrolliert. Traditionelle Mikrostrukturierungstechniken, die auf Photolithographie und tiefem UV-Ätzen basieren, hängen jedoch stark von Reinräumen oder Spezialgeräten ab. Hier stellen wir eine von Doyle et al. modifizierte Infrarot-Laser-Assisted Micropatterning-Technik (Microphotopatterning) vor, die bequem mit handelsüblichen Bildgebungssystemen aufgebaut werden kann. In diesem Protokoll verwenden wir ein Nikon A1R MP+ Bildgebungssystem, um Mikromuster mit Mikrometer-Präzision durch einen Infrarotlaser (IR) zu erzeugen, der voreingestellte Bereiche auf polyvinylalkoholbeschichteten Decklippen absträcht. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Skript, um eine automatisierte Musterherstellung mit hoher Effizienz und Genauigkeit in Systemen zu ermöglichen, die nicht mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet sind. Wir zeigen, dass dieses IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) zu definierten Mustern führt, an die sich Zellen ausschließlich anheften und die gewünschte Form annehmen. Darüber hinaus können Daten aus einer großen Anzahl von Zellen aufgrund der Standardisierung der Zellform gemittelt werden. Muster, die mit diesem Protokoll generiert werden, können in Kombination mit hochauflösender Bildgebung und quantitativer Analyse für Bildschirme mit relativ hohem Durchsatz verwendet werden, um molekulare Akteure zu identifizieren, die die Verbindung zwischen Form und Funktion vermitteln.

Einleitung

Die Zellform ist eine Schlüsseldeterminante grundlegender biologischer Prozesse wie Gewebemorphogenese¹, Zellmigration², Zellproliferation³und Genexpression⁴. Veränderungen in der Zellform werden durch ein kompliziertes Gleichgewicht zwischen dynamischen Umlagerungen des Zytoskeletts, das die Plasmamembran deformt, und extrinsischen Faktoren wie externen Kräften, die auf die Zelle ausgeübt werden, und der Geometrie von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionen^{angetrieben 5}. Migrierende mesenchymale Zellen polymerisieren beispielsweise ein dichtes Aktinne....

Protokoll

1. Coverslip-Vorverarbeitung

1. Bereiten Sie blitzsaubere Abdecklippen vor, wie in Waterman-Storer, 1998²⁵beschrieben.
2. 1% ige (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS) Lösung vorbereiten und die Coverlips in der Lösung für 10 min unter sanftem Rühren inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Deckenrlips in der Lösung frei bewegen.
3. Deckenlippen zweimal mit dH₂O für je 5 min waschen.
4. Bereiten Sie 0,5% ige Glutaraldehyd (GA) -Lösung vor und inkubieren Sie die Coverlips in der Lösung für 30 min auf einem Shaker. Verwenden Sie für 25 Abdeckschichten 50 ml Glutaraldehydlösung. Stellen Sie sicher, dass ....

Ergebnisse

Die Qualität der experimentellen Daten, die durch Mikrostrukturierung gewonnen werden, hängt weitgehend von der Qualität der Muster ab. Um die Qualität der mit der obigen Methode erzeugten Muster zu bestimmen, haben wir zunächst die Reflexionsmikroskopie verwendet, um die Form und Größe der fotoabgetragenen Bereiche des Coverlips zu beurteilen. Wir fanden heraus, dass jedes einzelne Muster der Ablationsmaske sehr ähnlich sah und klare Grenzflächen und eine Oberfläche aufwies, die das Licht gleichmäßig reflektierte (

Diskussion

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das beschriebene IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) reproduzierbare adhärente Muster verschiedener Formen liefert, die die Manipulation der Zellform und der Zytoskelettarchitektur ermöglichen. Obwohl sowohl vor als auch nach dem Debüt des Mikrophotomusternings zahlreiche Mikrostrukturierungsmethoden entwickelt wurden, besitzt diese Methode mehrere Vorteile. Erstens sind keine speziellen Geräte und Reinräume erforderlich, die normalerweise nur in Den Enginee.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(3-Aminopropyl)trimethoxysilan	Aldrich	281778
10 cm Zellkulturschale	VWR	10062-880	Polysteren, TC-behandelt, belüftet
25X Apo LWD Wassertauchobjektiv	Nikon	MRD77225
3,5 cm Zellkulturschale	VWR	10861-586	Polysteren, TC-behandelt, belüftet
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Thermo	62248	1 mg/ml Dihydrochloridlösung
Rinderserinalbumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Wisent	311-425-CL
Ethanolamin	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronektin	Sigma-Aldrich	FC010	1 mg/ml in pH 7,5 Puffer
Fibronektin Antikörper	BD	610077	Maus
Fidschi	ImageJ		Version 1.53c
Fluoreszierendes Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glas Deckglas	VWR	16004-302	22 & 22 mm
Glutaraldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	16220	25% wässrige Lösung
Salzsäure	Caledon	6025-1-29	37% wässrige Lösung
IR Laser	Coherent	Chamäleon Vision
Minimal Essential Medium & Alpha;	Gibco	12561-056
Eindeckmedium	Sigma	F4680
Maus Sekundärantikörper	Zellsignaltechnologie	4408S	Ziege, 488nm
Multiphotonenmikroskop	Nikon	A1R MP+
Myosin Leichtkette Antikörper	Zellsignaltechnologie	3672S	Kaninchen
NIS Elemente	Nikon		Stand 5.21.03
Salpetersäure	Caledon	7525-1-29	70% wässrige Lösung
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Pulver
Poly(vinylalchol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolysiertes
Kaninchen Sekundärantikörper	Zellsignaltechnologie	4412S	Ziege, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Auch bekannt als analoger Rocker
Natriumborhydrid	Aldrich	452882	Pulver
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045
Natriumphosphat Dibasic	Sigma	S5136	Pulver
Natriumphosphat Monobasic	Sigma	S5011	Pulver
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0,05% ige wässrige Lösung mit 0,53 mM EDTA