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Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/62670

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14. Oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, National Institute for Health Research Cambridge Biomedical Research Centre, University of Cambridge School of Clinical Medicine, 2Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dies ist eine Methode, um uteruslymphoide Zellen sowohl von schwangeren als auch von nicht schwangeren Mäusen zu isolieren. Diese Methode kann für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, Zellsortierung, funktionelle Assays, RNA-seq und Proteomik verwendet werden. Das Protokoll hier zeigt, wie man angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 1 durch Durchflusszytometrie phänotypisiert.

Zusammenfassung

Hier beschrieben ist eine einfache Methode zur Isolierung und zum Phänotypieren von Mausgruppe 1 uterusangeborenen lymphatischen Zellen (g1 uILCs) aus einzelnen schwangeren Uterus durch Durchflusszytometrie. Das Protokoll beschreibt, wie die Zeitpaarung eingerichtet wird, um mehrere synchrone Muttertiere zu erhalten, die mechanische und enzymatische Verdauung des schwangeren Uterus, die Färbung von Einzelzellsuspensionen und eine FACS-Strategie zum Phänotypisieren und Unterscheiden von g1-uILCs. Obwohl diese Methode unweigerlich die räumliche Information der zellulären Verteilung innerhalb des Gewebes verliert, wurde das Protokoll erfolgreich angewendet, um die Heterogenität von uILC, ihre Reaktion auf mütterliche und fetale Faktoren, die die Schwangerschaft beeinflussen, ihr Genexpressionsprofil und ihre Funktionen zu bestimmen.

Einleitung

Hier beschrieben ist eine einfache Methode, um eine hohe Ausbeute an angeborener Lymphozyten aus einzelnen schwangeren Uterus zu erhalten. Diese Methode bewahrt die Proteinoberflächenexpression und Funktionalität von angeborenen Lymphozyten der Gebärmutter und eignet sich für nachfolgende Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, RNAseq, Proteomik oder funktionelle Assays. Hier liegt der Fokus auf der Phänotypisierung von UILCs der Gruppe 1 mittels Durchflusszytometrie.

Der Uterus besteht aus drei Schichten: dem Endometrium, dem Myometrium und dem Perimetrium (Abbildung 1). Das Endometrium ist die Schleimhaut, die das Lumen der Gebärmutter auskleidet. Progesteron, das vom Corpus luteum produziert wird, wandelt das Endometrium in Decidua um. Das Myometrium besteht aus zwei Schichten glatter Muskulatur, die die Gebärmutterwand bilden. Das Perimetrium ist die Serosa, die den Uterus umhüllt und ihn durch das breite Band mesometrium mit dem Peritoneum verbindet. In einem Querschnitt der Gebärmutter wird der dem Lumen gegenüberliegende Teil als Mesometriumseite bezeichnet, während der Teil in der Nähe des Lumens als Anti-Mesometrium-Seite bezeichnet wird. Eine Vielzahl von mütterlichen Leukozyten bevölkert das Endometrium und die Decidua, einschließlich mehrerer Zelltypen, wobei die angeborenen Immunzellen die überwiegende Mehrheit der Zellen ausmachen. Angeborene lymphatische Zellen (ILCs), Makrophagen, dendritische Zellen (DC) sowie CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, regulatorische T-Zellen (Tregs) und seltene B-Zellen können alle eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gebärmutterumgebung während der gesamten Schwangerschaft spielen1,2. ILCs in der Gebärmutter finden sich nicht nur in der Schleimhaut, sondern auch im Myometrium bei Mäusen. Einschließlich aller drei Gruppen von ILCs ist der Uterus in der Tat das Organ, das am dichtesten von ILCs der Gruppe 1 besiedelt ist. Mit der strukturellen Transformation von Gebärmuttergewebe während der Schwangerschaft ändern sich auch die Anzahl und der Anteil der Uterusleukozyten (siehe Abbildung 2A für ein Beispiel für Variationen im Prozentsatz der uILC-Untergruppen der Gruppe 1)3,4.

Wenn in diesem Artikel auf Mäuse Bezug genommen wird, ist der C57BL/6-Stamm von Inzuchtlabormäusen gemeint. Ausgezüchtete Mäuse (z. B. NMRI-Mäuse) werden aufgrund ihrer hohen Reproduktionsrate häufig in der Reproduktionsforschung eingesetzt. Die Verwendung von Inzuchtstämmen ist jedoch notwendig, um konsistente Ergebnisse zu erzielen, und der bevorzugte genetische Hintergrund des Immunologen ist C57BL / 6, auch bekannt als B6.

Etwa 30% der Uterusleukozyten in B6-Dämmen in der Mitte der Schwangerschaft sind g1 uILCs, die durch Durchflusszytometrie als lebensfähige CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + -Zellen definiert werden (Abbildung 2B): pro-angiogene geweberesidentes NK (trNK), IFN-g produzierendes konventionelles NK (cNK) und uILC14,5. Der Anteil der uNK-Zellen ist beim Menschen noch höher und erreicht im ersten Trimester etwa 70%6. Es gibt mehr Ähnlichkeiten als Unterschiede zwischen Mensch und Maus uNK und uILC7,8. Obwohl es wichtig ist, die Unterschiede im Auge zu behalten, ist es nützlich, die verfügbaren Informationen über die beiden Arten zu integrieren. Kombiniert man Informationen aus der Untersuchung von uILC bei Menschen und Labornagetieren, wird deutlich, dass NK-Zellen bei homöostatischen Veränderungen helfen, die für die Biologie der Gebärmutter unerlässlich sind, einschließlich der Aufrechterhaltung der arteriellen Integrität9 und des Umbaus der Spiralarterie10 sowie der Invasion von Trophoblasten11,12. Sie spielen auch eine spezifische Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern13,14. Bei Mäusen und Ratten reichern sich NK-Zellen nicht nur mit der Füllung der Dezidua um die Implantationsstelle herum, sondern sammeln sich auch zwischen den beiden Muskelschichten des Myometriums von Muttertieren in einer vorübergehenden Struktur an, die als Mesometrial Lymphoid Aggregate of Pregnancy (MLAp)15 bekannt ist (Abbildung 1B), in der Vergangenheit auch als Metrialdrüse bekannt, deren Funktion noch entdeckt werden muss.

Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll der Methode, die im Labor verwendet wird, um Lymphozyten aus der Gebärmutter schwangerer Mäuse durch eine Kombination aus mechanischer Disaggregation und enzymatischer Verdauung zu isolieren. Da der gesamte Uterus in der Methode verwendet wird, sind Lymphozyten, die während der Schwangerschaft aus der Gebärmutter isoliert wurden, eine Mischung aus Dezidual- und Myometriumzellen. Eine weitere Dissektion der Decidua von der Gebärmutterwand und ihrem MLAp ist möglich und wurde bereits beschrieben16. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um Uteruslymphozyten unter Beibehaltung der Proteinoberflächenexpression, der zellulären Funktionalität und der Lebensfähigkeit zu erhalten. Das Ergebnis ist eine Einzelzellsuspension mit minimalen Verbleibenden Zelltrümmern und einer Ausbeute, die typischerweise zwischen 1 und 5 Millionen Zellen in der Mitte der Schwangerschaft (10,5 Tage) für eine schwangere Gebärmutter reicht. Die Anwendungen dieser Methode umfassen die Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie, die Zellsortierung für nachfolgende transkriptomische oder proteomische Studien, funktionelle Studien wie intrazelluläre Zytokinproduktion, Degranulation, ELISPOT oder zytotoxische Assays. Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von ILCs der Gruppe 1, kann aber für andere Zelltypen wie andere ILCs, T-Zellen, B-Zellen, DC oder Makrophagen mit geringfügigen Modifikationen des für die FACS-Analyse verwendeten Antikörperpanels angepasst werden. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um Zellen aus anderen Geweben und für gepoolte nicht schwangere Uteri zu isolieren.

