Method Article

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

DOI:

10.3791/62536

⸱

May 6th, 2021

 ,  , 
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schlaganfall ist eine der häufigsten Todesursachen und erworbene Behinderungen bei Erwachsenen in industrieländern Ländern. Trotz umfangreicher Untersuchungen nach neuartigen Therapiestrategien gibt es nach wie vor begrenzte Therapiemöglichkeiten für Schlaganfallpatienten. Daher ist mehr Forschung für pathophysiologische Wege wie Entzündungen nach einem Schlaganfall, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration erforderlich. Angesichts der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die Komplexität des Gehirns zu reproduzieren, sind experimentelle Schlaganfallmodelle für die Analyse und anschließende Bewertung neuartiger Wirkstoffziele für diese Mechanismen unerlässlich. Darüber hinaus werden dringend detaillierte standardisierte Modelle für alle Verfahren benötigt, um die sogenannte Replikationskrise zu überwinden. Als Versuch innerhalb des ImmunoStroke-Forschungskonsortiums wird ein standardisiertes photothrombotisches Mausmodell mit einer intraperitonealen Injektion von Rose Bengal und der Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser beschrieben. Dieses Modell ermöglicht die Durchführung von Schlaganfällen bei Mäusen mit Zuordnung zu jeder kortikalen Region des Gehirns ohne invasive Operation; Dies ermöglicht die Untersuchung von Schlaganfällen in verschiedenen Bereichen des Gehirns. In diesem Video werden die chirurgischen Methoden der Schlaganfallinduktion im photothrombotischen Modell zusammen mit der histologischen Analyse demonstriert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischämischer Schlaganfall bleibt eine der Hauptursachen für Todesfälle und erworbene Erwachsene Behinderung in den Entwickelten Ländern im 21. Jahrhundert, die für etwa 2,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2017 weltweitverantwortlich sind 1. Trotz der immensen Anstrengungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft sind nur wenige Behandlungen verfügbar. Darüber hinaus sind diese bereits begrenzten Optionen bei solch hohen Ausschlusskriterien für viele Patienten nicht zugänglich, was zu einem dringenden Bedarf an neuartigen Behandlungen zur Verbesserung der funktionellen Genesung nach einem Schlaganfall führt.

In Anbetracht der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die komplexen Interaktionen des Gehirns zu replizieren, sind Tiermodelle für die präklinische Schlaganfallforschung unerlässlich. Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell in der Schlaganfallforschung. Die Mehrheit dieser Mausmodelle zielt darauf ab, Infarkte zu induzieren, indem sie den Blutfluss innerhalb der mittleren Hirnarterie (MCA) blockieren, da sich die Mehrheit der menschlichen Schlaganfallläsionen im MCA-Territorium befindet2. Obwohl diese Modelle menschliche Schlaganfallläsionen besser rekapitulieren, beinhalten sie konvulierte Operationen mit hoher Infarktvolumenvariabilität.

Seit Rosenblum und El-Sabbans Vorschlag des photothrombotischen Modells im Jahr 19773und später die Anwendung dieses Modells auf Ratten Watson et al.4ist es in der ischämischen Schlaganfallforschung weit verbreitet5,6. Das photothrombotische Schlaganfallmodell induziert einen lokalen und definierten kortikalen Infarkt als Folge der Photoaktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoffs, der zuvor in den Blutfluss injiziert wurde. Dies führt zu einer lokalen Thrombose der Gefäße in den lichtexponierten Bereichen. Kurz gesagt, bei Einwirkung von Licht aus dem injizierten lichtempfindlichen Farbstoff wird eine lokalisierte oxidative Verletzung der Endothelzellmembran induziert, die zu Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung führt, gefolgt von einer lokalen Störung des zerebralen Blutflusses7.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit der Ausführung und der Möglichkeit, die Läsion in die gewünschte Region zu lenken. Im Gegensatz zu anderen experimentellen Schlaganfallmodellen ist für die Durchführung des photothrombotischen Schlaganfallmodells ein geringes chirurgisches Fachwissen erforderlich, da die Läsion durch Beleuchtung des intakten Schädels induziert wird. Darüber hinaus können die gut abgegrenzten Grenzen (Abbildung 2A und Abbildung 5B) und die Flexibilität, die Läsion zu einer bestimmten Hirnregion zu induzieren, die Untersuchung zellulärer Reaktionen innerhalb des ischämischen oder intakten kortikalen Bereichs erleichtern8. Aus diesen Gründen eignet sich dieser Ansatz zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der kortikalen Plastizität.

