Summary
Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).
Abstract
A reprogramação cardíaca tornou-se uma terapia potencialmente promissora para reparar um coração danificado. Ao introduzir múltiplos fatores de transcrição, incluindo Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados em cardiomiócitos induzidos (iCMs). Esses iCMs, quando gerados in situ em um coração infartado, integram-se eletricamente e mecanicamente com o miocárdio circundante, levando a uma redução no tamanho da cicatriz e uma melhora na função cardíaca. Devido à eficiência, pureza e qualidade relativamente baixa da reprogramação dos iCMs, a caracterização dos ICMs continua sendo um desafio. Os métodos atualmente utilizados neste campo, incluindo citometria de fluxo, imunocytoquímica e qPCR, concentram-se principalmente na expressão genética e proteína específica do coração, mas não na maturação funcional dos ICMs. Desencadeada por potenciais de ação, a abertura de canais de cálcio fechados com tensão em cardiomiócitos leva a um rápido fluxo de cálcio na célula. Portanto, quantificar a taxa de influxo de cálcio é um método promissor para avaliar a função cardiomiócito. Aqui, o protocolo introduz um método para avaliar a função do ICMS por fluxo de cálcio (Ca2+). Uma cepa de rato αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 foi estabelecida cruzando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referido como Myh6-Cre abaixo) com gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo). Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) de camundongos neonatais P0-P2 foram isolados e cultivados in vitro, e uma construção policistrônica de MGT foi introduzida aos NCFs, o que levou à sua reprogramação para iCMs. Como somente os iCMs reprogramados com sucesso expressarão o repórter GCaMP3, a maturação funcional dos iCMs pode ser avaliada visualmente pelo fluxo Ca2+ com microscopia de fluorescência. Em comparação com os NCFs não reprogramados, os NCF-iCMs apresentaram fluxo transitório de cálcio significativo e contração espontânea, semelhante aos CMs. Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento da cepa do camundongo, isolamento e seleção de corações de camundongos neonatais, isolamento de NCF, produção de retrovírus para reprogramação cardíaca, indução de ICMS, avaliação do fluxo de ICMS Ca2+ utilizando nossa linha de repórteres, e análise estatística relacionada e apresentação de dados. Espera-se que os métodos aqui descritos forneçam uma plataforma valiosa para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca.
Introduction
O infarto do miocárdio (MI) é uma doença grave em todo o mundo. As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo e respondem por aproximadamente 18,6 milhões de mortes em 20191,2. A mortalidade total de DCV diminuiu ao longo do último meio século. No entanto, essa tendência tem sido desacelerada ou até mesmo revertida em alguns países não desenvolvidos1, o que exige tratamentos mais eficazes dos DCV. Como uma das manifestações fatais da DCV, o MI é responsável por cerca de metade de todas as mortes atribuídas aos DCV nos Estados Unidos2. Durante a isquemia, com o bloqueio das artérias coronárias e o fornecimento limitado de nutrientes e oxigênio, o miocárdio sofre alterações metabólicas graves, prejudica a função sistólica dos cardiomiócitos (CMs), e leva à morte de CM3. Inúmeras abordagens na pesquisa cardiovascular têm sido exploradas para reparar lesões cardíacas e restaurar a função do coração ferido4. A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia promissora para reparar o coração danificado e restaurar sua função5,6. Ao introduzir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados para iCMs in vitro e in vivo, e esses iCMs podem reduzir a área da cicatriz e melhorar a função cardíaca7,8.