Protokoll

Alle in diesem Papier beschriebenen Tierversuche wurden gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter PP2363781 des britischen Innenministeriums durchgeführt. Das folgende Protokoll besteht aus mehreren Abschnitten, beginnend mit der Maushaltung und der Färbung für die FACS-Analyse. Abbildung 3 zeigt die Hauptschritte des Protokolls. Die im Protokoll verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Allgemeine Mäusehaltung, Paarung und Dissektion

  1. Halten Sie 7-14 Wochen alte weibliche Mäuse unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen und Gruppenhaus (typischerweise 4-6 Weibchen je nach Käfiggröße und Tiergewicht) für 10-14 Tage, um den Lee-Boot-Effekt auszulösen, der zu einer Östrussynchronisation führt17.
  2. Halten Sie die Gestütsmännchen unter SPF-Bedingungen, einquartiert und ruhen Sie mindestens 48 h zwischen jeder Paarung (Zeit für die Spermienregeneration). Es ist vorzuziehen, erfahrene, bewährte 3-4 Monate alte Rüden zu verwenden, da sie in der Regel leistungsfähiger sind als die jungen.
  3. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass Weibchen schwanger werden, führen Sie 3 Tage vor der Paarung verschmutzte Einstreu aus dem Käfig eines Männchens in den weiblichen Käfig ein. Dies löst den Whitten-Effekt18 durch die Exposition gegenüber männlichen Urinpheromen aus und führt zu einem synchronisierten Östrus sowie einer verbesserten Aufnahmefähigkeit für die Paarung.
  4. Stellen Sie am Tag 0 (D0) die Mäuse für die Paarung mit einem Rüden pro zwei Weibchen ein; Berücksichtigen Sie eine Steckrate von ca. 20% -25%.
    HINWEIS: Die Paarung wird wahrscheinlich nachts stattfinden, da Mäuse nachtaktive Tiere sind.
  5. Überprüfen Sie am Morgen nach der Paarung (D0.5) das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens, der ein Indikator für die Kopulation ist (Abbildung 4). Der Vaginalpfropfen ist ein Aggregat des männlichen Ejakulats und bleibt typischerweise bis zu 8-24 h nach der Paarung bestehen. Überprüfen Sie die Stecker am frühen Morgen.
  6. Konsolidieren Sie die eingesteckten Weibchen in einem neuen Käfig und markieren Sie sie. Bringen Sie die Männchen zum Ausruhen in ihre Käfige zurück.
  7. Bei D9,5 oder 10,5 nach der Paarung 5 ml Röhrchen mit 1 ml sterilem HBSS 1x (mit Mg2+ und Ca2+) für die Gewebeentnahme vorbereiten und auf Eis legen.
  8. Fahren Sie mit der Tier-Euthanasie durch zervikale Luxation fort, gefolgt von einer Exsanguination, um den Tod zu bestätigen.
  9. Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung, wenn die nachgeschaltete Anwendung dies erfordert. Wischen Sie direkt nach der Euthanasie den Mauskörper mit 70% Ethanol ab und fahren Sie mit der Dissektion unter einem laminaren Flussmittelschrank mit sterilen Instrumenten fort.
  10. Sezieren Sie die schwangere Gebärmutter frei von Mesometriumfett (Abbildung 5) und legen Sie die gesamte Gebärmutter in eine vorbereitete und entsprechend gekennzeichnete 5-ml-Röhre. Halten Sie die Röhren auf Eis.

2. Mechanische und enzymatische Verdauung der Gebärmutter

  1. Um die enzymatische Verdauungslösung herzustellen, mischen Sie 3 ml pro Gebärmutter steriles HBSS 1x mit 30 μg/ml DNAse und 0,1 Wünsch Einheit (WU)/ml Liberase DH oder 0,52 WU/ml Liberase TM. Geben Sie die Lösung in ein Wasserbad bei 37 °C.
    HINWEIS: Es können sowohl Liberase TM als auch Liberase DH verwendet werden. Die Wahl des einen gegenüber dem anderen muss sich an ihrer potenziellen Wirkung auf Epitope orientieren, die von Antikörpern erkannt werden, die für die anschließende durchflusszytometrische Analyse verwendet werden.
    VORSICHT: Wenn Sie lyophilisierte Enzyme verwenden, arbeiten Sie unter der Haube.
  2. Bereiten Sie 20 ml 5 mM EDTA in PBS (kein Ca2 + / Mg2 +) vor. Die Hälfte der Lösung bei 37 °C in ein Wasserbad und die andere Hälfte auf Eis geben.
  3. Entfernen Sie unter einem laminaren Flussmittelschrank vorsichtig das Fett, das die schwangere Gebärmutter mit sterilen Instrumenten in einer sterilen Petrischale umgibt. Lassen Sie das Gewebe nicht trocknen.
  4. Sezieren Sie jede Implantationsstelle mit sterilen Instrumenten, um die Föten zu entfernen (seepferdchenförmige transluzide Struktur, etwa 1 mm lang) (Abbildung 6A). Entsorgen Sie die Föten.
  5. Bringen Sie die Gebärmutter in ihre ursprüngliche 5-ml-Röhre zurück und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere direkt in der 5-ml-Röhre und dem Sammelmedium. Halten Sie die Röhren die ganze Zeit zwischen den Eingriffen auf Eis.
  6. Legen Sie die 5 ml Röhrchen, die das gehackte Gewebe enthalten, in ein Wasserbad bei 37 °C.
  7. Fügen Sie 3 ml warme enzymatische Verdauungsmischung zu jeder Probe hinzu, so dass das Gesamtvolumen der Flüssigkeit im Röhrchen 4 ml beträgt (1 ml Sammelmedium mit der gehackten Gebärmutter und 3 ml enzymatische Verdauungslösung). Inkubieren Sie die 5 ml Röhrchen für 30 min bei 37 °C unter Rühren, um die enzymatische Verdauungsaktivität zu verbessern.
  8. Wirbeln Sie die 5 ml Röhrchen und legen Sie sie auf Eis, um die Wirkung von Enzymen zu hemmen. Anschließend wird der Inhalt in ordnungsgemäß gekennzeichnete 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
  9. Spülen Sie alles aus den 5-ml-Rohren in die 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml eiskalter 5 mM EDTA PBS-Lösung.
  10. Zentrifugieren Sie die 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die die verdauten Gewebe enthalten, für 10 min bei 400 x g.
  11. Entsorgen Sie den Überstand, streichen Sie das Pellet vorsichtig und resuspenieren Sie es dann in 10 ml warmer (37 °C) 5 mM EDTA PBS-Lösung.
  12. Inkubieren Sie die Proben in den 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei 37 °C unter Rühren für 15 min, um das übrig gebliebene Aufschlussmedium zu entfernen und die Zellverklumpung zu reduzieren.
  13. Wirbeln Sie die Proben 10 s lang auf hoch, um die Gewebedissoziation weiter zu erleichtern.