In den letzten Jahrzehnten wurde die wachsende Sorge um die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen Forschungsgruppen als sogenannte Replikationskrisegeprägt 9. Nach der Koordination der ersten präklinischen randomisierten kontrollierten multizentrischen Studie im Jahr 201510, einem vorgeschlagenen Instrument zur Verbesserung der präklinischen Forschung11,12,13, wurde bestätigt, dass eine Ursache für die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen präklinischen Studien aus unabhängigen Labors die fehlende ausreichende Standardisierung experimenteller Schlaganfallmodelle und Ergebnisparameter war14. Als das ImmunoStroke-Konsortium (https://immunostroke.de/) gegründet wurde, eine Zusammenarbeit, die darauf abzielt, gehirn-immune Interaktionen zu verstehen, die den mechanistischen Prinzipien der Schlaganfall-Genesung zugrunde liegen, war die Standardisierung aller experimentellen Schlaganfallmodelle zwischen jeder Forschungsgruppe unerlässlich.

Hier wird das standardisierte Verfahren zur Induktion des photothrombotischen Modells beschrieben, wie es im oben genannten Forschungskonsortium verwendet wird. Kurz gesagt, ein Tier wurde einer Betäubung unterzogen, erhielt eine Rose Bengal Injektion (10 μL / g) intraperitonal, und der intakte Schädel, 3 mm von Bregma übrig, wurde sofort von einem 561 nm Laser für 20 min beleuchtet (Abbildung 1). Zusätzlich wird über eine verwandte histologische und verhaltensbezogene Methode zur Analyse des Schlaganfallergebnisses in diesem Modell berichtet. Alle Methoden basieren auf Standardarbeitsanweisungen, die im Labor entwickelt und verwendet werden.

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Protocol

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Die in diesem Video berichteten Versuche wurden nach den nationalen Richtlinien für den Einsatz von Versuchstieren durchgeführt und die Protokolle von den deutschen Regierungsgremien (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren männliche C57Bl / 6J-Mäuse, 10-12 Wochen alt und von Charles River Deutschland verschickt. Die Tiere wurden unter kontrollierten Temperaturen (22 °C ± 2 °C), mit einer Hell-Dunkel-Zyklusperiode von 12 h und Zugang zu pelletiertem Futter und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Vorbereitung des Materials und der Instrumente

  1. Rose Bengal in 0,9% iger Kochsalzlösung auflösen, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Schließen Sie die Wärmedecke an, um den Operationsbereich warm zu halten und die Körpertemperatur der Maus während der Anästhesie bei 37 °C zu halten.
  2. Bereiten Sie Schere, Zette, Baumwollstücke, Dexpanthenol-Augensalbe und Nahtmaterial vor. Bereiten Sie eine Spritze mit Kochsalzlösung (ohne Nadel) vor, um den Operationsbereich hydratisiert zu halten. Bereiten Sie das Anästhesiegas (100%O2 + Isofluran) vor.

2. Vorbereitung des Tieres

  1. Injizieren Sie Analgesie 30 minuten vor der Operation (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).
  2. Notieren Sie das Körpergewicht der Maus, um die Dosis von Rose Bengal einzustellen, die injiziert werden soll (10 μL / g, dh 100 μg / g).
  3. Legen Sie die Maus mit einer Isofluran-Durchflussrate von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung des Körpers und der Vibrissae aufhört.
  4. Übertragen Sie die Maus in den stereotaktischen Rahmen und legen Sie sie in Bauchlage mit der Nase in die Anästhesiemaske. Fixieren Sie das Tier und halten Sie die Isoflurankonzentration für 1 minute bei 4%. Dann reduzieren und halten Sie die Isoflurankonzentration bei 2%.
  5. Setzen Sie vorsichtig die Rektalsonde ein, um die Temperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe zu überwachen. Stellen Sie das zugehörige feedbackgesteuerte Heizkissen so ein, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird.
  6. Tragen Sie Dexpanthenol Augensalbe auf beide Augen auf und reinigen Sie die Haut und das umgebende Fell mit einem Desinfektionsmittel.