Embora a reprogramação cardíaca seja uma estratégia promissora para o tratamento de MI, ainda há uma série de desafios. Em primeiro lugar, a eficiência, pureza e qualidade da reprogramação nem sempre são tão altas quanto o esperado. O indução MGT só pode atingir 8,4% (cTnT+) ou 24,7% (αMHC-GFP+) do total de CFs a serem reprogramados para iCMs in vitro7, ou até 35% in vivo8, o que limita sua aplicação. Mesmo com mais fatores induzidos no sistema, como Hand29 ou Akt1/PKB10, a eficiência de reprogramação ainda é pouco satisfatória para ser usada em um ambiente clínico. Assim, mais estudos focados na melhoria da eficiência de reprogramação são necessários neste campo. Em segundo lugar, as características de integridade elétrica e contração dos ICMs são importantes para a melhoria eficiente da função cardíaca, mas estas são desafiadoras de avaliar. Atualmente, métodos de avaliação amplamente utilizados no campo, incluindo citometria de fluxo, imunocitoquímica e qPCR de algumas expressões fundamentais de genes de CMs, estão todos focados na similaridade de iCMs e CMs, mas não diretamente relacionados com as características funcionais dos ICMs. Além disso, esses métodos têm procedimentos relativamente complicados e são demorados. Enquanto os estudos de reprogramação geralmente envolvem uma triagem de potenciais fatores de reprogramação que promove a maturação do ICMs11, a reprogramação cardíaca exige um método rápido e conveniente baseado na função iCMs.
Os CMs abrem os canais de íons de cálcio fechados de tensão no citomembano durante cada ciclo de contração, o que leva a um fluxo transitório de íon de cálcio (Ca2+) do fluido intercelular ao citoplasma para participar da contração do miofilamento. Tal fluxo ca2+ e ciclo outflux é o traço fundamental da contração do miocárdio e constitui a função normal dos CMs12. Assim, um método que detecta o fluxo de Ca2+ pode ser uma maneira potencial de medir a função de CMs e células semelhantes a CM, incluindo iCMs. Além disso, para os ICMs, tal método fornece outra forma de avaliar a eficiência da reprogramação.
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para indicar atividades celulares, especialmente potenciais de ação. Geralmente, os GECIs consistem em um domínio de ligação Ca2+ , como calmodulin, e um domínio fluorescente como o GFP, e o GCaMP3 é um com alta afinidade e intensidade de fluorescência. O domínio de fluorescência do GCaMP3 será ativado quando a concentração local de cálcio for alterada13. Neste artigo, uma cepa de rato que expressa especificamente um repórter GCaMP3 em células Myh6+ é descrita. Ao introduzir o MGT nos NCFs isolados dos recém-nascidos desta cepa, a reprogramação pode ser monitorada por fluorescência, que irá exibir com sucesso iCMs reprogramados. Tal cepa e método do rato fornecerá uma plataforma valiosa para investigar a reprogramação cardíaca.
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Protocol
Todos os procedimentos e práticas experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Todos os procedimentos experimentais e práticas envolvendo a cultura celular devem ser realizados no Gabinete de Segurança Biológica BSL2 em condições estéreis. Para os procedimentos e práticas envolvendo vírus, seguiu-se a diretriz do descarte adequado de células transfeinadas, pontas de pipeta e tubos para evitar o risco de riscos ambientais e à saúde.
1. Estabelecimento de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (referido como Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) cepa de rato (Figura 1)
- Prepare a estirpe do rato Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (009074 de estoque de laboratório jackson, referido como Myh6-Cre) e Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Cepa de rato Hze/J (014538 de estoque de laboratório jackson, referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectivamente.
- Crie cada cepa até 8 semanas de idade para obter camundongos Myh6-Cre adultos e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivamente.
- Crossbreed o adulto Myh6-Cre e os ratos Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
NOTA: Configure Myh6-Cre masculino/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 feminino ou vice-versa. Não há diferença significativa entre seus descendentes. Normalmente, os camundongos fêmeas darão à luz 8-10 filhotes 19-21 dias após a cruzamento.
2. Isolamento e seleção de corações de camundongos myh6-cre/rosa26A-flox-stop-flox-GCaMP3 neonatantes.
- Obtenha filhotes P0-P2. Certifique-se de que 8-10 filhotes estão presentes para isolar 10 milhões de NCFs com este protocolo.
- Anestesiaram profundamente os filhotes por hipotermia. Coloque os filhotes em uma luva de látex e mergulhe até o pescoço em gelo e água esmagados (2°C - 3°C).
- Higienize brevemente os filhotes com 75% de etanol.
- Sacrifique os filhotes por decapitação com tesouras estéreis.
- Faça uma incisão horizontal perto do coração, aperte o coração e, em seguida, isole-o separando-o na raiz da aorta com uma tesoura.