3. Verarbeitung der Gebärmutter zu einer Einzelzellsuspension

  1. Mit dem Kolben einer sterilen 1-ml-Spritze wird das verdaute Gewebe durch ein 70-μm-Sieb auf ein ordnungsgemäß markiertes und steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen gedrückt, um die Zellklumpen und das undissoziierte Gewebe zu entfernen.
  2. Waschen Sie das Sieb mehrmals mit insgesamt 10 ml kaltem PBS, um alle Zellen zu sammeln.
  3. Das 50 mL Zentrifugenröhrchen 10 min bei 400 x g drehen.
    HINWEIS: Führen Sie die weiteren Schritte mit Option A oder Option B aus. Option A ermöglicht eine bessere Anreicherung der Lymphozyten mit weniger Ablagerungen und Stromazellkontamination als Option B. Option B führt jedoch zu einer höheren Immunzellausbeute aufgrund eines geringeren Zellverlusts und einer geringeren Variabilität der Zellausbeute zwischen den Proben. Option B ist auch technisch einfacher durchzuführen. Fahren Sie daher je nach Präferenz mit Option A oder Option B fort.
    1. Die Schritte für Option A lauten wie folgt.
      1. Markieren Sie ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pro Probe, das 5 ml 80% (v/v) isotonisches Percoll enthält, das in PBS verdünnt ist.
      2. Nach dem Spin den Überstand aus dem 50 ml Zentrifugenröhrchen entsorgen. Verwenden Sie einen Pipettenjungen, um jedes Pellet in 8 ml von 40% (v / v) isotonischem Percoll in PBS zu resuspendieren.
      3. Verwenden Sie einen Pipettenjungen bei langsamer Geschwindigkeit, um das in der 40% igen Percoll-Lösung resuspendierte Pellet vorsichtig auf 80% Percoll-Lösung zu legen. Langsam und kontinuierlich pipettieren; Halten Sie das 15-ml-Rohr in einem Winkel von 45° (Abbildung 6B).
      4. Ohne die Überlagerung zu stören, zentrifugieren Sie die 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 20 min bei 850 x g bei Raumtemperatur (mittlere Beschleunigung und minimaler Bruch).
      5. Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne die Percoll-Schichten zu stören (Abbildung 6C).
      6. Ohne den Leukozytenring an der Grenzfläche der beiden Percoll-Lösungen zu stören, verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um alle bis auf etwa 0,5-1 ml der oberen Percoll-Schicht zu verwerfen.
      7. Während Sie versuchen, eine minimale Menge Percoll-Lösung (bis zu 4-5 ml insgesamt) zu saugen, sammeln Sie vorsichtig den Ring der Leukozyten und übertragen Sie die Zellen in ein neu markiertes 15 ml Zentrifugenröhrchen.
      8. Füllen Sie jede Probe mit 10 ml sterilem RMPI-1640-Medium auf, das mit 10% wärmeinaktiviertem FBS ergänzt wird.
      9. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g bei 4 °C.
      10. Verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie mit der RBC-Lyse fort.
    2. Die Schritte für Option B lauten wie folgt.
      1. Beschriften Sie ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pro Probe.
      2. Nach dem Spin den Überstand aus dem 50 ml Zentrifugenröhrchen entsorgen. Verwenden Sie einen Pipettenjungen, um jedes Pellet mit 8 ml isotonischem Percoll von 35% (v /v) in RPMI-1640 Medium zu resuspendieren.
      3. Die Proben werden in 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
      4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 940 x g für 10 min bei Raumtemperatur mit mittlerer Beschleunigung und minimalem Bruch.
      5. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig mit einem Sauger oder Pipettenjungen (nicht durch Umkehren des Schlauchs).
      6. Resuspendieren Sie das Pellet in 14 mL RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertem FBS und zentrifugieren Sie dann die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
      7. Verwerfen Sie den Überstand durch Aspiration und fahren Sie mit der RBC-Lyse fort.

4.RBC Lyse

  1. Um die Erythrozyten zu lysieren, werden die Proben in 3 mL 1x RBC-Lyselösung resuspendiert und für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert.
  2. Fügen Sie 10 ml PBS in die Proben hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
  3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
  4. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und wiederholen Sie Schritt 4.3.
  5. Resuspend jedes Pellet in 1 ml RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertem FBS.
  6. Leiten Sie die Proben durch sterile 70 μm Zellsiebe.
  7. Führen Sie die Zellzählung mit Trypanblau und einer Neubauer Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  8. Stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf 1-2 Millionen Zellen in 100 μL PBS oder Medium ein.

5. Panel-Design-Strategie und Kontrollen

HINWEIS: Das in diesem Artikel beschriebene Panel eignet sich für die Unterscheidung von uILC1-, trNK- und cNK-Zellen und wurde für die Verwendung auf einem 5-Laser-BD-LSRFortessa entwickelt. Geringfügige Modifikationen können vorgenommen werden, um verschiedene Zellpopulationen zu untersuchen und alternative Fluorochrome zu verwenden. Es wird empfohlen, die Konfiguration des Instruments zu überprüfen, titrierte Antikörper für eine optimale Trennung zu verwenden, den Helligkeitsindex des Herstellers zu konsultieren und die hellsten Farbstoffe für niedrig exprimierende Antigene wie NKp46 zu verwenden und allgemeine Richtlinien zu befolgen19. Es wird empfohlen, eine Fluoreszenz Minus One (FMO) Kontrolle für NKp46 einzuschließen.