3. Photothrombose-Modell

  1. Machen Sie einen 2,0-2,5 cm langen Längsschnitt und ziehen Sie sich zurück, um den Schädel freizulegen. Führen Sie die Schädelexposition mit einem einzigen Schnitt durch, um Wundkomplikationen zu vermeiden.
  2. Entfernen Sie das Periost vorsichtig mit Baumwolle und identifizieren Sie die koronalen Nähte.
  3. Setzen Sie die Schutzbrille auf, schalten Sie den 561 nm Laser ein und markieren Sie die bregma +3 mm links.
  4. Schalten Sie den Laser aus, befestigen Sie einen Aufkleber mit einem Loch mit einem Durchmesser von 4 mm, das an den oben genannten markierten Koordinaten platziert ist.
  5. Injizieren Sie der Maus Bengal Rose (10 μL/g) intraperitoneal. Platzieren Sie den Laserstrahl 4-5 cm vom Schädel entfernt, schalten Sie den 561 nm Laser ein und beleuchten Sie den Schädel für 20 min.
  6. Tragen Sie zwei Tropfen 0,9% Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um die Wunde zu rehydrieren, die Wunde zu nähen und das Tier bei 37 ° C in eine Erholungskammer zu legen, um sich von der Anästhesie zu erholen. Nach 1 h bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.
  7. Injizieren Sie alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation Analgesie (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).

4. Scheinbetrieb

  1. Führen Sie zwei verschiedene Verfahren von Sham-Operationen durch, wie in den Schritten 4.1.1 und 4.1.2 beschrieben.
    1. Führen Sie alle Verfahren identisch mit dem oben beschriebenen Vorgang aus. Injizieren Sie Rose Bengal, ohne den Laser einzuschalten. Nach 20 Minuten unter Betäubung lassen Sie die Tiere 1 h in der Aufwachkammer bleiben, um sich zu erholen, bevor sie in ihre Käfige zurückgebracht werden.
    2. Führen Sie alle Verfahren identisch mit der oben beschriebenen Operation durch und schalten Sie den Laser ein. Rose Bengal nicht injizieren. Lassen Sie die Tiere nach 20 Minuten Laserbeleuchtung 1 h in der Aufwachkammer bleiben, um sich von der Anästhesie zu erholen, bevor sie in ihre Käfige zurückgebracht werden.

5. Laser-Speckle

  1. Schließen Sie die Heizdecke an, um den Operationsbereich warm zu halten und die Körpertemperatur der Maus während der Anästhesie bei 37 °C zu halten.
  2. Legen Sie die Maus mit einer Isofluran-Durchflussrate von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung des Körpers und der Vibrissae aufhört, und übertragen Sie die Maus dann in den stereotaktischen Rahmen.
  3. Legen Sie die Maus in Bauchlage mit der Nase in die Anästhesiemaske. Fixieren Sie das Tier und halten Sie die Isoflurankonzentration bei 4% für 1 min. T Henne reduzieren und halten Sie es bei 2%.
  4. Setzen Sie vorsichtig die Rektalsonde ein, um die Temperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe zu überwachen. Stellen Sie das zugehörige feedbackgesteuerte Heizkissen so ein, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird, und tragen Sie Dexpanthenol-Augensalbe auf beide Augen auf. Reinigen Sie die Haut und das umgebende Fell mit einem Desinfektionsmittel.
  5. Machen Sie einen 2,0-2,5 cm langen Längsschnitt und ziehen Sie sich zurück, um den Schädel freizulegen. Führen Sie die Schädelexposition mit einem einzigen Schnitt durch, um Wundkomplikationen zu vermeiden.
  6. Legen Sie den sterotaktischen Rahmen unter den Laserfleck und passen Sie die Höhe an, um ein scharfes Bild zu erhalten. Fokussieren Sie die Laser Speckle Perfusion Imaging (LSI) Kamera auf das Schädelfenster. Konfigurieren Sie das hochauflösende LSI-Kamerasystem (Laser Speckle Imaging) wie zuvor beschrieben15.
  7. Erfassen Sie Daten aus einem Sichtfeld von 1 cm x 1 cm mit einer Wellenlänge von 785 nm und 80 mW Lasern mit einer Bildrate von 21 Bildern/s bei einem Arbeitsabstand von 1 cm für 1 min.
  8. Tragen Sie nach der Bildgebung zwei Tropfen 0,9% Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um die Wunde zu rehydrieren, die Wunde zu nähen und das Tier bei 37 ° C in eine Erholungskammer zu legen, um sich für 1 h von der Anästhesie zu erholen. Nach 1 h bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.