- Observe o coração batendo sob um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que os corações com genótipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mostre fluxo Ca2+ indicado por GCaMP3 com batimentos cardíacos. Os outros genótipos não mostram fluorescência (Figura 2, Vídeo 1 e Vídeo 2).
3. Isolamento de fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs)
NOTA: Por esta parte, o protocolo do Laboratório14 do Dr. Li Qian foi adotado com pequenas otimizações quando aplicável a este estudo.
- Após o isolamento dos corações αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, corte-os em quatro pedaços que estão vagamente conectados. Lave-os em DPBS gelados em uma placa de 6 cm completamente várias vezes para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas.
- Transfira os corações para um tubo cônico de 15 mL.
- Digerir os corações com 8 mL de aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA a 37 °C por 10 min.
- Descarte o supernatante de trippsina e adicione 5 mL de colagenase tipo II quente (0,5 mg/mL) em HBSS.
- Vortex a mistura completamente, e incubar a 37 °C por 5 min.
- Após a incubação, o vórtice completamente e deixe o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.
- Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mL com fibroblasto frio de 5 mL (FB) médio (IMDM com 20% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina).
- Repita as etapas 3.4-3.7 para o tecido não digerido 4-5 vezes.
- Colete todos os supernaspentes juntos e filtre o supernante com um coador de 40 μm.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
- Resuspengem as células em 10 mL de tampão de classificação celular ativado por magnético (tampão MACS; 1x PBS com 2 mM EDTA e 0,5% BSA).
- Determine o número de celular viável por coloração azul trypan.
- Retire 10 μL de células a partir de 10 mL de suspensão celular na etapa 3.11.
- Misture com 10 μL de solução azul trypan de 0,4% e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Adicione a mistura a um hemócito e determine o número viável da célula. As células mortas estão manchadas de azul, enquanto as células viáveis estão sem manutenção.
- Centrifugar as células a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o sobrenante.
- Resuspend as células com 10 μL de microesferas Thy1.2 em 90 μL de tampão MACS refrigerado para menos de 10 milhões de células viáveis. Adicione mais contas proporcionalmente se houver mais de 10 milhões de células viáveis. Pipeta bem a mistura e incuba a 4 °C por 30-60 min.
- Adicione 10 mL de tampão MACS e misture bem.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min, descarte o supernaspe.
- Repita as etapas 3.15-3.16 uma vez.
- Resuspense as células e contas com 2 mL de tampão MACS.
- Configure um separador MACS no capô. Insira uma coluna LS no separador e equilibre a coluna com 3 mL de tampão MACS.
- Quando a coluna LS estiver equilibrada, passe as células através da coluna.
- Lave a coluna LS com 2 mL de tampão MACS três vezes.
- Tire a coluna do separador, elute-a com 2 mL de tampão MACS três vezes e, em seguida, colete a elução a um tubo de 50 mL.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min e descartar o supernatante.
- Resuspend as células com 5 mL de mídia FB.
- Determine o número da célula com um hemócito.
- Diluir as células com mídia FB e semear as células em pratos ou pratos conforme desejado. Certifique-se de que a densidade de semeadura celular é em torno de 2-2,5 x 104 células/cm2 (otimizar a densidade com base em experimentos individuais). Certifique-se de que os fibroblastos conectados tenham uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura (Figura 3).
4. Produção de retrovírus codificando vetor MGT policstrônico para reprogramação cardíaca
- Mantenha Plat-E com mídia de cultura Plat-E (DMEM suplementada com 10% FBS, 1 μg/mL de puromicina e 10 μg/mL de blasticidina) a 37 °C com 5% de CO2.
- No primeiro dia, divida o Plat-E para uma placa de 6 poços a aproximadamente 4-5 x 105 células/densidade do poço.
- No dia 2, o Plat-E normalmente atinge 80% de confluência. Transfetá as células com os seguintes procedimentos. Ajuste o volume e a quantidade de cada elemento aqui presente com base em cada poço em uma placa de 6 poços.
- Diluir 2 μg de pMX-puro-MGT de expressão retrovírus policistrônico vetor plasmídeo (Addgene 111809) a 500 ng/μL com tampão TE.
- Prepare a mistura de transfecção misturando 10 μL de Lipofectamina com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
- Enquanto isso, prepare uma mistura de plasmídeo misturando o plasmídeo com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
- Misture cuidadosamente as duas misturas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. A solução pode parecer nebulosa.
