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Methodenartikel

Anterior Segment Organ Culture Platform zur Verfolgung von Open Globe Verletzungen und therapeutischer Leistung

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DOI:

10.3791/62649

⸱

25. August 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Open-Globe-Augenverletzungen können in ländlichen oder militärrelevanten Szenarien mehrere Tage unbehandelt bleiben, was zu Blindheit führt. Therapeutika werden benötigt, um den Verlust des Sehvermögens zu minimieren. Hier beschreiben wir ein Organkultur-Open-Globe-Verletzungsmodell. Mit diesem Modell können mögliche Therapeutika zur Stabilisierung dieser Verletzungen richtig bewertet werden.

Zusammenfassung

Open-Globe-Verletzungen haben schlechte visuelle Ergebnisse, was oft zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führt. Dies ist zum Teil auf eine längere Verzögerung zwischen Verletzungen und medizinischen Eingriffen in ländlichen Umgebungen und militärmedizinischen Anwendungen zurückzuführen, bei denen die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist. Unbehandelte Verletzungen sind anfällig für Infektionen, nachdem das Auge seine wasserdichte Versiegelung verloren hat, sowie verlust der Gewebelebensfähigkeit aufgrund von intraokularer Hypotonie. Therapeutika zur vorübergehenden Abdichtung von Verletzungen mit offenem Globus können, wenn sie richtig entwickelt wurden, den Augeninnendruck wiederherstellen und Infektionen verhindern, bis eine ordnungsgemäße Augenheilkunde möglich ist. Um die Produktentwicklung zu erleichtern, wird hier die Verwendung einer offenen Globus-Verletzungsplattform für die organkulturelle Anterior-Segment zur Verfolgung der therapeutischen Leistung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzung detailliert beschrieben. Porcines vorderes Segmentgewebe kann in speziell angefertigten Organkulturschalen gehalten und bei physiologischem Augeninnendruck gehalten werden. Punktionsverletzungen können mit einem pneumatisch angetriebenen System erzeugt werden, das Verletzungsgrößen von bis zu 4,5 mm Durchmesser erzeugen kann, ähnlich wie militärisch relevante Verletzungsgrößen. Ein Verlust des Augeninnendrucks kann 72 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden, was die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion und den Verlust der wasserdichten Augendichtung bestätigt. Die therapeutische Leistung kann durch Anwendung auf das Auge nach Verletzungsinduktion und anschließender Verfolgung des Augeninnendrucks für mehrere Tage verfolgt werden. Darüber hinaus ist das Anterior-Segment-Verletzungsmodell auf weit verbreitete Methoden zur funktionellen und biologischen Verfolgung der Physiologie des vorderen Segments anwendbar, wie z. B. die Beurteilung von Transparenz, Augenmechanik, Hornhautepithelgesundheit und Gewebelebensfähigkeit. Insgesamt ist die hier beschriebene Methode ein notwendiger nächster Schritt zur Entwicklung von Biomaterialtherapeutika zur vorübergehenden Versiegelung von Verletzungen am offenen Globus, wenn die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist.

Einleitung

Open Globe (OG)-Verletzungen können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie nach einer Verletzung nicht behandelt oder zumindest stabilisiert werden1. Verzögerungen sind jedoch in abgelegenen Gebieten weit verbreitet, in denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen nicht ohne weiteres möglich ist, wie in ländlichen Gebieten oder auf dem Schlachtfeld in militärischen Szenarien. Wenn die Behandlung nicht ohne weiteres verfügbar ist, besteht der derzeitige Behandlungsstandard darin, das Auge mit einem starren Schild zu schützen, bis ein medizinischer Eingriff möglich ist. In der Militärmedizin beträgt diese Verzögerung derzeit bis zu 24 Stunden, aber es wird erwartet, dass sie in zukünftigen Kampfeinsätzen in städtischen Umgebungen, in denen eine Luftevakuierung nicht möglichist,auf bis zu 72 Stunden ansteigen wird2,3,4. Diese Verzögerungen können in ländlichen, abgelegenen zivilen Anwendungen, bei denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen begrenztist,noch länger sein5,6. Eine unbehandelte OG-Verletzung ist sehr anfällig für Infektionen und Verlust des Augeninnendrucks (IOP), da die wasserdichte Versiegelung des Auges beeinträchtigt ist7,8. Der Verlust des IOD kann die Lebensfähigkeit des Gewebes beeinträchtigen, so dass es unwahrscheinlich ist, dass ein medizinischer Eingriff das Sehvermögen wiederherstellt, wenn die Verzögerung zwischen Verletzung und Therapie zu lang ist9.