6. Angeborene lymphatische Zellfärbung für die FACS-Phänotypisierung

  1. Übertragen Sie 1-2 Millionen Zellen pro Bohrloch in eine runde 96-Well-Platte.
  2. Drehen Sie die Platte bei 400 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn in eine Spüle schleudern.
  3. Resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer Mehrkanalpipette in 100 μL PBS (protein- und azidfrei).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PBS für den nachfolgenden Schritt kein Natriumazid, kein Tris oder Proteine enthält.
  4. Wiederholen Sie Schritt 6.2.
  5. Resuspend-Zellen in 50 μL fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff, verdünnt in PBS (protein- und azidfrei) (1:1.000). Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PBS kein Natriumazid, kein Tris oder Proteine wie FBS oder BSA enthält, da dies zu einer verminderten Färbeintensität abgestorbener Zellen und / oder einer erhöhten Hintergrundfärbung für die lebenden Zellen führen kann.
    VORSICHT: Wenn der Lebensfähigkeitsfarbstoff pulverisiert ist, verwenden Sie ihn unter der Haube.
  6. Fügen Sie 150 μL PBS hinzu, resuspendieren Sie die Zellen mit einer Mehrkanalpipette und wiederholen Sie dann Schritt 6.2.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in 25 μL FACS Buffer (PBS ergänzt mit 1% BSA oder 2% FBS), das Fc-Rezeptor-blockierendes Reagenz enthält. Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 4 °C.
  8. Fügen Sie 25 μL eines Oberflächen-Antikörper-Cocktails hinzu.
    HINWEIS: Titrieren Sie immer Antikörper und optimieren Sie das Antikörperpanel vor dem Experiment.
  9. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln.
  10. Fügen Sie 150 μL FACS Buffer zu jeder Vertiefung hinzu, mischen Sie gründlich und wiederholen Sie dann Schritt 6.2.
  11. Wiederholen Sie Schritt 6.10.
    HINWEIS: Führen Sie weitere Schritte mit Option A oder Option B aus. Verwenden Sie Option A, um die Zellen mit Oberflächenmarkierungen zu färben. Verwenden Sie Option B, um die intrazellulären Marker mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen.
    1. Die Schritte für Option A lauten wie folgt.
      1. Resuspendieren Sie die Proben in 100 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur.
        ACHTUNG: Verwenden Sie PFA unter der Haube. Bitte beachten Sie das Sicherheitsblatt für die sichere Entsorgung von PFA-Abfällen/Gegenständen, die mit PFA in Berührung gekommen sind (z. B. Pipetten).
      2. Wiederholen Sie Schritt 6.2 zweimal.
        ACHTUNG: Entsorgen Sie nicht, indem Sie hier in die Spüle blättern, da sie PFA enthält. Aspirieren Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie den Abfall gemäß dem Sicherheitsblatt.
      3. Resuspendieren Sie die Proben in 200 μL PBS.
      4. Die Proben werden in beschriftete FACS-Röhrchen überführt und mit 100 μL PBS aufgefüllt. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Verarbeitung mit FACS-Analyse auf Eis oder in einem Kühlschrank auf. Erfassen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer innerhalb von 24 Stunden.
    2. Die Schritte für Option B lauten wie folgt.
      1. Die Proben in 100 μL Fixations-/Permeabilisierungslösung pro Vertiefung (paraformaldehyd enthaltend) resuspenieren und 20 min bei 4 °C inkubieren.
        ACHTUNG: Verwenden Sie PFA unter der Haube. Bitte beachten Sie das Sicherheitsblatt für die sichere Entsorgung von PFA-Abfällen/Gegenständen, die mit PFA in Berührung gekommen sind (z. B. Pipetten).
      2. Wiederholen Sie Schritt 6.2.
        ACHTUNG: Entsorgen Sie nicht, indem Sie hier in die Spüle blättern, da sie PFA enthält. Aspirieren Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie den Abfall gemäß dem Sicherheitsblatt.
      3. Fügen Sie 200 μL 1x Permeabilisierungs- / Waschpuffer hinzu, mischen Sie gut und wiederholen Sie dann Schritt 6.2.
      4. Wiederholen Sie Schritt 6.11.2.3.
      5. Resuspendieren Sie die fixierten und permeabilisierten Zellen in 50 μL 1x Permeabilisierungs-/Waschpuffer mit Antikörpermischung für die intrazelluläre Färbung.
      6. Die Proben bei 4 °C für 30 min im Dunkeln inkubieren.
      7. Fügen Sie 200 μL 1x Permeabilisierungs- / Waschlösung hinzu, mischen Sie gut und wiederholen Sie dann Schritt 6.2.
      8. Wiederholen Sie Schritt 6.11.2.7.
      9. Resuspendieren Sie die Proben in 200 μL PBS.
      10. Die Proben werden in beschriftete FACS-Röhrchen überführt und mit 100 μL PBS aufgefüllt. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Verarbeitung mit FACS-Analyse auf Eis oder in einem Kühlschrank auf. Erfassen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer innerhalb von 24 Stunden.
        HINWEIS: Nach Durchführung dieses Protokolls ist die Dezidualzellsuspension bereit für die FACS-Analyse. Es wird empfohlen, so viele Ereignisse wie möglich pro Stichprobe aufzuzeichnen. Mindestens 1.000-3.000 Ereignisse einer Elternpopulation müssen erreicht werden, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

Ergebnisse

Die Hauptschritte des beschriebenen Verfahrens zur Gewinnung einer Einzelzellsuspension von Uterusleukozyten sind in Abbildung 3 zusammengefasst. In Abbildung 2B ist die grundlegende FACS-Gating-Strategie dargestellt, die zur Identifizierung von drei Untergruppen von g1-ILCs in B6-Mäusen verwendet wird: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) und cNK (CD49a-Eomes+) Zellen. Weitere Analysen dieser Populationen können durchgeführt werden, um verschiedene oberflächen- und intrazelluläre Marker von g1-ILCs zu untersuchen. Beispielsweise kann die Co-Expression von IFN-ɣ- und Selbst-MHC-Rezeptoren in uILC1-, trNK- und cNK-Zellen nach Stimulation mit Anti-NK1.1-Antikörpern beurteilt werden (Abbildung 7).

Je nach Forschungsfrage können sowohl das Protokoll (Abbildung 3) als auch das Antikörperpanel angepasst werden. Wichtig ist, dass empfohlen wird, sowohl Anti-NK1.1- als auch Anti-NKp46-Antikörper in einem FACS-Panel für g1 ILC-Gating zu verwenden (Abbildung 2B und Tabelle 1). Es sollte beachtet werden, dass g1-ILCs, die aus Blut, Milz oder Leber gewonnen werden, eine höhere Expression von NKp46 auf ihrer Oberfläche aufweisen als das Uterus-Gegenstück (Abbildung 8). Die Oberflächenfärbung für NK1.1 führt zu einer besseren Trennung und ermöglicht eine einfache Gateing-g1-ILCs der Gebärmutter (Abbildung 8). Während NKp46 von allen Mausstämmen exprimiert wird, wird das vom Anti-NK1.1-Antikörper PK136 erkannte NKR-P1C-Antigen nur von einigen Mausstämmen exprimiert, einschließlich C57BL/6 (d. h. B6), FVB/N und NZB, jedoch nicht in AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL oder 129. Wenn der Forscher beabsichtigt, entscheidende NK-Zellrezeptoren wie die MHC-Rezeptoren Ly49 zu untersuchen, ist es außerdem wichtig, sich der allelischen Variationen in Labormausstämmen bewusst zu sein, die die hohe Variabilität menschlicher Killerzell-Immunglobulin-ähnlicher Rezeptoren (KIR) rekapitulieren. Wenn die Zellen mit NK1.1 für einen funktionellen Assay stimuliert werden sollen, wie in Kim, S. et al.20 beschrieben, könnte es wünschenswert sein, die Zellen mit Anti-NKp46 anstelle von Anti-NK1.1 zu färben, da das NKR-P1C-Antigen vom vernetzenden Anti-NK1.1 besetzt sein kann oder eine Rezeptor-Downregulation der Stimulation folgen kann. Entweder rezeptorische Belegung oder Downregulation kann die Färbung mit dem gleichen Antikörper behindern, der zur Stimulation verwendet wird.