6. Neuroscore

HINWEIS: Für die neurologische Defizitanalyse wird eine modifizierte neurologische Skala verwendet, die 1997 von Eckenstein et al. veröffentlicht wurde15.

  1. Bewertung der Tiere für allgemeine (Tabelle 1) und fokale Defizite (Tabelle 2). Diese zusammengesetzte Skala reicht von 0 (keine Defizite) bis 46 (schwere Beeinträchtigungen).
  2. Führen Sie den Neuroscore jeden Tag zur gleichen Zeit durch und verwenden Sie chirurgische Kleidung, um einen neutralen Geruch zu erhalten.
  3. Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 30 Minuten lang mit einem offenen Käfig im Raum an und lassen Sie sie jeden Gegenstand 30 s lang beobachten.

7. Durchblutung

  1. Bereiten Sie eine 20-ml-Spritze mit PBS-Heparin (2 U/ ml) vor und stellen Sie sie 1 m über die Bank, um die schwerkraftgesteuerte Perfusion zu erleichtern / sicherzustellen.
  2. Intraperitoneal 100 μL Ketamin und Xylazin (120/16 mg/kg Körpergewicht) injizieren. Warten Sie 5 Minuten und bestätigen Sie die Beendigung der spontanen Körperbewegung und Vibrissae.
  3. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage und desinfizieren Sie die Abdominalkörperoberfläche mit 100% Ethanol. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt im Bauch; Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen ab, um das Herz vollständig zu visualisieren.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und führen Sie die Perfusionskanüle in den linken Ventrikel ein und perfusionieren Sie mit 20 ml PBS-Heparin.
  5. Nach der Durchblutung das Tier enthaupten und das Gehirn entfernen, mit Trockeneis einfrieren und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.

8. Infarkt-Volumetry

  1. Kryosektion: Schneiden Sie das Gehirn seriell auf einem Kryostaten auf 20 μm dicke Abschnitte alle 120 μm und montieren Sie es auf Dias. Lagern Sie die Dias bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C.
  2. Cresyl violett (CV) Färbung
    1. Zur Herstellung der Färbelösung 0,5 g CV-Acetat in 500 mlH2Omischen. Umrühren und erhitzen (60 °C), bis die Kristalle gelöst sind. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie in einer dunklen Flasche. Vor jedem Gebrauch auf 60 °C erwärmen und filtern (Papierfilter).
    2. Trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur für 30 min. Legen Sie sie für 15 min in 95% Ethanol, gefolgt von 70% Ethanol für 1 min und danach in 50% Ethanol für 1 min.
    3. Stellen Sie die Rutschen für 2 min in destilliertes Wasser, erfrischen Sie das destillierte Wasser und legen Sie die Rutschen für 1 min wieder in Wasser. Anschließend die Dias für 10 min bei 60 °C in die vorgeheizte Färbelösung geben. Waschen Sie die Dias zweimal in destilliertem Wasser für 1 min.
    4. Legen Sie die Dias für 2 min in 95% Ethanol. Dann legen Sie sie für 5 min in 100% Ethanol, erfrischen Sie das 100% Ethanol und legen Sie die Dias für 2 min wieder in 100% Ethanol. Anschließend die Dias mit einem Montagemedium abdecken.
    5. Analyse: Scannen Sie die Objektträger und analysieren Sie das indirekte Infarktvolumen nach der Swanson-Methode16, um Ödeme zu korrigieren: Ischämische Fläche = (ischämische Region)-((ipsilaterale Hemisphäre) - (kontralaterale Hemisphäre)).