Um die Entwicklung einfach anzuwendender Therapeutika zur Abdichtung von OG-Verletzungen zu ermöglichen, bis ein Augenarzt erreicht werden kann, wurde zuvor ein Benchtop-OG-Verletzungsmodell entwickelt10,11. Bei diesem Modell wurden Hochgeschwindigkeitsverletzungen in ganzen Schweineaugen erzeugt, während IOD von Druckaufnehmern erfasst wurde. Therapeutika können dann angewendet werden, um ihre Fähigkeit zu beurteilen, die OG-Verletzungsstelle zu versiegeln12. Da dieses Modell jedoch ganze Schweineaugen verwendet, kann es nur die sofortige therapeutische Leistung beurteilen, ohne dass die längerfristige Leistung über das mögliche 72-Stunden-Fenster verfolgt werden kann, in dem das Therapeutikum die Verletzungsstelle stabilisieren muss, bis der Patient die Spezialbehandlung erreicht. Infolgedessen wurde ein anteriores Segment Organ Culture (ASOC) OG-Verletzungsmodell entwickelt und in diesem Protokoll als Plattform zur Verfolgung der langfristigen therapeutischen Leistungdetailliert beschrieben 13.

ASOC ist eine weit verbreitete Technik zur Aufrechterhaltung von avaskulärem Gewebe des vorderen Segments, wie der Hornhaut, für mehrere Wochen nach der Enukleation14,15,16,17. Das vordere Segment wird unter physiologischem IOD aufrechterhalten, indem Flüssigkeit mit physiologischen Durchflussraten durchschränkt wird und die trabekuläre Netzabflussregion, das Gewebe, das für die Regulierung des IOD verantwortlich ist, während des ASOC-Setups erhalten bleibt18,19. Die ASOC-Plattform kann Gewebe physiologisch erhalten, eine OG-Verletzung mit einem pneumatisch betriebenen Gerät induzieren, ein Therapeutikum anwenden und die Verletzungsstabilisierung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzungverfolgen 13.

Hier bietet das Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Methodik für die Verwendung der ASOC-Plattform. Zuerst wird beschrieben, wie die ASOC-Plattform eingerichtet und hergestellt wird. Als nächstes beschreibt das Protokoll, wie das vordere Segment aseptisch seziert und das trabekuläre Geflecht beibehalten wird, gefolgt von der Einrichtung von vorderem Segmentgewebe in speziell angefertigten Organkulturschalen. Dann wird beschrieben, wie man Open-Globe-Verletzungen erzeugt und therapeutisch unmittelbar nach der Verletzung anwendet. Schließlich bietet das Protokoll einen Überblick über Charakterisierungsparameter, die mit dieser Methode möglich sind, die funktionelle, mechanische und biologische Eigenschaften des Auges bewertet und wie gut die Verletzung stabilisiert wurde. Insgesamt bietet dieses Modell eine dringend benötigte Plattform, um die Produktentwicklung zur Stabilisierung und Behandlung von Open-Globe-Verletzungen zu beschleunigen und die Schlechtesichtprognose nach Verletzungen zu verbessern.

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Protokoll

Bevor Sie dieses Protokoll durchführen, beachten Sie, dass es rechtliche und ethische Anforderungen für die Verwendung von Tieren in Forschung und Ausbildung gibt. Wenn lebende Tiere als Quelle von Augengewebe verwendet werden, holen Sie vor Beginn die Genehmigung der örtlichen ethischen oder rechtlichen Behörde (IACUC oder Ethikkommission usw.) ein. Wenn es irgendwelche Fragen bei der Erlangung der Genehmigung für die Verwendung von Tieren gibt, fahren Sie nicht fort. Wir haben zuvor festgestellt und berichtet, dass frische Schweineaugen, die innerhalb von 24 Stunden post mortem erhalten und verwendet wurden, im Vergleich zur In-vivo-Physiologie am nächsten kamen und für diese Studien gut abgeschnitten haben (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Während dieses Protokolls wurden keine lebenden Tiere verwendet, wobei ein Gewebeverkäufer verwendet wurde, um Gewebe innerhalb von 24 Stunden zu erhalten.