- Adicione a mistura gota a gota às células para ser transfeinada.
- Incubar as células a 37 °C durante a noite.
- No dia 3, mude o meio para um meio de cultura celular completo fresco sem puramicina e blasticidina.
- No dia 4, 48h após a transfecção, recolhe o supernatante que contém retrovírus e armazena-o em 4 °C.
- No dia 5, 72 h após a transfecção, recolha o supernatante que contém retrovírus.
- Filtre tanto a supernasce de 48 h quanto 72 h com um filtro de 0,45 μm, precipitar durante a noite a 4 °C adicionando 1/5 volume de 40% de solução poly (etileno glicol) (PEG) para fazer uma concentração final de 8% de PEG.
- Centrifugar a 4.000 x g por 30 minutos para precipitar o vírus.
NOTA: O vírus PEG8000 forma uma pequena precipitação branca. - Resuspenja o vírus com o meio de ICMS contendo 8 μg/mL de polibrene conforme desejado. Use o retrovírus imediatamente.
5. Reprogramação de NCFs para iCMs com infecção por retrovírus de codificação MGT
- Crescer ou passar NCFs antes da infecção pelo vírus.
NOTA: Normalmente, o NCF pode ser passagem duas vezes. - No dia 0, sementes NCF para a densidade em torno de 1-2 x 104 células/cm2 em meio FB.
- No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um meio contendo vírus para cada um bem como desejado. Use o vírus de um poço Plat-E em uma placa de 6 poços para infectar dois poços em uma placa de 24 poços. Titer o vírus para determinar a concentração ideal do vírus.
NOTA: Vírus contendo outros fatores de reprogramação de interesse podem ser introduzidos juntamente com o retrovírus MGT. - Incubar a 37 °C durante a noite.
- No dia 2, 24 h após a infecção pelo vírus, substitua o meio contendo vírus para um meio regular de ICMS.
- Para monitorar a expressão GCaMP3, emplaque-a sob um microscópio de fluorescência invertida. Sob 10x no canal GFP, observe a leve fluorescência basal GCaMP3 de uma porção de células já no dia 5.
- Substitua o meio a cada 2-3 dias durante a reprogramação. Se necessário, realize uma seleção positiva para células infectadas por retrovírus MGT adicionando 2 μg/mL de puramicina ao meio de cultura por 3 dias e mantendo-a a 1 μg/mL.
NOTA: Introduzir produtos químicos de interesse (por exemplo, IGF-1, MM589, A83-01 e PTC-209, referido como IMAP como noticiamos anteriormente15) juntamente com a alteração média. - Após 14 dias de infecção, substitua o meio por meio B27 para induzir ainda mais a maturação do ICMS.
6. Avaliação da maturação funcional do ICMS e eficiência de reprogramação pelo fluxo Ca2+
NOTA: Adicione isoproterenol de 1 μM às células a serem avaliadas antes da avaliação, se necessário.
- Avalie o fluxo ca2+ com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente.
- No canal GFP, observe as células GCaMP3+ abaixo do objetivo de 10x. Certifique-se de que ele mostra uma célula espontânea batendo no canal de campo brilhante.
- Selecione aleatoriamente três campos abaixo de 20x e regise o fluxo ca2+ dos iCMs por 3 minutos para cada campo.
NOTA: Aqui, o fluxo Ca2+ foi sincronizado com a batida celular espontânea (Figura 4, Figura 5 e Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7, Vídeo 8). - Quantifique manualmente as células com fluxo Ca2 +.
7. Análise estatística e apresentação de dados
- Analise as diferenças entre os grupos de análise unidirecional de variância (ANOVA) e realize os testes de comparação múltipla Student-Newman-Keuls.
NOTA: Os resultados são tão médios ± S.E com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Cada experimento foi realizado pelo menos três vezes.