Ein häufiges Problem bei der enzymatischen Gewebedissoziation ist die Veränderung von Oberflächenepitopen auf Zellen durch Enzyme, die für ein Verdauungsmedium verwendet werden. Zum Beispiel ist die Färbung für den MHC CD94: NKG2A-Rezeptor schlecht, wenn Liberase TM verwendet wird. Die Verdauung mit Liberase DH bewahrt jedoch die NKG2A-Erkennung durch den 16A11-Antikörperklon (Abbildung 9). Es wird empfohlen, den Einfluss von Enzymen auf alle Epitope im FACS-Panel zu überprüfen. Verwenden Sie zu diesem Zweck die Suspension von Mausspenozyten, die durch mechanische Dissoziation erhalten werden (die gesamte Milz durch ein 70 μm-Sieb geleitet wird). Die Probe wird dann in zwei oder mehr Teile aufgeteilt, gefolgt von einer Inkubation mit einem Medium mit oder ohne Enzym (en).

Wie bereits erwähnt, sind blutabgeleitete Zellen in gewebedissoziierten Proben vorhanden. Bei Bedarf können Blutkontaminanten mit einer intravaskulären Färbemethode, wie sie im Masopust-Labor entwickelt wurde, ausgeschlossen werden21. Abbildung 10 zeigt, dass etwa 6,5% der g1-ILCs, die am Schwangerschaftstag 8,5 in Gebärmuttergewebeproben vorhanden sind, aus dem Blut stammen. Anti-CD45-Antikörper, die für die intravaskuläre Färbung verwendet werden, können mit einem Fluorochrom konjugiert werden, das für einen Dump-Kanal verwendet wird; Dies schließt Blutverunreinigungen aus, ohne einen zusätzlichen Fluoreszenzkanal zu verwenden. Die häufigsten Probleme und ihre Lösungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

Querschnittsdiagramme der Gebärmutter der Maus; zeigen Immunzellen, Trophoblasten; Vergleich mit der menschlichen Schwangerschaft.
Abbildung 1: Querschnitt einer Maus-Gebärmutter. (A) Uterusquerschnitt der Maus (nicht schwanger), der auf eine Vielzahl von mütterlichen Leukozyten hinweist, die den Uterus bevölkern. (B) Uterusquerschnitt der Maus (Trächtigkeitstag 8.5). (C) Uterusquerschnitt der Maus (Trächtigkeitstag 13.5). (D) Vergleich der Bildung von Maus und menschlicher Plazenta ab dem Blastozystenstadium. Mit BioRender.com erstellte Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Grafik der Immunzelltypen im Laufe der Zeit während der Schwangerschaft; Durchflusszytometrische Daten von NK-Zellpopulationen.
Abbildung 2: Subpopulationen von uterinem g1 ILC1. (A) Prozentsätze von uterinem cNK, ILC1 und trNK bei Mäusen während des frühen Lebens und der Schwangerschaft. W - Wochen, gd - Schwangerschaftstag. Modifizierte Grafik von Filipovic, I. et al.4. (B) Gating-Strategie zur Analyse von ILC-Untergruppen der Uterusgruppe 1 durch Durchflusszytometrie. Lymphozyten wurden am 10.5. Schwangerschaftstag aus dem Gebärmuttergewebe isoliert. Die Gewebeverdauung wurde mit einem Verdauungsmedium durchgeführt, das Liberase TM enthielt. Zellen wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, Licht zu streuen, gated. Dubletten wurden mit einem FSC-A- versus FSC-H-Diagramm ausgeschlossen, und nur CD45 + CD3-CD19-lebensfähige Zellen wurden weiter analysiert. Innerhalb von CD45+CD3-CD19- lebensfähigen Zellen wurde das ILC-Gatter der Gruppe 1 als NK1.1+ NKp46+-Zellen identifiziert. Innerhalb der ILCs der Gruppe 1 können drei Untergruppen identifiziert werden: CD49a-Eomes+ konventionelle NK-Zellen (cNK), CD49a+Eomes+ geweberesidente NK-Zellen (trNK) und CD49a+Eomes-uILC1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm des statischen Gleichgewichtsprotokolls; mesometriale Fettdissektion; Zentrifugenstufen; Einrichtung der FACS-Analyse.
Abbildung 3: Eine visuelle Anleitung für die Hauptschritte des Protokolls. (1) Sezieren Sie die schwangere Gebärmutter frei von Mesometriumfett. (2) Entfernen Sie die Föten; Bringen Sie die Gebärmutter in die 5-ml-Röhre zurück und zerkleinern Sie das Gewebe. Fahren Sie mit dem Enzymverdauungsschritt fort: Fügen Sie jeder Probe 3 ml warme enzymatische Verdauungsmischung hinzu. Die 5 ml Röhrchen für 30 min bei 37 °C unter Rühren inkubieren. (3) (i) Spülen Sie nach dem Aufschluss alles aus 5-ml-Röhrchen in 15-ml-Röhrchen mit 10 ml eiskalter 5 mM EDTA PBS-Lösung. ii) 15-ml-Röhrchen, die verdaute Gewebe enthalten, für 10 min bei 400 x g zentrifugieren. iii) den Überstand verwerfen; Streichen Sie das Pellet vorsichtig und resuspenieren Sie es in 10 ml warmer (37 °C) 5 mM EDTA PBS-Lösung. (iv) Proben in den 15-ml-Röhrchen bei 37 °C unter Rühren für 15 min. (4) Mit dem Kolben einer sterilen 1-ml-Spritze wird das verdaute Gewebe durch ein 70-μm-Sieb auf ein ordnungsgemäß markiertes und steriles 50-ml-Röhrchen gedrückt und 10 min bei 400 x g gedreht. (5) Fahren Sie nach dem Spin entweder mit Option A (hier in Diagrammen dargestellt) oder B fort. Option A: Verwerfen Sie den Überstand aus dem 50-ml-Rohr und resuspendieren Sie jedes Pellet mit einem Pipettenjungen in 8 ml 40% (v/v) isotonischem Percoll in PBS. (6) (i) Fortsetzung von Option A: Mit einem Pipettenjungen bei langsamer Geschwindigkeit wird das in 40% Percoll-Lösung resuspenierte Pellet vorsichtig auf die 5 ml 80% ige Percoll-Lösung überlagert. Langsam und kontinuierlich pipettieren; Halten Sie das 15 mL Rohr in einem Winkel von 45°. (ii) Ohne die Überlagerung zu stören, zentrifugieren Sie die 15 ml Rohre bei 850 x g für 20 min bei Raumtemperatur mit mittlerer Beschleunigung und langsamem Bruch. (7) Nach dem Spin, während Sie versuchen, eine minimale Menge Percoll-Lösung (bis zu 4-5 ml insgesamt) zu saugen, sammeln Sie vorsichtig den Ring der Leukozyten. (8) Führen Sie Lyseschritte für rote Blutkörperchen durch. (9) Zählen Sie die Zelle mit Trypanblau und einer Neubauer-Kammer. (10) Übertragen Sie 1-2 Millionen Zellen pro Bohrloch in eine runde 96-Well-Platte. (11) Fahren Sie mit der Färbung von Lebensfähigkeitsfarbstoffen und Antikörpern fort. (12) Schließlich werden die Proben in gekennzeichnete FACS-Röhrchen überführt. Bewahren Sie die Röhrchen auf Eis oder in einem Kühlschrank auf, bis die Verarbeitung mit FACS-Analyse innerhalb von 24 Stunden erfolgt. Mit BioRender.com erstellte Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Vergleich von zwei entzündeten Gewebeproben, Panel A und B, für die histologische Analyse.
Abbildung 4: Vaginalplug (A) und dessen Fehlen (B) bei C57BL/6-Weibchen 0,5 Tage nach der Paarung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nagetier-Präparierschritte für anatomische Studien; Handhabung von Werkzeugen und Exposition der inneren Organe gezeigt.
Abbildung 5: Dissektion zur Extraktion der Gebärmutter aus einer schwangeren Maus . (A) Der Damm wird mit Nadeln auf einem weichen Brett befestigt, um den Körper mit 70% Ethanol abzuwischen. Es werden zwei vertikale Schnitte vorgenommen, wie die blau gepunkteten Linien zeigen. (B) Die Haut wird angehoben, um innere Organe freizulegen. Die Darmschleifen werden sanft nach oben bewegt, um die Gebärmutter sichtbar zu machen. (C) Die Gebärmutter wird durch Schneiden an drei Punkten beprobt: neben den Eierstöcken und am Gebärmutterhals, wie durch die beiden blau gepunkteten Linien bzw. den blauen Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dissektions- und Zentrifugationsaufbau für die Zelltrennung; Embryonenextraktion, Percoll-Gradient, Lymphozytennachweis.
Abbildung 6: Herstellung einer Einzelzellsuspension. (A) Mechanische Entnahme von Embryonen aus ihrer Implantationsstelle. (B) Percoll-Farbverlaufsüberlagerung; die obere Schicht enthält die einzellige Suspension in 40% von Percoll und die untere Schicht 80% von Percoll. (C) Lymphozytenringbildung nach Zentrifugation des Percoll-Gradienten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Durchflusszytometrische Analyse von NK-Zelluntergruppen (uILC1, cNK, trNK) mit IFN-γ- und CD107a-Expression.
Abbildung 7: Repräsentative FACS-Analyse des funktionellen Assays mit ILCs der Gruppe 1. Intrazellulärer IFN-ɣ- und Oberflächen-CD107a-Nachweis in ILCs der Gruppe 1, die NK-Rezeptoren für Selbst-MHC exprimieren (Ly49C, Ly49I und NKG2A), verglichen mit denen, die dies nicht tun, nachdem NK1.1 mit plattengebundenen Antikörpern vernetzt wurde. Die Zellen wurden am Schwangerschaftstag 9,5 aus Gebärmuttergewebe isoliert. Die Gewebeverdauung wurde mit einem Verdauungsmedium durchgeführt, das Liberase DH enthielt. Gezeigt werden die Rohwerte aller vier Quadranten (Ecken) sowie der relative Prozentsatz der Responder unter den Zellen, die Rezeptoren für sich selbst exprimieren, und responder, die keine Selbstrezeptoren haben (fette Zahlen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Durchflusszytometrie, Histogramm, Milz- und Gebärmutter-NK-Zellmarkeranalyse, Datenvergleichstabelle.
Abbildung 8: Färbung von Milz- und Uteruslymphozyten mit Anti-NKp46- und Anti-NK1.1-Antikörpern. (A) Zellsuspensionen, die am Trächtigkeitstag 10.5 aus Der Milz der Maus und (B) der Gebärmutter gewonnen wurden, wurden in zwei Teile getrennt; ein Teil wurde mit NKp46-APC (rot) und der andere mit NK1.1-APC (blau) befleckt. Beachten Sie, dass die NKp46-Färbung von Uteruslymphozyten NKp46+ und NKp46-Zellen nicht so sauber trennt wie Milzlymphozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

