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Methodenartikel

Prächiasmatische, einmalige Injektion von Eigenblut zur Induktion einer experimentellen Subarachnoidalblutung in einem Rattenmodell

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DOI:

10.3791/62567

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18. Juni 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Rigshospitalet, 2Department of Clinical Experimental Research, Glostrup Research Institute, Rigshospitalet, 3Department of Clinical Medicine, University of Copenhagen, 4Department of Clinical Sciences, Division of Experimental Vascular Research, Lund University, 5Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Subarachnoidalblutung birgt nach wie vor eine hohe Belastung durch Mortalität und Morbidität beim Menschen. Um die weitere Erforschung der Erkrankung und ihrer Pathophysiologie zu erleichtern, wird ein prächiasmatisches Einzelinjektionsmodell vorgestellt.

Zusammenfassung

Trotz Fortschritten in der Behandlung in den letzten Jahrzehnten ist die Subarachnoidalblutung (SAB) nach wie vor mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsbelastung verbunden, von der vor allem eine relativ junge Bevölkerung betroffen ist. Es wurden mehrere Tiermodelle der SAB entwickelt, um die pathophysiologischen Mechanismen hinter SAB zu untersuchen und pharmakologische Interventionen zu testen. Das in diesem Artikel vorgestellte prächiasmatische Einzelinjektionsmodell bei der Ratte ist ein experimentelles Modell der SAB mit einem vorgegebenen Blutvolumen. Kurz wird das Tier betäubt, intubiert und mechanisch beatmet. Die Temperatur wird mit einem Heizkissen reguliert. In der Schwanzarterie wird ein Katheter gelegt, der eine kontinuierliche Blutdruckmessung sowie eine Blutentnahme ermöglicht. Die atlantooccipitale Membran wird eingeschnitten und ein Katheter zur Druckaufzeichnung in die Cisterna magna gelegt, um eine intrazerebrale Druckmessung zu ermöglichen. Dieser Katheter kann auch für intrathekale therapeutische Eingriffe verwendet werden. Die Ratte wird in einen stereotaktischen Rahmen gelegt, ein Bohrloch wird vor dem Bregma gebohrt und ein Katheter wird durch das Bohrloch eingeführt und direkt vor dem optischen Chiasma platziert. Eigenblut (0,3 ml) wird aus dem Schwanzkatheter entnommen und manuell injiziert. Dies führt zu einem Anstieg des intrazerebralen Drucks und einer Abnahme des zerebralen Blutflusses. Das Tier wird 30 Minuten lang sediert gehalten und erhält subkutane Kochsalzlösung und Analgetika. Das Tier wird extubiert und in seinen Käfig zurückgebracht. Das prächiasmatische Modell weist eine hohe Reproduzierbarkeitsrate und eine begrenzte Variation zwischen den Tieren aufgrund des vorgegebenen Blutvolumens auf. Es ahmt SAB beim Menschen nach und ist damit ein relevantes Modell für die SAH-Forschung.

Einleitung

Die nicht-traumatische Subarachnoidalblutung (SAB) ist eine Form des Schlaganfalls, die etwa 5 % aller Fälle ausmacht. Die häufigste Ursache für eine nicht-traumatische SAB ist die plötzliche Ruptur eines Aneurysmas (aSAH), die 85 % der SAB ausmacht. Weitere Ursachen sind die Ruptur einer arterio-venösen Malformation, Gerinnungsstörungen und Venenrupturen bei perimesenzephaler Blutung1. Die Inzidenzrate liegt bei 9 pro 100.000 Personenjahre, wobei die Sterblichkeit nach SAB 2,3 etwa jeder Dritte und ein weiteres Drittel die Unterstützung des täglichen Lebens erfordert.

Nach initialer Stabilisierung und Diagnosebestätigung richtet sich die Behandlung nach dem Schweregrad der Blutung. Den am schwersten betroffenen Patienten wird eine extraventrikuläre Drainage in die Ventrikel gelegt, um den intrazerebralen Druck (ICP) zu senken, und sie werden auf die Neurointensivstation aufgenommen, wo sie engmaschig überwacht werden. Die Patienten werden einer Angiographie unterzogen, um das (wahrscheinliche) Aneurysma zu identifizieren, und anschließend wird das Aneurysma gewickelt oder abgeschnitten, um eine erneute Blutung zu verhindern4. Trotz zahlreicher Studien zu pharmakologischen Therapien hat sich gezeigt, dass nur Nimodipin, ein Kalziumkanal-Antagonist, die Ergebnisse verbessert5. Derzeit laufen mehrere klinische Studien. Eine ausführliche Liste finden Sie in der Rezension von Daou und Kollegen6.