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Representative Results
O fluxo de trabalho experimental para gerar a cepa de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a estrutura genética dos camundongos transgênicos é mostrado na Figura 1. Enquanto a cepa do camundongo é estabelecida, os corações dos filhotes foram isolados e observados sob um microscópio de fluorescência reversa para confirmar o genótipo. Corações com genótipo correto mostram fluxo Ca2+ sincronizado com batida, visualizado como fluorescência GCaMP3, enquanto nenhuma fluorescência foi observada em corações de controle (Figura 2, Vídeo 1 e Vídeo 2). Os NCFs isolados se anexarão ao poço dentro de 2h e mostrarão uma forma oval a redonda 1 dia após a semeadura (Figura 3). A maturidade funcional e a eficiência de reprogramação dos iCMs foram avaliadas pelo fluxo Ca2+ 14 dias após a introdução do MGT. As células reprogramadas podem ser avaliadas sob um microscópio de fluorescência para medir o fluxo ca2+. As células GCaMP3+ podem ser encontradas em ambos os grupos IMAP e MGT, enquanto o grupo IMAP mostra significativamente mais células GCaMP3+ e células com padrões de oscilação Ca2+ mais próximos dos CMs normais (Vídeos 3-8). Como mostrado na Figura 4A, uma célula representativa no grupo IMAP com oscilação Ca2+ mostrará a variação de fluorescência GCaMP3 entre o máximo (painel médio) e o mínimo (painel direito), e a oscilação Ca2+ dessas células é periodicamente alterada (Figura 4B). Após a introdução do IMAP, o número de clusters de batida foi significativamente maior do que no grupo controle, uma vez que o número de células GCaMP3+ com fluxo Ca2+ por campo de alta potência (HPF, lente objetiva de 20x) foi aumentado no grupo IMAP-médio-tratado (Figura 5).
Figura 1: Gerando myh6-cre/rosa26A-flox-stop-flox-GCaMP3 cepa de mouse. Ilustração da geração de cepas de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a estrutura genética dos camundongos transgênicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo ca2+ do coração pulsante. A fluorescência GCaMP3 foi sincronizada com batimentos cardíacos nos corações Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (painel superior), enquanto nenhuma fluorescência foi observada em corações de controle (painel inferior). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: NCFs isolados ligados a uma placa de 6 poços. (A) NCFs sob campo de baixa potência (LPF, objetivo de 10x, barra de escala = 100 μm). (B) NCFs em campo de alta potência (20x objetivo, barra de escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fluxo ca2+ de células reprogramadas. (A) NCFs tratados com IMAP reprogramados para iCMs sob canal GFP em campo de alta potência (objetivo de 20x). O fluxo ca2+ de iCMs foi visualizado como fluorescência GCaMP3, em que células com fluxo Ca2+ mostram flash repetidos entre fluorescência básica (Ca2+ min, painel médio) e fluorescência brilhante (Ca2+ max, painel direito) sincronizadas com batida. (B) Curva de traço ca2+ das células de oscilação Ca2+ no grupo IMAP. Barra de escala = 50 μm. F/F0: intensidade relativa de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figura 5: Avaliação do fluxo ca2+ no meio IMAP. Número de células GCaMP3+ com fluxo Ca2+ por HPF 2, 3, 4 semanas após a indução de MGT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Um coração batendo isolado de filhotes com αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genótipo sob lente objetiva de digitalização (objetivo 4x) no canal GFP. O coração é GCaMP3+ e piscando entre fluorescência básica (Ca2+ min) e fluorescência brilhante (Ca2+ max) sincronizada com batida. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Um coração batendo isolado de filhotes com genótipo de controle sob lente objetiva de varredura no canal GFP. O coração é GCaMP3- e não mostra fluorescência piscando sincronizada com batida. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: iCMs no grupo IMAP sob LPF no canal campo brilhante (BF). Uma célula com espancamento significativo no centro do campo pode ser vista. Tanto o Vídeo 3 quanto o Vídeo 4 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 4: iCMs no grupo IMAP em LPF no canal GFP. Podem ser observadas múltiplas células com fluorescência piscante, incluindo a célula de espancamento vista no canal BF. Tanto o Vídeo 3 quanto o Vídeo 4 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 5: iCMs no grupo IMAP sob HPF no canal BF. O centro do campo de Vídeo 3 e Vídeo 4 foi observado sob HPF. Uma célula com espancamento significativo no centro do campo pode ser observada. Tanto o Vídeo 5 quanto o Vídeo 6 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 6: iCMs em grupo IMAP sob HPF no canal GFP. Parte central do campo do Vídeo 3 e Vídeo 4 foi observada sob HPF. Podem ser observadas múltiplas células com fluorescência piscante, incluindo a célula de espancamento vista no canal BF. Tanto o Vídeo 5 quanto o Vídeo 6 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 7: iCMs em grupo MGT sob HPF no canal BF. Em contraste com as células de batida significativas observadas no grupo IMAP, existem algumas células de batida sob o canal BF no grupo MGT, que tem menor eficiência de reprogramação. Tanto o Vídeo 7 quanto o Vídeo 8 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 8: iCMs em grupo MGT sob HPF no canal GFP. Várias células com fluorescência leve e piscando podem ser observadas. Tanto o Vídeo 7 quanto o Vídeo 8 se concentram no mesmo campo. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Avaliar a função iCMs é necessário para o campo de reprogramação cardíaca. Neste manuscrito, o protocolo descreve uma cepa de camundongos Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J linhagem de camundongos que foi estabelecida, como usar os NCFs isolados dos camundongos neonatais nesta cepa para a reprogramação para iCMs, e a avaliação da função iCMs por ca2+ flux. Trata-se de um método de novo para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs.