9. Tunel-Färbung(In-situ-Apoptose-Erkennungskit)

  1. Trocknen Sie die Objektträger, postfixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd in PBS (ph 7,4) für 10-20 min bei RT. Waschen Sie in PBS, postfixieren Sie es in vorgekühltem Ethanol: Essigsäure 2:1 für 5 min bei -20 °C.
  2. In PBS waschen und Gleichgewichtspuffer auftragen (10 s bis maximal 60 min bei RT) und TdT-Enzym mit Arbeitsstärke anwenden (1 h bei 37 °C in befeuchteter Kammer)
  3. Arbeitsstärke-Stopp/Waschenzym auftragen (10 min bei RT), in PBS waschen und erwärmte (RT) Arbeitsstärke Anti-Digoxigenin-Konjugat auftragen (30 min bei RT im Dunkeln)
  4. In PBS waschen, mit DAPI 5 min bei RT inkubieren und die Dias mit Fluoromount-Medien montieren.

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Results

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Das hier beschriebene Modell ist ein photothrombotisches Schlaganfallmodell durch Rose Bengal Injektion und intakte Schädelbeleuchtung für 20 min, bei einer konstanten Wellenlänge von 561 nm und 25 mW Ausgangsleistung an der Faser. Obwohl die komplette photothrombotische Operation 30 min dauert, wird das Tier unter niedriger Betäubung gehalten und der Hirnschaden ist moderat. Etwa 10 Minuten nach dem Transfer in ihre Käfige waren alle Tiere wach, bewegten sich frei im Käfig und interagierten mit Wurfgefährten.

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Discussion

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Das vorgestellte Protokoll beschreibt das experimentelle Schlaganfallmodell der Photothrombose durch Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser mit einer vorherigen intraperitonealen Injektion von Rose Bengal. Bis vor kurzem war die Verwendung dieses Modells gering, nimmt aber stetig zu.

Die Mortalität während der Schlaganfallinduktion ist in diesem Modell nicht vorhanden. Die Gesamtmortalität von weniger als 5% entsteht während der Operation aufgrund anästhesiologischer Komplika...

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Disclosures

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Kooperationspartnern der Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) für Anregungen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie deutschlands im Rahmen des Münchner Clusters für Systemeeurologie (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) und im Rahmen der Stipendien LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 und LL-112/1-1 gefördert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
561 nm WellenlängenlaserSolnaCobolt HS-03
EssigsäureSigma Life Science695092
Anästhesiesystem für IsofluranDräger
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptose Detection KitMilliporeS7100
Bepanthen PomadeBayer1578681
C57Bl/6J MäuseCharles River000664
CollimeterThorlabsF240APC-A
CotonsNOBA Verbondmitel Danz974116
CresylvioletSigma Life ScienceC5042-10G
KryostatThermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%CLN Chemikalien Laborbedorf521005
Ethanol 96%CLN Chemikalien Laborbedorf522078
Ethanol 99%CLN Chemikalien LaborbedorfETO-5000-99-1
FilterpapierMacherey-Nagel432018
FeinschereFST15000-00
PinzetteFST11616-15
HeizdeckeFHC DC Temperaturregler  40-90-8D
IsofluranAbbotB506
IsopentanFluka59070
KetaminInresa Arzneimittel GmbH
Laser SpecklePerimedPeriCam PSI HR
Mayor ScissorsFST1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4Apotheke Innestadt Uni MünchenP32799
SchutzbrilleLaser 2000NIR-ZS2-38
Rose BengalSigma Aldrich198250-5G
Roti-Histokit EindeckmediumRoth6638.1
KochsalzlösungBraun131321
StereomikroskopZeissStemi DV4
Stereotaktischer RahmenStoelting51500U
Superfrost Plus ObjektträgerThermo ScientificJ1800AMNZ
XylacinAlbrecht

References

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