Die Ruptur eines Aneurysmas wurde als plötzliches Auftreten der schlimmsten Kopfschmerzen beschrieben, die jemals erlebt wurden, oder als Donnerschlagkopf. Die Ruptur führt zu einem steilen Anstieg des ICP, gefolgt von einer Verringerung des zerebralen Blutflusses (CBF). Diese Verminderung führt zu einer globalen Ischämie des Gehirns, die zu einem Bewusstseinsverlust führen kann. Dieser eher mechanistische Weg führt zusammen mit dem initiierten Abbau der extravasierten Elemente des Blutes zur Freisetzung von Zytokinen und zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems, was zu einer sterilen Neuroinflammation führt. Darüber hinaus wird häufig ein Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke beobachtet, was zu Hirnödemen und Störungen der Ionenhomöostase führt. All diese Veränderungen und mehr, die als frühe Hirnverletzung (EBI) bezeichnet werden, treten innerhalb der ersten paar Tage auf und führen zu neuronalem Verlust und Apoptose7.

Etwa 1/3 der Patienten, die an aSAB leiden, entwickeln zwischen dem 4. und 14. Tag eine verzögerte zerebrale Ischämie (DCI)8. DCI ist definiert als entweder das Auftreten einer fokalen, neurologischen Beeinträchtigung oder ein Abfall von mindestens zwei Punkten auf der Glasgow-Koma-Skala, der mindestens 1 Stunde andauert, wenn andere Ursachen, einschließlich Krampfanfälle und Nachblutungen, ausgeschlossen sind. DCI ist mit einem erhöhten Sterberisiko und einem verminderten funktionellen Ergebnis nach aSAH9 assoziiert. Der zerebrale Vasospasmus (CVS), die Verengung der Hirnarterien, ist seit Jahrzehnten mit DCI in Verbindung gebracht und galt früher als alleiniger Grund für DCI. Inzwischen konnte gezeigt werden, dass CVS auch ohne die Entwicklung einer DCI auftreten kann, und seitdem wurden weitere Faktoren wie mikrovaskuläre Thrombosen und Verengungen, kortikale Spreading Depression und eine Entzündungsreaktion von EBI identifiziert10,11,12.

Aufgrund des großen Einflusses von EBI und DCI auf den Krankheitsverlauf und das Outcome der betroffenen Patienten müssen Tiermodelle diese weitestgehend nachahmen und dennoch reproduzierbar sein. Forscher haben eine Vielzahl verschiedener Modelle bei einer Vielzahl von Tieren, von Mäusen bis hin zu nichtmenschlichen Primaten, eingesetzt, um zu versuchen, aSAB zu simulieren. Sprague-Dawley- und Wistar-Wildtyp-Ratten sind derzeit die am häufigsten verwendeten Versuchstiere, und die gebräuchlichsten Modelle sind das endovaskuläre Perforationsmodell, das Zisternen-Magna-Doppelinjektionsmodell und schließlich das prächiasmatische Einzelinjektionsmodell, das in diesem Artikelbeschrieben wird 13.

Das prächiasmatische Modell mit einer einzigen Injektion wurde ursprünglich von Prunell und Kollegen entwickelt, um einigen der Unzulänglichkeiten der anderen experimentellen Modelle entgegenzuwirken14. Wenn die Operation gemeistert wird, ist sie in hohem Maße reproduzierbar und minimiert die Variation zwischen den Tieren. Das Modell ahmt die SAB beim Menschen in mehreren Punkten nach, einschließlich des plötzlichen Anstiegs der ICP nach der Blutinjektion, der aufgrund eines Abfalls des CBF zu einer vorübergehenden globalen Ischämie führt15,16. Sie betrifft den vorderen Kreislauf, in dem die meisten aSAB beim Menschen auftreten17. Die Mortalität liegt zwischen 10 % und 33 %, abhängig von der Studie und der Menge des injizierten Blutes14,18. Verzögerter Zelltod und Neuroinflammation können an Tag 2 und 7 nachgewiesen werden, was Variablen liefert, um die Folgen von EBI und DCI zu untersuchen 19,20.

Die Studie enthält eine aktualisierte Beschreibung des prächiasmatischen Einzelinjektionsmodells bei der Ratte sowie eine Beschreibung, wie die ICP-Sonde als Port für die intrathekale Verabreichung von Arzneimitteln genutzt werden kann.