Várias etapas críticas são importantes para reprogramar e avaliar com sucesso com este método. Em primeiro lugar, os NCFs devem ser recém-preparados e saudáveis após o isolamento. Um procedimento rápido de isolamento cardíaco e corte é essencial. Mais importante, é crucial seguir o tempo de incubação para evitar a super digestão e a redução da viabilidade e condição celular. Em segundo lugar, entre todos os procedimentos, a eficiência da infecção por vírus muitas vezes introduz alta variação nos resultados. A eficiência da infecção por vírus é influenciada principalmente por dois fatores. Por um lado, o titulador do vírus deve ser constante entre diferentes tentativas, o que requer consistência na quantidade de plasmídeos transfectados e condição e densidade celular plat-E semelhantes. Os pesquisadores que seguem este protocolo devem avaliar a densidade e o tempo ideal de semeadura antes desses procedimentos. O vírus deve ser usado imediatamente para evitar atenuação de titer devido à sensibilidade do vírus aos ciclos de congelamento. Além disso, é importante manter os NCFs em uma condição saudável e densidade adequada no momento da infecção. Os pesquisadores devem estar familiarizados com as características de crescimento dos NCFs. Embora a variação de eficiência de reprogramação deva ser limitada, o monitoramento frequente pode ser útil. Este protocolo pode ser facilmente modificado para co-infectar NCFs com diferentes vírus ou tratá-los com produtos químicos de interesse. Assim, é aplicável como um método universal para pesquisa de reprogramação cardíaca. Além dos pontos aqui mencionados, as questões comuns com este método incluem baixa fluorescência observada após a reprogramação. Isso pode ser devido a várias razões. Em primeiro lugar, a infecção pode não ser tão eficaz quanto o desejado, o que leva a uma baixa eficiência de reprogramação e limita o número de iCMs. Em segundo lugar, a condição de exposição pode precisar ser ajustada de forma ideal para a observação da fluorescência GCaMP3 dos iCMs. O uso de cardiomiócitos neonatais isolados dos mesmos filhotes como controle positivo ajudará a identificar o potencial motivo.