HINWEIS: Vor der Ankunft des Gewebes werden die Organkulturschalen(Zusatzprotokoll 1),Klemmringe(Zusatzprotokoll 1),Schalenständer(Zusatzprotokoll 1),Druckaufnehmer-Datenerfassungsaufbau(Zusatzprotokoll 2)und pneumatische Punktionsplattform(Zusatzprotokoll 3)hergestellt. Sterilisieren Sie das Geschirr, die Werkzeuge und das Zubehör und bereiten Sie die Arbeitsbereiche vor. Es ist nützlich, einen nicht sterilen Bereich zu haben, um eine grobe Dissektion an den Augen durchzuführen, da sie normalerweise mit verbindendem, zusätzlichem Orbitalgewebe verbunden sind. Führen Sie diese ersten Schritte auf einer offenen, sauberen Arbeitsfläche aus und übertragen Sie die Augen dann aseptisch in einen BSC II-Schrank zur Mikrodissektion (Schrank Nr. 1). Optimalerweise ist der BSC II-Schrank, der für die Mikrodissektion verwendet wird, vom BSC II-Schrank (Schrank Nr. 2) getrennt, um den Luftstrom zu minimieren und den Arbeitsbereich zu maximieren. Richten Sie den Mikrodissektionsschrank mit einem Seziermikroskop und einer Möglichkeit zur Visualisierung der Arbeitsfläche (Kamera oder Okulare, die aus dem Schrank herausragen) ein.

1. Sterilisationsschritte, Verbrauchsmaterialien (siehe Materialtabelle für weitere Details) und Einrichtung

  1. Vorbereiten und Gassterilisieren sie die folgenden Elemente (1 Kit für jedes Auge): ASOC-Schüssel, Klemmring, zwei fluidische Anschlüsse mit O-Ringen, zwei 18 G-Nadelnaben, vier Schrauben, zwei Längen PE-100-Schläuche (die Länge des Abstands sollte lang genug sein, um sich von der Schüssel im Inkubator zur Spritzenpumpe und zum Datenerfassungsaufbau des Druckaufnehmers zu erstrecken), zwei 18 G 90° gebogene Nadelnaben, zwei 3-Wege-Ventile.
  2. Bereiten Sie die folgenden Kits vor und autoklavieren Sie sie.
    1. Bereiten Sie das Mikrodissektionsinstrumenten-Kit vor und autoklavieren Sie es, das eine feine Zange, eine Vannas-Schere, eine mittlere Zahnzette, eine große Schere, Wattestäbchen und eine Rasierklinge oder ein Skalpell enthält.
    2. Bereiten Sie das Montageinstrumentenset vor und autoklavieren Sie es, das eine Mittelzahnzette, eine chirurgische Schere und eine L-Taste enthält.
    3. Bereiten Sie das tägliche Kit (Menge: eines pro Kulturtag) vor und autoklavieren Sie es, das einen L-Schlüssel enthält, um die Klemmringe jeden Tag nach Bedarf an Geschirr festzuziehen.
    4. Autoklav vier 100 ml Becher zur Desinfektion und Lagerung von Augen und vorderen Segmenten.
    5. Autoklavieren Sie die Punktionsobjekte.
  3. Sammeln Sie die folgenden sterilen Gegenstände: Petrischale (1 Schüssel / Auge), Gaze (1-2 / Auge), Geschirrständer, 20 ml Spritzen (1 / Auge), 10 ml Spritzen (1 / Auge), Nylonspritzenfilter (1 / Auge).
  4. Sterile Medien vorbereiten: DMEM mit 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicin, 1x Antibiotika-Antimykotikum (AA; ca. 30-40 ml komplettes Medium/Auge).
  5. Bereiten Sie AA-PBS vor: PBS mit 1x AA (~ 500 ml).
  6. Bereiten Sie das Grobdissektionswerkzeugpaket vor: Reinigen und trocknen Sie große chirurgische Scheren und Einezette.
  7. Richten Sie den nicht sterilen Sezierarbeitsplatz ein: Sammeln Sie Vorräte aus groben Dissektionswerkzeugpackungen, enukleierten Schweineaugen, die in PBS und auf Eis getaunken sind, chirurgischen Vorhängen, 100-ml-Becherglas mit PBS. Legen Sie den chirurgischen Vorhang und die für die grobe Dissektion erforderlichen Gegenstände aus.
  8. Richten Sie den sterilen Sezierarbeitsplatz ein: Sammeln Sie Vorräte aus mikrodissektioniertem Instrumentenset, steriler Gaze, Seziermikroskop, Betadinlösung, sterilem PBS, sterilen Medien, vier sterilisierten 100-ml-Bechern, steriler Petrischale. Aseptische Übergabe an BSC II Schrank #1. Stellen Sie den Schrank für die Visualisierung der Augen auf dem Seziermikroskop auf.
  9. Richten Sie den ASOC-Montagearbeitsplatz ein: Sammeln Sie gassterilisierte Kits (Geschirr-Kit und Deckel-Kit), Montageinstrumenten-Kit, sterile Medien, Geschirrständer, sterile Petrischalen, sterile Spritzen und Spritzenfilter. Aseptische Übergabe an BSC II Schrank #2. Richten Sie den Schrank für die Tellermontage ein.
  10. Wenn die Augen stabilisiert und für die Punktion bereit sind (72 h nach dem Setup), übertragen Sie sie aseptisch in einen BSC II-Schrank. Richten Sie den OG-Verletzungsinduktionsarbeitsbereich ein: Pneumatisch betriebenes Verletzungsinduktionsgerät (Montage in Ergänzung 3beschrieben) und Lab Jack und Cross-Tracking-Schraubstock zum Halten der ASOC-Schüssel.

