Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).
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Methodenartikel
In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ab dem Jahr 2000 stand der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus immer noch vor einigen Hindernissen. Dazu gehören die begrenzte Anzahl von Leichenspendern und die langfristige Verwendung von Immunsuppressiva. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als potenzieller Kandidat als alternative Quelle für inselähnliche Zellgenerierung angesehen. Unsere früheren Berichte haben erfolgreich die Etablierung von Induktionsprotokollen zur Unterscheidung von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) zu insulinproduzierenden Zellen (IPCs) veranschaulicht. Die Induktionseffizienz variierte jedoch stark. In diesem Artikel demonstrieren wir den Vergleich der Pankreasinduktionseffizienz von hDPSCs über integrative (mikroökumweltliche und genetische Manipulation) und nicht-integrative (mikroökumvimentale Manipulation) Induktionsprotokolle zur Bereitstellung von hDPSC-abgeleiteten IPCs (hDPSC-IPCs). Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Induktionseffizienz für beide Induktionsansätze in Bezug auf 3-dimensionale Koloniestruktur, Ausbeute, Pankreas-mRNA-Marker und funktionelle Eigenschaften bei Multidosis-Glukose-Herausforderung hin. Diese Ergebnisse werden die zukünftige Etablierung einer klinisch anwendbaren IPCs und einer Produktionsplattform für Pankreaslinien unterstützen.
Einleitung
Diabetes mellitus ist ein anhaltendes globales Problem. Ein Bericht der International Diabetes Federation (IDF) schätzte, dass die globale Prävalenz von Diabetes von 151 Millionen im Jahr 2000 auf 415 Millionen im Jahr 2015 steigen würde1,2. Die jüngste epidemiologische Studie hat vorhergesagt, dass die geschätzte weltweite Diabetesprävalenz von 451 Millionen im Jahr 2017 auf 693 Millionen im Jahr 2045 steigen wird1. Der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll wurde erstmals im Jahr 2000 nachgewiesen, als gezeigt wurde, dass sie die endogene Insulinproduktion aufrechterhält und den normoglykämischen Zustand bei Typ-I-Diabetikern stabilisiert3. Die Anwendung des Edmonton-Protokolls steht jedoch immer noch vor einem Engpassproblem. Die begrenzte Anzahl von Leichenspendern ist das Hauptproblem, da jeder Patient mit Typ-I-Diabetes mindestens 2-4 Inselspender benötigt. Darüber hinaus kann die langfristige Anwendung von Immunsuppressiva lebensbedrohliche Nebenwirkungen verursachen4,5. Um dies zu beheben, hat sich die Entwicklung einer potenziellen Therapie für Diabetes in den letzten zehn Jahren hauptsächlich auf die Erzeugung wirksamer insulinproduzierender Zellen (IPCs) aus verschiedenen Quellen von Stammzellen konzentriert6.
Stammzellen wurden zu einer alternativen Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, der durch den Verlust von Beta-Zellen verursacht wird. Die Transplantation von IPCs ist die neue vielversprechende Methode zur Kontrolle des Blutzuckers bei diesen Patienten7. Zwei Ansätze zur Erzeugung von IPCs, integrative und nicht-integrative Induktionsprotokolle, werden in diesem Artikel vorgestellt. Das Induktionsprotokoll ahmte den natürlichen Entwicklungsprozess der Bauchspeicheldrüse nach, um die ausgereiften und funktionellen IPCs8,9zu erhalten.
Für diese Studie wurden hDPSCs durch Durchflusszytometrie für die MSC-Oberflächenmarkerdetektion, das Multilineage-Differenzierungspotenzial und RT-qPCR charakterisiert, um die Expression der Stemness-Eigenschaft und der proliferativen Genmarker zu bestimmen (Daten nicht gezeigt)8,9,10. hDPSCs wurden zu definitiven Endoderm-, Pankreasendoderm-, endokrinen Pankreas- und Pankreas-Betazellen oder IPCs induziert (Abbildung 1) bzw.7. Um die Zellen zu induzieren, wurde ein dreistufiger Induktionsansatz als Backbone-Protokoll verwendet. Dieses Protokoll wurde als nicht-integratives Protokoll bezeichnet. Im Falle des integrativen Protokolls wurde der essentielle Pankreas-Transkriptionsfaktor PDX1in hDPSCs überexprimiert, gefolgt von der Induktion von überexprimiertem PDX1 in hDPSCs unter Verwendung eines dreistufigen Differenzierungsprotokolls. Der Unterschied zwischen nicht-integrativem und integrativem Protokoll ist die Überexpression von PDX1 im integrativen Protokoll und nicht im nicht-integrativen Protokoll. Die Pankreasdifferenzierung wurde in dieser Studie zwischen den integrativen und nicht-integrativen Protokollen verglichen.