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Protokoll

Dieses Verfahren wird in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden und von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt wurden (Lizenznummer 2016-15-0201-00940), durchgeführt. Die Operation wird so weit wie möglich mit aseptischer Technik durchgeführt, einschließlich steriler Instrumente, Handschuhe, Katheter und Nähte. In der Studie wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 230 bis 350 g verwendet, die in einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Periode mit einer konstanten Temperatur von 22 °C (± 2 °C) und einer Luftfeuchtigkeit von 55 % (± 10 %) untergebracht waren. Die Tiere werden ad libitum mit Standardfutter und Wasser versorgt. Die Tiere werden nach der Operation in Einzelkäfigen untergebracht, können aber nach Entfernung der ICP-Sonde wieder in Gruppenkäfige gebracht werden. Das Anästhetikum in diesem Protokoll ist Isoflurangas, aber auch eine intraperitoneale Mischung aus Ketamin (100 mg/ml) und Xylazin (20 mg/ml) mit 1,5 ml/kg 3:2 ist wirksam21.

1. Vorbereitungen

  1. Modifizieren Sie einen peripheren 16-G-Venenkatheter für die Intubation. Um die Nadel zu modifizieren, kürzen Sie die Nadel um 1 cm und biegen Sie die verbleibende distale Nadel um 1 cm um 30° in Richtung des Injektionsventils. Entfernen Sie die Katheterflügel (Mehrfachverwendung).
  2. Um eine ICP-Sonde herzustellen, schneiden Sie ein 20-mm-Stück Polyethylenschlauch (Innendurchmesser (ID): 0,58 mm, Außendurchmesser (OD): 0,96 mm) ab und brennen Sie ein Ende, um eine kreisförmige Platte zu erhalten, wobei ein offenes Lumen bleibt. Umgehen Sie den Polyethylenschlauch mit 1 mm Silikonschlauch (ID: 1,0 mm, AD: 3,0 mm), bevor Sie 10 mm Silikonschlauch (ID: 0,76 mm, AD: 2,4 mm) an das Ende des Polyethylenschlauchs anschließen.
  3. Schalten Sie den Laptop ein und öffnen Sie die Datenerfassungssoftware. Kalibrieren Sie die Blutdruck- (BP) und intrazerebralen Drucksensoren (ICP) sowie den Laser-Doppler gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Bereiten Sie das Blutgasanalysegerät vor.
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass sich genügend Isofluran im Verdampfer befindet.
  5. Schalten Sie den O2 und den atmosphärischen Luftstrom ein. Stellen Sie den Durchfluss von O2 auf 30 % und den atmosphärischen Luftstrom auf 70 % ein.
  6. Legen Sie das Heizkissen auf und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.

2. Anästhesie

  1. Legen Sie die Ratte in die Anästhesiekammer mit einem Durchfluss von 30 % O2 und 70 % atmosphärischer Luft. 5 % Isoflurangas in die Kammer geben. Die adäquate Anästhesie dauert ca. 4 Minuten. Kontrollieren Sie die Atmung sorgfältig.
  2. Legen Sie die Ratte nach der Betäubung in Rückenlage auf eine schwere Platte, die von einem Gummiband umgangen wird. Platzieren Sie die Vorderzähne der Ratte unterhalb des Gummibandes.
  3. Ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette heraus. Reinigen Sie den Kehlkopf mit einer Wattestäbchen. Platzieren Sie ein externes Licht in der Mittellinie des Halses, um die Stimmbänder zu visualisieren.
  4. Intubieren Sie während der Inspiration mit dem modifizierten 16 G peripheren Venenkatheter. Wenn es richtig eingesetzt ist, entfernen Sie den Stiletto. Schließen Sie den Katheter an das Beatmungsgerät an.
    Anmerkungen: Die korrekte Platzierung des Schlauchs wird durch Brustbewegungen im Einklang mit der Atemfrequenz bestätigt. Wenn Bewegungen des Bauches zu sehen sind, extubieren Sie die Ratte und führen Sie sie wieder in die Anästhesieglocke ein. Wiederholen Sie den Vorgang nicht mehr als dreimal, da die Gefahr besteht, dass die Atemwege beschädigt werden.
  5. Bei Intubation wird das Tier künstlich mit 30 % O2 und 70 % atmosphärischer Luft beatmet. Halten Sie die Anästhesie bei 1,5%-3% Isofluran. Stellen Sie das Isofluran so ein, dass der Blutdruck zwischen 80-100 mmHg liegt.
  6. Halten Sie das inspiratorische Volumen der Atemschutzmaske bei 3 ml und die Frequenz bei 40-45 Inspirationen/min. Passen Sie das inspiratorische Volumen entsprechend der Blutgasanalyse an.
  7. Machen Sie einen Stich durch das innere Weichgewebe der Wange mit einer 2-0-Naht. Binden Sie die Naht um den Injektionsschlauch und das Injektionsventil des peripheren Venenkatheters, um den Katheter zu befestigen.
  8. Bringen Sie die Ratte auf das Operationsfeld und legen Sie sie in Rückenlage mit dem Schwanz zum Chirurgen.
  9. Tragen Sie das Augengel bei Bedarf auf, um trockenen Augen entgegenzuwirken.
  10. Führen Sie eine Zehenkneifen durch, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu bestätigen. Beurteilung und Aufrechterhaltung der Anästhesietiefe während der Operation.