2. Dissektion von Gewebe

  1. Bereiten Sie das Schweinegewebe mit einem nicht sterilen Sezierarbeitsplatz vor.
    1. Beschaffen Sie enukleierte Schweineaugen von einem lokalen Schlachthof, Tierstudien oder Verkäufer. Halten Sie die Augen während der Lieferung auf Eis, das in PBS getaunken ist, und verwenden Sie es sofort nach dem Empfang.
    2. Schneiden Sie das extraorbitale Gewebe weg und trimmen Sie die Bindehaut, so dass nur die Hornhautschale und der Sehnerv übrig bleiben. Führen Sie die Dissektion unter nicht sterilen Bedingungen mit einer großen chirurgischen Schere und Einer zette in einem groben Dissektionswerkzeug durch.
    3. Legen Sie die Augen wieder in frisches PBS auf Eis, bis alle für den Versuchsaufbau erforderlichen Augen vorläufig / grob seziert wurden.
    4. Tauchen Sie die Augen für 2 min in geschlossene Behälter in 10% Betadinlösung und übertragen Sie sie aseptisch in den BSC II-Schrank Nr. 1. Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten unter sterilen Bedingungen durch, um Verunreinigungen während des Aufbaus zu minimieren.
  2. Sezieren Sie steril vordere Segmente.
    1. Nach 2 Minuten Betadinlösung die Augen in drei serielle Waschungen von sterilem AA-PBS überführen, um überschüssige Betadinlösung von der Augenoberfläche zu entfernen und gleichzeitig die Sterilität des Augengewebes zu erhalten. Nach drei Wäschen das Gewebe bis zur weiteren Verwendung in AA-PBS halten.
    2. Hemisektieren Sie das Auge mit einer Rasierklinge / Skalpell und einer gekrümmten Schere. Legen Sie das Auge auf eine AA-PBS-getränkte Gaze und erzeugen Sie einen Schnitt mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell in der Nähe des Augenäquators (60/40 geteilt mit 40 auf der vorderen Seite). Mit einer gekrümmten chirurgischen Schere das Auge hemisektieren, um das vordere Auge (Hornhauthälfte) zu isolieren.
      HINWEIS: Der Schnitt um das vordere Segment muss kontinuierlich sein, um gezackte, raue Kanten in der Sklera zu verhindern, die nach dem Aufbau in der Organkultur Flüssigkeitslecks erzeugen.
    3. Verwenden Sie Mikroscheren als Schaufel, um Glaskörper aus dem vorderen Segment zu schaufeln. Entfernen Sie die Linse mit einer Mikroschere aus dem vorderen Segment. Lassen Sie die vorderen Segmente in AA-PBS bis zu weiteren Sezierschritten.
      HINWEIS: Alle Augen, die seziert werden, können in diesem Schritt gehalten und nacheinander durch den Rest des Dissektionsprozesses geführt werden.
    4. Schneiden Sie mit einem Seziermikroskop die Iris allmählich radial zur Iriswurzel zurück, bis das trabekuläre Geflecht (TM) sichtbar ist. Das TM ist ein pigmentiertes Gewebe, das Fasern umfasst, die umlaufend um die hornhautklerale Schale herum ausgerichtet sind. Sorgfältige Schnitte in die Iris in Richtung iriswurzel legen die Tiefe des TM unter dem Gewebe frei.
    5. Schneiden Sie 360 ° um die Iris in der gleichen Tiefe wie der erste Schnitt in das Gewebe, um die gesamte TM-Region freizulegen. Reinigen Sie alle verbleibenden Irisreste, die TM abdecken, nach Bedarf.
    6. Schneiden Sie die Ziliarkörperreste hinter dem TM ab und lassen Sie nur ein dünnes Gewebeband nach dem TM-Bereich (ca. 1 mm).
    7. Platzieren Sie das sezierte vordere Segment (AS) in Medien, bis es in ASOC im BSC II-Schrank Nr. 2 weiter eingerichtet ist.
      HINWEIS: Alle Augen können an dieser Stelle vor der ASOC-Einrichtung gehalten werden, wenn ein einzelner Benutzer Dissektion und Organkulturschalenmontage durchführt.