NKG2A-Expressionshistogramm; Enzymvergleich mit Liberase DH/TM, Diagramm aus der Doktorarbeit.
Abbildung 9: Abnahme von NKG2A MFI (Antikörperklon: 16A11) durch Inkubation mit Aufschlussmedium. Die Zellsuspension von C56BL/6-Maus-Splenozyten wurde in drei Teile unterteilt. Ein Teil wurde in Liberase DH-Aufschlussmedium (HBSS mit 0,13 WU/ml Liberase DH und 30 μg/ml DNAse) inkubiert, und ein anderer Teil wurde mit Liberase TM-Aufschlussmedium (HBSS mit 0,52 WU/ml Liberase TM und 30 μg/ml DNAse) inkubiert. Der dritte Teil wurde 30 min bei 37 °C mit sauberem HBSS behandelt. Die Expression des NKG2A-Markers auf g1-ILCs wurde mittels Durchflusszytometrie beurteilt. Grafik entnommen aus Shreeve N. Die Rolle der uterinen NK-Zellhemmung in der Schwangerschaft (Thesis); Betreuer: Colucci F, 2020. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Punktdiagramme der Durchflusszytometrie, die die CD45-Färbung von uterinen g1-ILCs, Blut und thymischen Lymphozyten zeigen.
Abbildung 10: Intravitale Färbung mit Anti-CD45-Antikörpern zum Ausschluss von aus dem Blut gewonnenen g1-ILCs. Eine C57BL/6-Muttermaus am Trächtigkeitstag 8,5 wurde 3 min nach intravenöser Injektion mit 3 μg CD45-AF647 gekeult. Die Gebärmutter, Vollblut und Thymus wurden geerntet und für die FACS-Analyse verarbeitet. Die X-Achse zeigt das Signal der intravenösen Färbung mit CD45-AF647, und die Y-Achse zeigt das Signal von in vitro gefärbtem CD45-BUV395. Die Prozentsätze der Subpopulationen sind in Quadranten dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antikörper / FarbstoffKlonenFluorochromLaser
1 (Dump-Kanal)Zombie Violet Fixable Viability FarbstoffViolett
CD-191D3BV421
CD3145-2C11BV421
2CD4530-F11FITCBlau
3NK1,1PK136BV605Violett
4NKp4629A1,4APCRot
5CD49aHa31/8BUV395Ultraviolett
6EOMESDan11magPEGrün

Tabelle 1: Ein Beispiel für ein FACS-Panel für ein herkömmliches 5-Laser-Zytometer.