3. Schwanzkatheter

  1. Desinfizieren Sie die proximalen 3-4 cm des Schwanzes mit 0,5% Chlorhexidin-Ethanol.
    Anmerkungen: Verwenden Sie von nun an das Operationsmikroskop nach Ermessen des Chirurgen.
  2. Machen Sie einen 15-20 mm großen Hautschnitt am proximalen Ende des Schwanzes auf der ventralen Seite. Achten Sie darauf, die Arterie nicht einzuschneiden.
  3. Lösen Sie die Haut mit einer gebogenen Pinzette vom darunterliegenden Bindegewebe.
  4. Dringen Sie vorsichtig in die Faszie ein und legen Sie die Arterie frei.
  5. Lösen Sie die Schwanzarterie vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus dem darunter liegenden Gewebe.
  6. Schieben Sie drei schwarze Seidenfäden unter das Gefäß. Legen Sie einen Faden so weit wie möglich distal und binden Sie einen chirurgischen Knoten fest um die Arterie. Halte die losen Enden des Fadens mit einem Hämostaten fest.
  7. Binden Sie die beiden verbleibenden Fäden locker um die Arterie.
  8. Schieben Sie den proximalen Faden so proximal wie möglich. Wenden Sie einen Hämostat an, um die Enden des proximalen Fadens zu halten. Ziehen Sie das Hämostat leicht, aber genug, um den Blutfluss einzuschränken und zu blockieren. Platzieren Sie das Hämostat auf dem Bauch.
  9. Schneiden Sie die Spitze des Katheters in einem Winkel von 45° ab. Schneiden Sie die scharfe Spitze ab, um das Eindringen der Arterienwand zu verhindern.
  10. Machen Sie mit einer Vannas-Schere einen Arterienschnitt von 1/3 des Durchmessers der Arterie in einem Winkel von 30°, 3-5 mm vom distalen Knoten entfernt.
  11. Führen Sie den Katheter mit zwei geraden Pinzetten in die Arterie ein. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Katheter zu halten, und die andere, um die Arterie vorsichtig über den Katheter zu ziehen.
  12. Führen Sie den Katheter bis zum proximalen Knoten in das Gefäß ein und lösen Sie den Knoten vom Hämostaten. Visualisieren Sie den Blutfluss im Katheter. Befestigen Sie den mittleren Faden locker am Katheter.
  13. Fahren Sie mit dem Einführen bis zu und wenn möglich kurz darüber hinaus bis zu dem Punkt fort, an dem die Arterie wieder von Faszien bedeckt ist.
  14. Kontrollieren Sie die Platzierung des Katheters und mögliche Leckagen, indem Sie mit Kochsalzlösung spülen.
  15. Befestigen Sie die beiden proximalen Fäden mit chirurgischen Knoten.
    HINWEIS: Die Blutdruckmessung muss pulsierend sein; Ist dies nicht der Fall, ist der Katheter nicht richtig platziert.
  16. Befestigen Sie den Katheter am Ende des Schnitts, indem Sie mit dem distalen Faden einen chirurgischen Knoten machen.
  17. Nähen Sie den Hautschnitt locker mit zwei nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Nähten zusammen. Achten Sie darauf, den Katheter nicht zu durchdringen.
    HINWEIS: Achten Sie während der gesamten Operation auf die Amplitude der Pulsation. Wenn dieser niedrig ist, spülen Sie den Katheter mit Kochsalzlösung.
  18. Lösen Sie den arteriellen Katheter vom Druckwandler, um den Blutfluss für die Blutgasentnahme zu ermöglichen. Platzieren Sie einen Mikrokapillarschlauch am Ende des Katheters. Lassen Sie das Blut in den Schlauch fließen. Befestigen Sie den Katheter nach der Blutentnahme wieder am Schallkopf und spülen Sie den Katheter.
  19. Führen Sie das Kapillarröhrchen in den Blutgasanalysator ein. Messen Sie den pH-Wert, den pCO2- und den pO2-Wert und notieren Sie sie
    Anmerkungen: Ändern Sie je nach Blutgas- und Blutdruckwerten die Beatmungsrate. Wenn der mittlere arterielle Druck (MAP) zu niedrig ist, versuchen Sie, die Flussrate von Isofluran zu verringern. Testen Sie die Reflexe, um die richtige Anästhesietiefe zu gewährleisten.