3. Anstellen von vorderen Segmenten in Organkulturschalen

  1. Legen Sie ein einzelnes AS in eine Petrischale mit AS invertiert (Tasse hoch). Mit einem Wattestäbchen in den Medien benetzen und vorsichtig in die Mitte der Hornhaut tupfen, um Pigmente zu entfernen. Wischen Sie mit einer Zette, um das Auge und den gleichen Tupfer zu halten, den Wattestäbchen um die Sklera ab, um zusätzliches Pigment zu entfernen.
  2. Kehren Sie den AS um und legen Sie den unteren Teil des Gerichts über den erhöhten Bereich, wobei die Hornhaut über den erhöhten Bereich in der Schüssel zentriert wird. Legen Sie den Klemmring auf den neu platzierten AS.
  3. Setzen Sie vier Schrauben in die entsprechenden Löcher ein, um den Ring mit dem AS unter dem Ring zu halten. Ziehen Sie die Schrauben vorsichtig von Hand mit dem L-Key an.
    HINWEIS: Der Schraubschritt erfolgt täglich während des gesamten Experiments, daher besteht das Ziel des ersten Anziehens darin, sicherzustellen, dass das Medium nicht ausläuft und gleichzeitig das Brechen des Klemmrings vermieden wird.
  4. Legen Sie mit einem sterilen Petrischalenset die Oberseite über die Schüssel und kehren Sie das Setup um. Befestigen Sie den Geschirrständer. Befestigen Sie die fluidischen Anschlüsse mit O-Ringen an den Gewindeanschlüssen an der Unterseite der Schüssel.
  5. Befestigen Sie an einem fluidischen Stecker eine 18 G 90 ° gebogene Nadelnabe, eine Schlauchlänge, eine 18 G Nadelnabe, einen Nylonspritzenfilter, ein Dreiwegventil und eine 20 ml Spritze, die mit Medien gefüllt ist.
  6. Befestigen Sie am zweiten fluidischen Stecker eine um 18 G 90 ° Grad gebogene Nadelnabe, eine Länge des Schlauchs, eine 18 G Nadelnabe, ein Drei-Wege-Ventil und den Fassteil einer sterilen 10-ml-Spritze (dies fungiert als Reservoir zum Auffangen von Flüssigkeit und Blasen aus dem ASOC).
  7. Wenn sich drei Wegeventile entsprechend zu den Spritzen öffnen, drücken Sie das Medium vorsichtig durch das System, indem Sie den in Schritt 3.5 identifizierten Fluidik-Anschlussanschluss verwenden, um den AS aufzublasen, Medien in den Schlauch und schließlich in den Behälter zu füllen.
    HINWEIS: Wenn Medien in die ASOC-Schüssel eindringen, wird der AS mit dem Klemmring nicht fest genug gesichert.
  8. Entfernen Sie Blasen, indem Sie die Medien vorsichtig in die Schüssel drücken und die Schüssel umkehren, um die Blasen in das Reservoir zu drücken.
  9. Stellen Sie die Schüssel und stehen Sie aufrecht. Legen Sie den unteren Teil einer Petrischale unter die Füße des Ständers und achten Sie darauf, den Schlauch nicht zu verarsten.