O fluxo de Ca2+ tem sido amplamente utilizado para avaliar as atividades celulares, incluindo em células neurônios16, glândula mamária17, tecidos gordos18, etc. Neste estudo, o fluxo ca2+ foi utilizado para avaliar a maturação funcional dos ICMs. Anteriormente, foi relatado que o fluxo ca2+ pode ser medido por produtos químicos específicos chamados corantes sensíveis ao cálcio de pequenas moléculas que podem ser usados para avaliar a função das células reprogramadas19. No entanto, tal método tem várias limitações: o produto químico introduzido nas células pode ter toxicidade potencial e influenciar os processos celulares, tornando os resultados menos confiáveis do que os obtidos com o método aqui apresentado. Além disso, o processo de coloração é complicado e demorado, evitando também novas avaliações dessas células. O método aqui apresentado, por outro lado, supera essas limitações. O GCaMP3 não é invasivo para as células, o que minimiza as influências nas atividades celulares e permite uma avaliação mais aprofundada das células. Uma vez que a fluorescência dos iCMs depende apenas de sua identidade, ou seja, expressão Myh6 e mudança de concentração local de Ca2+, a fluorescência de fluxo ca2+ das células torna-se visível desde que as NCFs sejam reprogramadas, o que permite o monitoramento frequente do processo de reprogramação sem uma estratégia demorada. Enquanto o fluxo ca2+ pode ser monitorado e registrado facilmente sob um microscópio de fluorescência invertida, a repetida batida e atividade eletrônica relacionada através da membrana celular, ou seja, fluxo Ca2+, pode ser quantificada temporalmente 20. Como mostrado na Figura 4B, tal quantificação pode fornecer mais informações sobre a maturidade dos iCMs e ilustrar estruturas mais detalhadas da mudança de fluxo de Ca2+ durante a reprogramação cardíaca.
Este método tem várias vantagens. Em primeiro lugar, o fluxo Ca2+ é observado exclusivamente em iCMs. Como Myh6 é muito específico para CMs, mas não CFs, apenas as células reprogramadas com sucesso expressarão o repórter GCaMP3 e se tornarão fluorescentes. Em segundo lugar, o fluxo Ca2+ fornece uma maneira de avaliar a maturação funcional dos iCMs além do método de monitoramento da expressão de genes específicos do CM. Devido ao procedimento experimental relativamente longo e à variação ligada a isso, a função dos ICMs nem sempre é aceitável para estudos mais aprofundadas e potencial uso clínico. Enquanto a expressão genética específica do CM só revela uma parte das características da célula reprogramada, o fluxo ca2+ fornece outro aspecto do campo de reprogramação cardíaca para avaliar a qualidade e eficiência celular reprogramada. Além disso, a maturação funcional está mais relacionada à função cardíaca, o que pode ser um indicador melhor para avaliar a eficiência. Métodos amplamente utilizados neste campo incluem citometria de fluxo, uma técnica que requer digestão de trippsina de todos os grupos celulares. Embora a digestão possa influenciar as funções e características celulares, introduz variação ao sistema, diminuindo o potencial de reprodução dos resultados observados e avaliando ainda mais essas células. Em comparação com esses métodos, a cepa de camundongos transgênicos mostrada aqui limitou a influência potencial de produtos químicos ou procedimentos experimentais necessários para a avaliação. Com essas vantagens, essa cepa do camundongo simplifica os procedimentos de avaliação necessários para a reprogramação cardíaca e aumenta a reprodutibilidade dos resultados neste campo.
No entanto, existem algumas limitações para este estudo. Primeiro, o estabelecimento de cepas de rato é demorado. As consultas sobre a tensão do rato dos colegas deste campo são bem-vindas para encurtar o tempo necessário para o estabelecimento da cepa. Em segundo lugar, a reprogramação cardíaca para iCMs com este protocolo envolve múltiplos fatores e etapas, que introduzem variação relativamente alta ao sistema. A proficiência neste campo ajudará a superar essa questão. Finalmente, como o GCaMP3 torna-se fluorescente apenas sob a condição de fluxo Ca2+ , o método de avaliação atual não pode ser usado diretamente para FACS como reprogramação cardíaca com myh6-GFP strain7. No entanto, embora a tensão atual tenha mais e diferentes aplicações em comparação com a tensão Myh6-GFP, tal inconveniente pode ser superado.
No geral, como o protocolo descreveu acima, a cepa de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-GCaMP3 e após avaliação da maturação dos ICMs fornecem uma estratégia para monitorar todo o processo de reprogramação cardíaca. Esta estratégia de medição de fluxo Ca2+ mediada por GCaMP3 pode ser realizada em células vivas sem prejudicar a viabilidade celular. Como a fluorescência GCaMP3 é impulsionada pela expressão genética específica do miocárdio, os dados fluorescentes GCaMP3 adquiridos podem ser quantificados para revelar a eficiência de reprogramação e a atividade dos ICMs.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos os esforços de Leo Gnatovskiy na edição do texto em inglês deste manuscrito. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) dos Estados Unidos (1R01HL109054) para o Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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