4. ICP-Sonde

  1. Setze die Ratte in den stereotaktischen Rahmen. Es ist wichtig, die Ratte symmetrisch zu positionieren.
  2. Legen Sie ein zylindrisches Kissen unter den stereotaktischen Rahmen, um eine vordere Beugung des Nackens zu erzeugen.
  3. Rasiere die Kopfhaut, den Hals und den Bereich hinter den Ohren der Ratte. Entfernen Sie die überflüssigen Haare.
  4. Desinfizieren Sie den Bereich mit 0,5% Chlorhexidin-Ethanol.
  5. Lokal mit 0,7 ml 10 mg/5 μg/ml Lidocain mit Adrenalin betäuben, die Nadel am kaudalen Ende des Schädels in der Mittellinie einführen. Mit 0,3-0,4 ml in die Halsmuskulatur injizieren. Injizieren Sie den Rest subkutan um und vor dem Bregma.
  6. Machen Sie einen Hautschnitt von der Nadel ~8 mm kaudal in der Mittellinie.
  7. Sezieren Sie alle Muskeln stumpf in Schichten, um die atlantooccipitale Membran (marmorfarbenes Dreieck kaudal zum Schädel in der Mittellinie) zu identifizieren.
  8. Verwenden Sie den Alm-Retraktor, um die Nackenmuskulatur zu fixieren. Platzieren Sie den gezackten Retraktor bei Bedarf kaudal.
  9. Prüfen Sie, ob die sterile ICP-Sonde mit dem ICP-Wandler verbunden ist. Spülen Sie die ICP-Sonde mit Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der ICP-Sonde vorhanden sind.
  10. Die Atlantooccipitalmembran mit einer 23-G-Nadel einschneiden. Bohren Sie ein Loch, um die ICP-Sonde durch die Membran zu locken.
  11. Führe die Sonde vorsichtig durch die Atlantooccipitalmembran. Ziehen Sie die Sonde leicht und stellen Sie sicher, dass sie eine pulsierende Kurve zwischen 0-5 mmHg aufweist. Wenn nicht, entfernen Sie die Sonde, überprüfen Sie die Verbindung zum Schallkopf und bestätigen Sie den Durchfluss durch das Lumen.
  12. Tragen Sie zwei Tropfen des Gewebeklebers auf. Bewegen Sie den 1 mm dicken Silikonschlauch nach vorne zur Membran und tragen Sie zusätzlichen Kleber auf, um das Risiko einer Verschiebung der ICP-Sonde zu minimieren.
  13. Entfernen Sie den/die Retraktor(en).
  14. Machen Sie eine horizontale Matratzennaht zum schädelförmigen Ende des Schnitts und eine einfache unterbrochene Naht zum kaudalen Ende mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht.