4. Beginn der Organkultur des vorderen Segments

  1. ASOC ist nun bereit für die Inkubation. Legen Sie die ASOC-Schale in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2). Stellen Sie sicher, dass die Höhe der ASOC-Schüssel im Inkubator über den Druckaufnehmern bekannt ist und berücksichtigt wird, um den IOP genau zu berechnen (Zusatzprotokoll 4).
  2. Richten Sie die Schlauchleitungen durch den Boden der 37 °C, 5% CO2 Inkubatortür aus, damit sie das Öffnen und Schließen der Tür nicht stören. Befestigen Sie die 20-ml-Spritze an der Spritzenpumpe mit 2,5 μL/min.
  3. Positionieren Sie die Schlauchleitung mit dem Behälter am Druckaufnehmerinstrument. Schließen Sie das seitliche 3-Wege-Ventil an den Druckaufnehmer an, während PBS durch die Leitung fließt, um zu vermeiden, dass Luftblasen in die Schlauchleitungen eindringen.
    HINWEIS: Entleeren Sie das PBS aus den Reservoirs, nachdem das System eingerichtet wurde, um die Wahrscheinlichkeit einer Reservoirkontamination mit mikrobiellem Wachstum für die Dauer der Organkultur zu verringern.
  4. Initiieren Sie die IOP-Datenerfassung, indem Sie zunächst sicherstellen, dass eine microSD-Karte zum Speichern von Datendateien vorhanden ist. Schalten Sie dann die Einrichtung des Druckaufnehmers ein, um mit der Datenerfassung zu beginnen.
    HINWEIS: Details zur Einrichtung des Druckaufnehmer-Datenerfassungsgeräts finden Sie im Zusatzprotokoll 2.

5. Tägliche Wartung von ASOC

  1. Nachdem das ASOC 24 Stunden Zeit hatte, um auszugleichen, nehmen Sie das Geschirr aus dem 37 °C, 5% CO2 Inkubator und legen Sie es in den BSC II Schrank.
    HINWEIS: Bei der Druckdatenerfassung sehen diese Zeiträume wie Spitzen aus, da die ASOCs aus dem Inkubator entfernt (Höhenänderung) und im Schrank angepasst werden.
  2. Überprüfen Sie auf Lecks unter jeder Schüssel auf der Petriplatte. Falls vorhanden, überprüfen Sie die flüssigkeitsdichten Verbindungen unter der Schüssel und ziehen Sie sie bei Bedarf wieder fest. Überprüfen Sie die Schrauben im Klemmring mit einem sterilen L-Schlüssel auf Lecks in der Oberseite.
    HINWEIS: Das AS-Sklera-Gewebe komprimiert und reduziert die Dicke um 24 h, und der Klemmring muss angezogen werden.
  3. Saugen Sie die Medien gut aus dem Gericht ab.
    HINWEIS: Das Trabekelgeflecht filtert Flüssigkeit aus dem Medium, das in das ASOC gepumpt wird. Daher werden Medien in der ASOC-Schüssel entlang der Ränder vorhanden sein.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
  5. Füllen Sie die Spritzen an den Spritzenpumpen nach, stellen Sie sicher, dass die Spritzenpumpen funktionieren, und bestätigen Sie die Ausrichtung der Ventile für die Perfusion in das ASOC. Die ASOC-Schale in den 37 °C, 5% CO2 Inkubator zurückgeben.
    HINWEIS: Optimalerweise sollten diese Schritte täglich durchgeführt werden. Die Verwendung eines 20-ml-Startvolumens, des ASOC-Spülbrunnenvolumens und einer Pumpleistung von 2,5 μL/min sollte jedoch ausreichen, um das System mehrere Tage ungestört laufen zu lassen.

6. OG-Verletzungsinduktion mit pneumatisch betriebener Pannenvorrichtung

HINWEIS: Der Aufbau der pneumatischen Einstichvorrichtung ist im Zusatzprotokoll 3 beschrieben. OG-Verletzungen werden induziert, nachdem sich der IOD stabilisiert hat, was normalerweise nach 3 Tagen in Kultur auftritt. Akzeptable IOP-Werte sind 5-20 mmHg basierend auf physiologischen IOD, die durch Auswertung der IOP-Datendateien oder Einstellung von LED-Anzeigen im Druckmesssystem wie in Zusatzprotokoll 2beschrieben bestimmt werden können.