ProblemMögliche UrsacheVorschlag
Der Zellring ist an der Grenzfläche zweier Percoll-Lösungen nicht sichtbarSchlechte Schichtung der Percoll-Lösung oder Mischen von zwei Schichten während der ProbenhandhabungAchten Sie besonders darauf, das 80% Percoll-Kissen während des Overlays nicht zu brechen. Achten Sie bei der Probenhandhabung: Stören Sie nicht die Percoll-Schnittstelle
Geringe Anzahl von Leukozyten (z. B. bei Verwendung einer nicht schwangeren Gebärmutter)Die Schnittstelle kann auch dann gesehen werden, wenn die Zellennummer an der Schnittstelle sehr niedrig ist. Selbst wenn der Ring nicht sichtbar ist, sammeln Sie Flüssigkeit bei 40% bis 80% Percoll-Lösungen, da möglicherweise noch genügend Zellen für die weitere Verarbeitung vorhanden sind
Unvollständige RBC-LyseZellen wurden im Lysing-Puffer nicht richtig resuspendiertZellen nach oben und unten pipettieren, um die Klumpen aufzubrechen und zellen vollständig im Lysing-Puffer zu resuspendieren
Lysing-Lösung ist kaltDie Lysierlösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur ausgleichen
Verlängern Sie die Inkubationszeit mit der Lysierlösung auf bis zu 15min
RBC-Lyseschritt kann wiederholt werden
Geringe ZellausbeuteSchlechte enzymatische VerdauungÜberprüfen Sie, ob Enzyme nicht veraltet sind und gemäß ihren Handbüchern gelagert wurden
Zellverlust bei WaschschrittenUntersuchen Sie das Zellpellet nach jedem Waschschritt: das undurchsichtige Pellet am Boden des Bohrlochs nach dem Schleudern. Verwendung von V-Boden statt U-Bodenplatten, Schwenkrotorzentrifuge, längere Zentrifugationszeit kann den Zellverlust reduzieren
Gewebeproben enthalten eine geringe Anzahl von Lymphozyten (z. B. bei Verwendung einer nicht schwangeren Gebärmutter)Poolen Sie mehrere Uterus, um genügend Ereignisse für die Analyse zu erhalten. Erwägen Sie die Verwendung von Option B des Protokolls für die Zellisolierung
Hohe Variabilität der absoluten Leukozytenzahlen von Mäusen der gleichen GruppeInkonsistente Sammlung von Zellen an der Grenzfläche von 40% und 80% Percoll-LösungenStellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Zellfraktion auf der Percoll-Schnittstelle sammeln. Erwägen Sie die Verwendung von Option B des Protokolls für die Zellisolierung
Nicht in der Lage, erwartete Lymphozyten-Subpopulationen/Marker oder ungewöhnlich niedrige MFI für einige Zelloberflächenmarker zu erkennenEnzymatischer Aufschluss beeinflusst die Oberflächenexpression einiger Epitope oder deren AbbauOptimieren Sie die enzymatische Verdauung durch Änderung des Enzyms (z. B. zu einer anderen Art von Liberase oder Kollagenase) und / oder der Inkubationsdauer und / oder der Enzymkonzentration
Hohes Hintergrundrauschen im DurchflusszytometerHoher Anteil an Zellabfällen oder RBC-KontaminationPassen Sie den FSC-Schwellenwertparameter an. Erwägen Sie die Verwendung von Option A des Protokolls für die Zellisolierung

Tabelle 2: Handbuch zur Fehlerbehebung.

Diskussion

Die Methode enthält mehrere kritische Schritte, die im Folgenden erläutert werden. Der erste kritische Schritt besteht darin, mehrere synchrone Schwangerschaften zu erhalten, da sich die relative Häufigkeit von Leukozytenpopulationen durch die Schwangerschaft ändert. Mehrere Muttertiere am selben Schwangerschaftstag ermöglichen entweder biologische Wiederholungen in denselben Experimenten oder das Poolen von Lymphozyten aus einzelnen Muttertieren, um eine größere Anzahl für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten. Die zeitgesteuerte Paarung ermöglicht es dem Forscher, die Empfängnis innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden genau zu bestimmen. Obwohl Mäuse etwa 2,5 Jahre alt werden, werden sie im gebärfähigen Alter von 4-7 Wochen bis 6-8 Monate alt sein. Da jüngere Mäuse normalerweise kleinere Welpen produzieren, werden weibliche Mäuse im Allgemeinen erst nach 6-8 Wochen und männliche Mäuse erst nach 8-10 Wochen gepaart. Angesichts der Tatsache, dass der Östrus bei Mäusen etwa 15 h dauert und alle 4-5 Tage auftritt, liegt die typische Paarungsrate (aufgedeckt durch einen Vaginalpfropfen, siehe Abbildung 4) bei etwa 25%. Es ist daher wichtig, Mäuse in Östrus zu verwenden und eine ausreichende Anzahl zu planen, um die erforderliche Anzahl von Dämmen für ein bestimmtes Experiment zu erhalten. Die Phase des Östruszyklus kann durch vaginale Abstrichzytologie22 bestimmt werden. Die Steckrate kann verbessert werden, indem Männchen 48 h vor der Paarung ausgeruht und der Whitten-Effekt genutzt wird18. Alternativ kann man trächtiges Stutenserum verabreichen, das die Wirkung des endogenen follikelstimulierenden Hormons nachahmt und 42-50 h später menschliches Choriongonadotropin induziert, das die Wirkung des endogenen luteinisierenden Hormons nachahmt und den Eisprung induziert. Diese hormonelle Behandlung umgeht den Bedarf an Östrus und macht praktisch alle behandelten Frauen empfänglich.

Ein zweiter kritischer Schritt ist die Sicherstellung der Qualität der FACS-Färbung. Antikörper, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden, müssen immer titriert und in der optimalen Konzentration verwendet werden, und es muss überprüft werden, ob die enzymatische Verdauung entscheidende antigene Epitope nicht spaltet. Um zu beurteilen, ob ein Enzym ein Epitop spaltet, könnte man zwei Fraktionen derselben Probe parallel färben, von denen eine enzymatisch und die andere mechanisch vergärt wird. Ebenso ist die Verwendung geeigneter Kontrollen und Einzelflecken entscheidend, um zuverlässige Daten zu erhalten. Für seltene Ereignisse können Perlen verwendet werden, um einzelne Fleckenproben zu erzeugen. Es wird empfohlen, keine Perlen zum Aufbau von Spannungen zu verwenden, sondern eine Population von Zellen, die Lymphozyten und andere Leukozyten wie Splenozyten enthalten. Wenn Perlen verwendet werden, ist es notwendig, Antikörper für die Perlenfärbung zu titrieren, so dass die Fluoreszenzintensität von gefärbten Perlen mit der Fluoreszenzintensität von Zellen vergleichbar ist. Im Falle von Schwierigkeiten, positive von negativen Zellen für einen bestimmten Marker zu trennen, kann eine FMO-Kontrolle auch verwendet werden, um das Gating für einen bestimmten Marker zu erleichtern. Bei intrazellulären Markern muss eine Isotypkontrolle angewendet werden, da eine intrazelluläre Färbung zu restungebundenen Antikörpern führen kann, die nach den Waschschritten noch in den Zellen vorhanden sein können und somit das Hintergrundsignal erhöhen. Es wird empfohlen, die Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Fixierung der Zellen durchzuführen, um die besten Ergebnisse bei der Phänotypisierung durch FACS-Analyse zu erzielen, da die Autofluoreszenz im Laufe der Zeit signifikant zunimmt und die Fluoreszenzintensität einiger Antikörper im Laufe der Zeit abnehmen kann.

Ein weiterer entscheidender Faktor, der zu berücksichtigen ist, ist die nachgeschaltete Anwendung der mit dem Protokoll erhaltenen Einzelzellsuspension. Für funktionelle Assays ist es wichtig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Ebenso ist es für nachfolgende Omics-Studien wichtig, steril und RNase-, DNase- und Protease-frei zu arbeiten.

Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Phänotypisierung von ILCs der Gruppe 1, kann jedoch durch Modifikation des Antikörperpanels für die Phänotypisierung anderer Zelltypen angepasst werden. Es wird empfohlen, dass alle Antikörper gegen verdaute und unverdaute Zellsuspension getestet werden, um den Verlust / die Veränderung von Oberflächenepitopen durch die enzymatische Behandlung nachzuweisen. In ähnlicher Weise können verschiedene Enzyme verwendet werden, um das Gewebe zu verdauen und die Zellausbeute zu erhöhen, aber ihre Wirkung auf entscheidende antigene Epitope muss sorgfältig untersucht werden. Während NKp46 ein guter Marker für Milz-NK-Zellen ist und in allen Stämmen von Labormäusen funktioniert, ist die Expression von NKp46 auf uNK-Zellen in C57BL/6-Mäusen deutlich niedriger als auf Milz-NK-Zellen. Es ist am besten, sowohl NK1.1 als auch NKp46 gleichzeitig zu färben. Sollen mehrere Organe direkt verglichen werden, empfiehlt es sich, alle Proben gleich zu behandeln, auch wenn die enzymatische Verdauung für Gewebe wie die Milz oder das Knochenmark nicht erforderlich ist. Obwohl die hier vorgestellte Methode auf den nicht schwangeren Uterus anwendbar ist, wird die Isolierung des Lymphozytenrings durch einen zweiphasigen Percoll-Gradienten eine Herausforderung darstellen, und die Ausbeute isolierter Zellen kann für eine zuverlässige FACS-Analyse zu gering sein und erfordert daher die Bündelung von Zellen, die aus der Gebärmutter einzelner, nicht schwangerer Mäuse isoliert wurden23.

Es gibt Einschränkungen für das Protokoll, das bei der Interpretation der Daten zu berücksichtigen ist. Wie bei allen Geweben werden zirkulierende Lymphozyten aus dem Blut neben geweberesidenten Zellen isoliert. Wenn der Ausschluss zirkulierender Lymphozyten für die Dateninterpretation unerlässlich ist, kann eine intravitale Färbung durchgeführt werden, um zirkulierende Zellen zu markieren. Darüber hinaus besteht eine zweite Einschränkung des Protokolls darin, dass einige Zellen verloren gehen, da nicht alle Zellen aus dem Gewebe extrahiert werden können. Die häufigsten Probleme und deren Behebung sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Historisch gesehen hat sich die Untersuchung von Zellen in Geweben auf die histologische Untersuchung von Gewebeschnitten gestützt. Sandra Peels ausgezeichnete Rezension24 fasst die Arbeit zusammen, die in mehr als 100 Jahren bis in die späten 80er Jahre geleistet wurde. Beschreibungen von Zellen, die später als uNK-Zellen bekannt wurden, erscheinen tatsächlich in Manuskripten, die mehr als ein halbes Jahrhundert vor der Entdeckung von Lymphozyten veröffentlicht wurden. Also, vor der Entdeckung von NK-Zellen im Jahr 1975, und die uNK-Zellen wurden als mütterliche Glykogenzellen oder granulierte Metrialdrüsenzellen angezeigt. Anne Croy hat wichtige Beiträge auf dem Gebiet25 geleistet und dem Team freundlicherweise die Sezierung beigebracht, die sie optimiert hatte3, und die derzeit verwendet wird. Obwohl sie maßgeblich an der Beschreibung der Morphologie und Gewebelokalisierung von uNK-Zellen beteiligt ist, beschränkt sich die klassische histologische Untersuchung auf den Nachweis weniger Marker auf den interessierenden Zellen. Im Jahr 2008 wurde eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker auf Uteruslymphozyten beschrieben26. Dies ist im Wesentlichen die Methode, die in diesem Artikel beschrieben wurde. Neuere Technologien wie die räumliche Transkriptomik und die Bildgebung durch Massenzytometrie kombinieren die Leistungsfähigkeit von Histologie und Durchflusszytometrie und ermöglichen sowohl den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Gene bzw. Proteine als auch die Erhaltung der normalen Gewebearchitektur.

Die Anwendungen der hier beschriebenen Methode sind vielfältig und umfassen FACS-Phänotypisierung, funktionelle Assays (wie ELISPOT, Degranulation oder zytotoxische Assays), Zellsortierung und nachfolgende Transkriptomik oder Proteomik. Weitere Anwendungen, die auf Basis dieser Methode entwickelt werden könnten, sind die Kultivierung und Expansion von dezidualen NK-Zellen nach Zellsortierung oder Anreicherung durch negative Depletion. Derzeit gibt es kein Protokoll zur Kultivierung und Erweiterung von Maus-uNK-Zellen und zur Erhaltung ihrer Lebensfähigkeit und Funktionalität für einen längeren Zeitraum, ähnlich wie menschliche NK-Zellen, die für 7-14 Tage durch Zugabe von IL-2 oder einer Kombination von IL-12 und IL-15 kultiviert und erweitert werden können. Die Optimierung einer solchen Methode für Maus-uNK-Zellen würde mehr Flexibilität bei der Durchführung funktioneller Assays bieten und es ermöglichen, mehrere Bedingungen mit einer höheren Zellzahl zu testen. Auf der anderen Seite ist bekannt, dass Kulturbedingungen den einzigartigen Phänotyp der Lymphozyten und möglicherweise auch ihre Funktion verändern.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben und keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken den bisherigen und aktuellen Teammitgliedern, die an der Entwicklung dieser Methode mitgewirkt haben, darunter Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic und Anita Qualls. Diese Forschung wurde vom Wellcome Trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] und dem Medical Research Council (MR/P001092/1) finanziert. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine CC BY Public Copyright-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70 & Mikro; m-Zell-SiebeFalcon352350
BSASigmaA9647-100G
CD19 AntikörperBD562701
CD3 AntikörperBD562600
CD45 AntikörperBioLegend103108
CD49a AntikörperBD740262
DNase IRoche (Sigma)10104159001
EOMES AntikörpereBioscience12-4875-82
Fc-Block Trustain fcxBioLegend101320
Fötales RinderserumGibco10217-106
Fix/Perm Puffer (Teil des BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)BD 554714
HBSS, Calcium, Magnesium, kein PhenolrotGibco14025092
Liberase DHRoche (Sigma)5401089001
Lysepuffer PharmlyseBD555899
NK1.1 AntikörperBioLegend108739
NKp46  AntikörperBioLegend137608
Paraformaldehyd 16% Lösung (methanolfrei)Agar ScientificAGR1026
PBS 10xGibco14030-048
PBS 1x (kein Ca2+ oder Mg2+)Thermo Scientific14190144
PercollVWR international17-0891-01
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichP5368-10PAK
VorabscheidefilterMiltenyi130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAXGibco61870-010
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Scientific15575020
Zombie Violet Fixierbarer ViabilitätsfarbstoffBioLegend423113

Referenzen

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LymphozytenisolationVerdauung von UterusgewebeZellph notypisierungILCs der Gruppe 1Zelloberfl chenmarkerLyse roter Blutk rperchengewebest ndige NK ZellenGenexpressionsanalyse

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