5. Platzierung der Nadel und der Laser-Doppler-Sonde

  1. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie direkt vor den Augen, 15 mm kaudal.
  2. Entfernen Sie das Bindegewebe und die Muskeln mit einer Pinzette. Verwenden Sie das Ende eines sterilen Wattestäbchens als Rougine, um das Bregma und die koronalen Nähte zu identifizieren.
  3. Platzieren Sie den Alm-Retraktor.
  4. Setzen Sie eine 25 G lange Spinalnadel in den stereotaktischen Rahmen ein. Setzen Sie die Nadel genau auf die Bregma und notieren Sie sich die Position.
    HINWEIS: Platzieren Sie das Mittelliniengelenk des stereotaktischen Rahmens in einem Winkel von 30° zum Tier in der vertikalen Ebene.
  5. Entfernen Sie die Nadel aus der Bregma, verschieben Sie den Rahmen 65 mm nach vorne und setzen Sie dann die Nadel wieder in die Mittellinie, um die Bohrstelle zu markieren.
  6. Bohren Sie, bis die Dura mater unter dem Knochen erkennbar ist. Entfernen Sie die Knochenfragmente vorsichtig mit einer geraden Pinzette und füllen Sie den Hohlraum mit Knochenwachs.
  7. Bohren Sie ein weiteres Loch 3-4 mm seitlich rechts vom Bregma und direkt vor der koronalen Naht für den Laser-Doppler. Es ist nicht notwendig, den gesamten Knochen zu bohren. Achten Sie darauf, nicht in die Dura mater einzudringen.
  8. Suchen Sie nach den Gefäßen, in denen der Laserdoppler den Blutfluss messen kann. Setzen Sie den Laserdoppler ein und überprüfen Sie die Werte. Ein Mindestwert von 100 FU ist erforderlich. Entfernen Sie das Mikroskop (Kunstlicht).
  9. Wenn die Werte immer noch akzeptabel sind, fügen Sie einen Tropfen Kleber hinzu, um die Sonde zu fixieren.
  10. Überprüfen Sie erneut, ob der Wert über 80 FU liegt. Wenn der Wert unter 80 FU liegt, entfernen Sie die Sonde und positionieren Sie sie neu, um einen Wert über 80 FU zu erreichen.
    HINWEIS: Der Wert FU ist eine willkürliche Einheit, die den zerebralen Blutfluss (CBF) angibt.

6. Induktion von SAB

  1. Führen Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel in der Mittellinie zwischen den Hemisphären, bis der Widerstand der Schädelbasis spürbar ist. Ziehen Sie die Nadel um 1 mm zurück, um eine korrekte Platzierung direkt vor dem Chiasma opticus zu gewährleisten.
  2. Drehen Sie die Nadel um 90° im Uhrzeigersinn, so dass die Nadelspitze nach rechts zeigt, um ein möglichst homogenes Ergebnis bei der Blutinjektion zu gewährleisten. Entfernen Sie den Stiletto (Abbildung 3).
  3. 15 Minuten lang ausgleichen und die Anästhesie anpassen, um einen mittleren arteriellen Blutdruck im Bereich von 80-100 mmHg zu erhalten.
  4. Führe eine Blutgasanalyse durch. Passen Sie die Anästhesiestufe entsprechend an.
  5. Entnahme von 500 μl Blut aus dem Schwanzkatheter mit einer 1-ml-Spritze mit einer stumpfen 23-G-Nadel.
  6. Füllen Sie den Totraum der Nadelkammer der Wirbelsäule mit Blut, um eine Luftinjektion zu vermeiden. Entfernen Sie die 23-G-Nadel aus der mit Blut gefüllten Spritze und vergewissern Sie sich, dass die Spritze 300 μl Blut enthält.
  7. Verbinden Sie die Spritze mit der Spinalnadel. Fassen Sie fest zu und injizieren Sie das Blut manuell, um die MAP zu übertreffen.
  8. Beobachten Sie einen steilen Anstieg des ICP und einen steilen Abfall des CBF auf dem Laptop.
    HINWEIS: Der CBF sollte mindestens 5 Minuten lang 50 % oder weniger als der Ausgangswert betragen, damit die Operation erfolgreich ist, siehe Abbildung 4. Scheinratten durchlaufen die Schritte 6.1-6.7 nicht, wodurch die Einführung der Spinalnadel in das Großhirn weggelassen wird, wodurch mögliche spontane Blutungen und iatrogene Hirnschäden minimiert werden.