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Protokoll
Diese Arbeit wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission für Humanforschung, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn University genehmigt. Humane DPSCs (hDPSCs) wurden aus menschlichem Zahnpulpagewebe isoliert, das aufgrund von Weisheitszähnenproblemen sowohl aus Prämolaren als auch aus Backenzähnen extrahiert wurde. Die Einwilligung nach Aufklärung wurde von den Patienten im Rahmen eines genehmigten Protokolls eingeholt (HREC-DCU 2018/054).
1. Integratives Induktionsprotokoll
- Herstellung von lentiviralen Vektoren, die PDX1 tragen
- Verwenden Sie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293FT für die virale Verpackung. Kultivieren und pflegen Sie diese Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Antibiotikum-Antimykotika.
- Erzeugen Sie PDX1-Lentivirus-Vektoren durch Co-Transfektion von jeweils 10 μg der Verpackungs- und Hüllplasmide und 20 μg des zielgerichteten Genplasmids in HEK293FT-Zellen unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionssystems, z. B. psPAX2, pMD2. G und human pWPT-PDX111. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während der Zeit der Infektion zu 80% bis 90% konfluent sind.
- Sammeln Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, 48 und 72 h nach der Transfektion.
- Filtern Sie das gesammelte Medium durch einen 0,45 μm-Filter; konzentrieren die Viren mit einem Zentrifugalfilter bei 100 kDa nominaler Molekulargewichts-Cut-off (NMWCO).
- PDX1-Überexpression
- Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSC, die zu 70-80% konfluent sind. Trypsinisieren und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. 1 x 106 hDPSCs auf eine 60 mm Gewebekultur behandelte Schale aufsäen und über Nacht inkubieren.
- 24 h später werden frische Viruspartikel aus Schritt 1.1.4 hinzugefügt, um vorbehandelte Polybrenzellen (4 μg/ml Polybren, 30 min unter 37 °C und 5 % CO2)bei der gewünschten Infektionsmultizität (MOI) zu transduzieren. In diesem Fall ist der verwendete MOI beispielsweise 20. Halten Sie die Zellen im Zellkulturinkubator 24 h bei 37 °C mit 5% CO2.
- Nach der 24- h-Infektionsphase das Medium, das Viruspartikel enthält, verwerfen. Fügen Sie frische Nährmedien hinzu und züchten Sie die Zellen 48 Stunden lang weiter. Alle Kulturen werden bei 37 °C und 5% CO2gehalten.
- Überprüfen Sie die aggregierte Morphologie der transfizierten Zellen, bevor Sie mit dem Induktionsschritt fortfahren. Die PDX1-Transduktion wird durch Genexpressionsanalyse bestätigt (Ergänzende Abbildung 1).
HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem Mikroskop, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. - Ernte und fahren Sie mit einem dreistufigen Induktionsprotokoll (Schritt 1.3) als mikroumweltlichem Induktionsansatz fort.
- Dreistufiges Induktionsprotokoll
HINWEIS: Das dreistufige Induktionsprotokoll führte zu einer Reihe von Pankreasdifferenzierungen von hDPSCs zu definitivem Endoderm, Pankreasendoderm / endokrinen und Pankreas-Betazellen / IPCs unter Verwendung von serumfreiem Medium (SFM) -A, SFM-B und SFM-C.- Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie dann die transduced-hDPSCs mit 1x phosphatgepufferter Lösung (PBS).
- 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
- Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und spülen Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.
- Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (Relative Zentrifugalkraft: RCF), 4 °C, für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet auf.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL des ersten Pankreasinduktionsmediums, d.h. serumfreies Medium (SFM)-A. Säen Sie die Zellen auf einer niedrigen Bindungskulturplatte (60 mm). Halten Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 3 Tage.
HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. - Entfernen Sie SFM-A und fügen Sie 3 ml des zweiten Induktionsmediums, d. H. SFM-B, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 2 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
HINWEIS: Beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. - Entfernen Sie SFM-B und fügen Sie 3 ml des dritten Induktionsmediums, d. H. SFM-C, hinzu. Halten Sie die Zellen für die nächsten 5 Tage in einem Zellkulturinkubator, der bei 37 °C mit 5% CO2gehalten wird. Wechseln Sie das Medium alle 48 h. Beobachten Sie ihre Morphologie nach 5 Tagen.
HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM Glucagon-ähnliches Peptid (GLP)-1, 1 mM Nicotinamid und 1x nicht-essentielle Aminosäuren (NEAAs). - Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie nach jedem Schritt unter einem invertierten Mikroskop überprüfen. Die Zellen werden stärker aggregiert und schwimmen als Kolonien.
- Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).
2. Nicht-integratives Induktionsprotokoll
HINWEIS: Das nicht-integrative Protokoll ist das Backbone-Protokoll zur Bereitstellung der IPCs mit dem dreistufigen Induktionsprozess als mikroumweltlicher Induktionsansatz8,9.
- Verwenden Sie Passage 3-5 hDPSCs bei 70%-80% Konfluenz.
- Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie hDPSCs mit 1x PBS.
- 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellen geben und 1 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
- Fügen Sie das Kulturmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und pipetieren Sie die Zellen vorsichtig, um die Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie Zellen und aliquot 1 x 106 Zellen in jedem Sammelröhrchen.
- Zentrifuge die Zellsuspension bei 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Verwerfen Sie den Überstand.
- Das Pellet in SFM-A wieder auffüllen und auf eine Kulturplatte mit niedrigem Aufsatz (60 mm) aussäen. Die Zellen werden 3 Tage lang bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter einem invertierten Mikroskop.
- SFM-A entfernen, SFM-B (Tag 3) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 2 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten.
- SFM-B entfernen, SFM-C (Tag 5) hinzufügen und dann die Zellen für die nächsten 5 Tage unter 37 °C, 5% CO2halten. SFM-C wird alle 48 h gewechselt.
HINWEIS: Jedes Induktionsmedium wird wie beschrieben mit verschiedenen Reagenzien ergänzt; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM Aktivin A, 1 nM Natriumbutyrat und 50 μM Beta-Mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS und 0,3 mM Taurin; und SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM Taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM Nicotinamid und 1x NEAAs. - Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellmorphologie unter dem invertierten Mikroskop nach jedem Schritt und an Tag 10 überprüfen.
HINWEIS: Die Zellen werden aggregierter und schweben als Kolonien. - Sammeln Sie Zellkolonien für weitere Analysen. Überprüfen Sie die Morphologie und Größe der Kolonie. Durchführung einer Pankreas-Genmarkerexpressionsanalyse und Funktionsanalyse (Glucose stimulated C-peptide sekretion assay).
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Ergebnisse
In diesem Artikel wurden die Ergebnisse beider Induktionsprotokolle verglichen. Die Diagramme beider Induktionsprotokolle sind in Abbildung 2A,Cdargestellt. In beiden Protokollen wurde die Auswertung unter einem Lichtmikroskop durchgeführt und die Bilder mit ImageJ analysiert. hDPSCs waren in der Lage, kolonieähnliche Strukturen vom ersten Tag der Induktion in beiden Induktionsprotokollen zu bilden. Die Morphologie der Kolonie war rund und dicht, und alle Kolonien schwebten ...
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Diskussion
Das Erreichen einer höheren IPCs-Produktion aus MSCs spielt eine wesentliche Rolle in der Diabetestherapie. Die kritischen Schritte des integrativen Protokolls hängen von der Qualität der für die Transduktion zu verwendenden Zellen und der Qualität der transduzierten Zellen ab. Einige Zellanforderungen, die auf eine erfolgreiche Transduktion überprüft werden sollten, stellen sicher, dass sich die Zellgesundheit, das Zellbankmanagement und die Zellen in einem mitotisch aktiven Zustand befinden. Darüber hinaus spielt auch ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
SK, WR und QDL wurden von der Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University, unterstützt. TO und PP wurden von Chulalongkorn Academic Advancement in Its2nd Century Project unterstützt. CS wurde durch ein forschungsunterstützendes Stipendium der Fakultät für Veterinärwissenschaften, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University und Government Research Fund unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellkultur | |||
| Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | ||
| Corning® 60 mm TC-behandelte Kulturschale | Corning® | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| fötales Rinderserum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphatgepuffertes Kochsalzpulver (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Eine Packung wird zur Herstellung von 1 l PBS-Lösung mit sterilem |
| DDI Trypsin-EDTA (0,25 %) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviraler Vektor mit PDX1 Zubereitung | |||
| Amicon® Ultra-15 Zentrifugalfilter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Mensch pWPT-PDX1 Plasmid | Addgene | 12256 | Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,45 &Mikro; m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G Plasmid | Addgene | 12259 | Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infektion / Transfektion Reagenz | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Geschenk von Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Dreistufiges Induktionsprotokoll | |||
| Activin A rekombinantes humanes Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Rinderserumalbumin (BSA, Cohn-Fraktion V, fettsäurefrei) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selen (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| nicht-essentielle Aminosäuren (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Unbehandelte Zellkulturschale, 60 mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Natriumbutyrat | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