  1. Bereiten Sie den BSC II-Schrank für die OG-Verletzungsinduktion vor, wie in Schritt 1.10 beschrieben. Verbinden Sie die Punktionsplattform mit einer Druckluftleitung. Befestigen Sie das sterile Punktionsobjekt am Futter.
    HINWEIS: Ein Luftkompressor kann verwendet werden, um das Gerät mit Strom zu versorgen, aber Tankdruckluft oder eingebaute Laborleitungen können ausreichen, wenn der Druck größer als 50 psi ist.
  2. Stellen Sie den Druckregler auf der Einstichplattform auf 50 psi ein, um eine ausreichende Durchstoßkraft auf Objekte mit einem Durchmesser von bis zu 4,5 mm zu haben. Positionieren Sie den Cross-Tracking-Schraubstock auf der Laborbuchse vor der Einstichplattform, um die ASOC-Schüssel während der Verletzungsinduktion zu halten.
  3. Entfernen Sie das ASOC-Setup vom 37 °C, 5% CO 2-Inkubator, und legen Sie es senkrecht zur Punktionsplattform(Abbildung 2)in den Cross-Tracking-Schraubstock, nachdem Sie den Deckel entfernt und beiseite gelegt haben. Halten Sie das vordere Segment perfundiert, aber schließen Sie den 3-Wege-Ventilanschluss zum Druckaufnehmer, um eine Überdruckbeaufschlagung des Wandlers zu vermeiden.
  4. Verlängern Sie den Kolbenarm auf seinen maximalen Abstand und positionieren Sie die Hornhautspitze innerhalb von 1 mm vom Punktionsobjekt. Ziehen Sie den Kolbenarm ein und bringen Sie das vordere Segment 1 cm näher an das Punktionsobjekt heran.
    HINWEIS: Dieser Abstand wurde für eine hocheffiziente Verletzungsinduktion optimiert, ohne die ASOC-Schüssel zu treffen.
  5. Feuern Sie die Einstichvorrichtung, indem Sie sie einschalten und das Magnetventil mit dem zweiten Schalter am Gerät öffnen. Um das Gerät einzuziehen, drücken Sie den zweiten Schalter erneut, um das Punktionsgerät aus dem Auge zu entfernen. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion durch visuelle Inspektion und Medienlecks von der Verletzungsstelle.
  6. AsOC-Schale vom Schraubstock entfernen; Setzen Sie den Deckel wieder auf die Schüsselmontage und öffnen Sie die fluidische Leitung zum Druckaufnehmer. Legen Sie das ASOC wieder in den 37 °C, 5% CO2 Inkubator.
    HINWEIS: An dieser Stelle kann das Therapeutikum auf den AS angewendet werden, um seine Wirksamkeit bei der Versiegelung von OG-Verletzungen zu beurteilen.

7. ASOC aus der Kultur entfernen

HINWEIS: Abhängig von der Endpunktanalyse (siehe Repräsentative Ergebnisse für mögliche Endpunktmethoden) muss der AS in der ASOC-Schüssel aufgeblasen bleiben, während andere Methoden AS-Gewebe erfordern, das aus der Kulturkammer isoliert wird. Die folgende Methodik beschreibt, wie AS aus den Organkulturschalen entfernt und der Rest des Setups entfernt wird.

  1. Entfernen Sie das ASOC-Geschirr aus dem 37 °C, 5% CO2 Inkubator. Schließen Sie das 3-Wege-Ventil an die Spritze und den Behälter und trennen Sie den Schlauch vom System. Entsorgen Sie die Spritze, das Reservoir und den Filter. Legen Sie die 3-Wege-Ventile, Schläuche und Nadelnaben zum Waschen und Sterilisieren in einen separaten Behälter.
  2. Trennen Sie die Nadelnaben von den fluidischen Verbindungen auf dem Boden der Schüssel. Entfläsern Sie die fluidischen Anschlüsse und O-Ringe. Legen Sie alle Gegenstände zum Waschen und Sterilisieren in einen Behälter.
  3. Entfernen Sie die vier Schrauben mit der L-Taste vom Klemmring. Entfernen Sie vorsichtig den Klemmring.
  4. Entfernen Sie den AS mit einer Sparzette aus der Schüssel und legen Sie ihn je nach Endpunktanalyse und Bild in fixative oder geeignete biogefährdische Abfälle.