7. Genesung und Erwachen

  1. 0,1 ml/100 g Tiergewicht von 5,0 mg/ml Carprofen und 1 ml/100 g tiergewicht isotonische Kochsalzlösung subkutan verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeiten vor der Verabreichung mindestens Raumtemperatur haben.
  2. Halten Sie die Ratte anschließend nach der SAB 30 Minuten lang unter Narkose.
  3. Entfernen Sie die Nadel, die Laser-Dopplersonde, und füllen Sie dann die Hohlräume mit Knochenwachs. Verschließen Sie den Schnitt mit zwei horizontalen Matratzennähten mit nicht resorbierbarem monofilem 4-0-Nahtmaterial.
  4. Um die ICP-Sonde für Injektionen in die Zisterne Magna zu verwenden, entfernen Sie den Silikonschlauch und setzen Sie einen punktgenauen Adapter in den Polyethylenschlauch ein.
  5. Wenn kein Eingriff geplant ist, schneiden Sie die einfache, unterbrochene Naht ab. Kürzen Sie die ICP-Sonde mit einer Schere so weit wie möglich und kleben Sie dann das Ende, um ein Austreten von Liquor zu verhindern. Verschließen Sie den Schnitt mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht.
  6. Nehmen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie sie in Rückenlage. Entfernen Sie die losen Nähte vom Schwanzschnitt.
  7. Legen Sie eine einzelne Naht proximal und tief in den arteriellen Katheter. Entfernen Sie den Katheter und binden Sie die Naht ab, um Blutungen zu vermeiden. Nähen Sie den Schwanzschnitt mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht.
  8. Schalten Sie das Isofluran aus.
  9. Reinigen Sie die Ratte und ihr Fell so gut wie möglich.
  10. Wenn der Pedalrückzugsreflex wiedererlangt ist und die Ratte eine Spontanatmung hat, wenn sie vom Beatmungsgerät entkoppelt ist, extubieren Sie es.
  11. Setzen Sie die Ratte in einen einzigen Käfig mit Futter und Wasser ad libitum. Stellen Sie eine Hälfte des Käfigs unter eine Heizplatte und setzen Sie die Ratte in diesen Bereich des Käfigs.
  12. Führen Sie die intrathekale Verabreichung durch, indem Sie den Pinport-Injektor an eine Präzisionsspritze anpassen, und verabreichen Sie die Behandlung über den Pinport-Adapter. Dieser Eingriff ist bei wachen Tieren durchführbar. Siehe Abbildung 5.

8. Entfernung der ICP-Sonde (falls nicht während der Operation entfernt)

Anmerkungen: Verwenden Sie ein Operationsmikroskop nach Ermessen des Chirurgen.

  1. Legen Sie die Ratte wie zuvor beschrieben in die Anästhesiekammer.
  2. Legen Sie die Ratte nach der Betäubung in Rückenlage in das Operationsfeld mit Heizkissen.
  3. Legen Sie die Nase in die Anästhesiemaske. Stellen Sie die Werte von O 2 auf 30 %, atmosphärische Luft auf 70 % und Isofluran auf2 % ein.
  4. Tragen Sie das Augengel kontinuierlich auf, um trockenen Augen entgegenzuwirken.
  5. Schneiden Sie die kaudale einfache unterbrochene Naht ab. Öffnen Sie den Schnitt und entfernen Sie das mögliche nekrotische Gewebe oder Blutgerinnsel.
  6. Kürzen Sie die ICP-Sonde mit einer Schere so weit wie möglich und kleben Sie das Ende, um das Austreten von Liquor (CSF) zu verhindern. Verschließen Sie den Schnitt mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht.
  7. Schalten Sie das Isofluran aus.
  8. Wenn die Ratte anfängt, sich zu bewegen, setzen Sie sie ad libitum in einen einzigen Käfig mit Futter und Wasser. Legen Sie eine Hälfte des Käfigs über eine Heizplatte und platzieren Sie die Ratte in diesem Bereich.
  9. Nach der Rückkehr in den gewohnten Zustand werden die Tiere in den ersten 15 Minuten in einem gemeinsamen Käfig unter Aufsicht wieder miteinander versorgt.

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Ergebnisse

Frauen haben im Vergleich zu Männern ein erhöhtes Risiko für aSAB. Trotzdem werden männliche Nagetiere hauptsächlich in Experimenten verwendet, da die Heterogenität des Brunstzyklus bei Weibchen möglicherweise verzerrt ist. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse stammen aus einer kürzlich veröffentlichten Publikation, in der weibliche und männliche Ratten verglichen wurden, was bestätigt, dass das Modell bei weiblichen Tieren ähnliche Ergebnisse liefert wie bei männlichen Tieren21. An d...

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Diskussion

Das prächiasmatische Einzelinjektionsmodell der SAB ahmt mehrere wichtige Elemente der menschlichen SAB nach, darunter den Anstieg der ICP, die Reduktion des CBF, die transiente globale Ischämie, die Hochregulation neuroinflammatorischer Marker und CVS 14,15,16,18,19,20. Die ICP-Sonde wurde auch als Port für die intrathekale ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