8. IOP-Datenanalyse

  1. Schließen Sie die microSD-Karte an einen Computer an, um die .txt Datei mit den Daten aus dem letzten Versuchslauf zu entfernen.
    HINWEIS: Die Datei wird im Code genannt, der den Mikrocontroller steuert, und sollte für jedes Experiment aktualisiert werden (siehe Zusatzprotokoll 2).
  2. Importieren Sie die Daten in eine Tabelle.
  3. Organisieren Sie die Daten in 12 Spalten: Zeit (in min) und mV-Signal für jeden der 11 Druckmessumformerkanäle. Die ersten zehn Kanäle entsprechen zehn ASOC-Versuchsaufbauten. Das endgültige Wandlersignal ist für einen Sensor, der als Steuerkanal für Luft geöffnet ist, um zu bestätigen, dass sich das mV-Signal aufgrund von Änderungen des Eingangssignals nicht geändert hat. Plotten Sie den Steuerkanal im Vergleich zur Zeit, um zu bestätigen, dass das mV-Signal durchgehend konsistent war.
  4. Wandeln Sie die mV-Signale für zehn Kanäle mithilfe von Steigungs-Schnitt-Gleichungen, die aus der Erstkalibrierung jedes Sensors generiert werden, in mmHg um (siehe Zusatzprotokoll 4).
  5. Plotten Sie die Zeit (in Tage umrechnen, um die Dateninterpretation zu vereinfachen) im Vergleich zu jedem der zehn Kanäle, um zu bestimmen, wie der IOP im experimentellen Zeitverlauf schwankte.
  6. Bestimmen Sie die durchschnittlichen IOP-Werte an wichtigen Punkten in den Daten, um die Werte zwischen den einzelnen Werten und deren Veränderung vor und nach der OG-Verletzungsinduktion leichter vergleichen zu können. Durchschnittlich 2-3 h Daten für jedes 24-Stunden-Intervall, um den IOP an jedem Tag des ASOC zu bestimmen.
    HINWEIS: Repräsentative IOP-Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.

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Ergebnisse

Bilder, die mittels optischer Kohärenztomographie (OCT) aufgenommen wurden, werden für OG-verletzte Augen gezeigt, um zu veranschaulichen, wie eine erfolgreiche Verletzungsinduktion aussieht. Abbildung 3 zeigt Bilder für Kontroll- und OG-verletztes AS-Gewebe unmittelbar nach der Verletzung und 72 h später. Es werden zwei Ansichten gezeigt: Querschnittsbilder durch die Verletzungsstelle und Top-Down-Projektion mit maximaler Intensität (MIPs), um die Oberfläche des Bildes zu visualisieren. Kon...

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Diskussion

Es gibt kritische Schritte mit der ASOC OG-Verletzungsplattform, die hervorgehoben werden sollten, um die Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Verwendung der Methodik zu verbessern. Erstens ist es während der Dissektion des vorderen Segments wichtig, das trabekuläre Geflecht zu erhalten, aber es ist schwierig, es richtig zu machen. Wenn das TM gestört ist, hält das Auge den physiologischen Druck nicht aufrecht und erfüllt nicht die Zulassungskriterien für die experimentelle Verwendung. Es wird empfohlen, den Dissektionsproz...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Die in diesem Artikel geäußerten Ansichten sind die des Autors /der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position des MEDIZINISCHEN Ministeriums der US-Armee, des Armeeministeriums, des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung wider.

Danksagungen

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten durch eine behördenübergreifende Vereinbarung (#19-1006-IM) mit dem Temporary Corneal Repair Acquisition Program (United States Army Medical Materiel Development Agency) unterstützt werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10-32 Polycarbonat gerader Stecker, Rohrverbinder mit AußengewindeMcMaster-Carr51525K431
10-32 Innensechskantschraube, ½ "McMaster-Carr92196A269
10 mL SpritzeBD302995
20 mL SpritzeBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
Kugelkopf L SchlüsselMcMaster-Carr5020A25
BetadineFisherScientific NC1696484
BD  Intramedizin  PE 160 SchlauchFisher Scientific14-170-12E
WattestäbchenPuritan25-8061WC
DMEM MedienATCC30-2002
FBSATCC30-2020
Feine PinzetteWorld Precision Instruments15914
GazeCovidien8044
GentamicinGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
Hochtemperatur-Silikon-O-Ring, 2 mm breit, 4 mm IDMcMaster-Carr5233T47
Große PinzetteWorld Precision Instruments500365
Große chirurgische SchereWorld Precision Instruments503261
Mittelzahnige PinzetteWorld Precision Instrumente501217
Nagel (Einstichobjekt)McMaster-Carr97808A503
Nylon-SpritzenvorsatzfilterFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Petrischale (100 mm)FisherFB0875713
Polycarbonat, dreipolig, Absperrhahn mit Stecker  luer  SchlossFisherNC9593742
RasierklingeFisher12-640
Edelstahl 18 G  90 Grad  Winkel-DosiernadelMcMaster-Carr75165A81
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Referenzen

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