Die Arbeit wurde von der Lundbeck Foundation und dem Lundbeck Grant of Excellence (Nr. R59-A5404) unterstützt. Geldgeber spielten in keinem Teil des Manuskripts eine Rolle.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16 G peripherer VenenkatheterBD Venflon393229Nadel gekürzt, distal 1 cm gebogen. Flügel entfernt
Anästhesieglocke/ -kammerUnbekannt
BlutgasanalysatorRadiometerABL80
BlutdruckmessgerätAdinstrumentsML117Anschluss an Powerlab
Gebogene Pinzette, 12 cm x 3F.S.T11001-12Für die Anästhesie
Zylindrisches Kissen, 28 cm x 4 cmHausgemachtHergestellt aus OP-Tücher
DatenerfassungshardwareAdinstrumentsML870 Powerlab
DatenerfassungssoftwareAdinstrumentsLabChart 6.0
BohrerKMD1189
BohrreglerSilfradent300 IN
Flexible LeuchteSchottKL200
HeizkissenMinco1135
Injektionsnadel, 20 GKD Medical301300Anschluss an stereotaktischen
Rahmen ICP-MonitorAdinstrumentsML117Anschluss an Powerlab
Isofluran-VerdampferOhmedaTEC3
LaptopLenovoT410
Laser-Doppler-MonitorAdinstrumentsML191
Laser-Doppler-SondeOxford OptronicsMSF100XPAnschluss an Laser-Doppler-Monitor
Nadelhalter, 13 cmF.S.T12001-13Für die Anästhesie
Präzisionsspritze, 0,025 mLHamilton547407
Stereotaktischer RahmenKopf InstrumentsM900
OperationsmikroskopCarl ZeissF170
Naht NadelAllgaier1245Für Anästhesie
Temperaure ControllerCWE,INC.TC-1000
Schallkopf x 2AdinstrumentsMLT0699Anschluss an BP- und ICP-Monitor
BeatmungsgerätUgo Basile7025
Veterinär-SchermaschineAesculapGT421
3-zinkiger Blair-Retraktor, 13,5 cmAgnthos17022--13
Blunt Alm RetraktorF.S.T17008-07
Gebogene Pinzette, 12 cm x 2F.S.T11001-12
Nadelhalter, 13 cmF.S.T12001-13
Gerade Dumont Pinzette, 11 cmF.S.T11252-00
Gerade Hals-Moskito-Hämosta x 2F.S.T13008-12
Gerade Irisschere, 9 cmF.S.T14090-09
Gerade Vannas Schere, 10,5 cmF.S.T15018-10
SaugstäbchenKettenbach31603
Schwarzer Seidenfaden, 4-0, 5 x 15 cmVö mel14757
KnochenwachsAesculap1029754
Carbomer Augengel 2 mg/gParanova
WattestäbchenHeinz HerenzWA-1
Applikator mit Wattespitze x 4Selefa120788
Injektionsnadel, 23 G x2KD Medical900284Anschluss an den Absperrhahn. Entfernen des distalen Endes
Injektionsnadel, 23 G x3KD Medical900284Entfernen des distalen Endes. 2 verbindet sich mit dem Absperrhahn, 1 mit der
Spritze ICP-Sonde:HausgemachtHergestellt aus folgendem:
Polyethylenschlauch, 20 mmSmiths medical800/100/200Innendurchmesser (ID): 0,58 mm, Außendurchmesser (OD): 0,96 mm.
Silikonschlauch, 10 mmFisher15202710ID: 0,76 mm, AD: 2,4 mm.
Silikonschlauch, 2 mmFisher11716513ID: 1,0 mm, AD: 3,0 mm.
Mikro-HämatokritröhrchenMarke7493 11
OP-Handtuch, 45 cm x75 cmMö lnlycke800430
PinPort Adapter, 22 GInstechPNP3F22
PinPort InjektorInstechPNP3M
Polyethylenschlauch, 2 x 20 cmSmiths medical800/100/200Anschluss an Spritze. Durchmesser: 0,58 mm, Außendurchmesser: 0,96 mm.
GummibandUnknown
Skalpell, 10 KlingenKiato23110
Spinalnadel, 25 G x 3.5''Braun5405905-01
Hahnsystem, Discofix x 2Braun16494CAnschluss an Schallkopfnaht
, 4-0, Monofil, nicht resorbierbar x 3EthiconEH7145H
Spritze, 1 mLBD Plastipak1710023
Spritze, Luer-Lock, 10 mL x 4BD Plastipak305959Anschluss an den Schallkopf
Gewebekleber3M1469SB
0,5% Chlorhexidin-SpiritusFaaborg Pharma210918
Carprofen 50 mg/mLScanVet43715Verdünntes
IsofluranBaxter
Isotonische KochsalzlösungAmgros16404
Lidocain-Adrenalin 10 mg/5 µ g/mLAmgros16318

Referenzen

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