Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Matthew J. Gaffrey; Nicholas J. Day; Xiaolu Li; Wei-Jun Qian

doi:10.3791/62671

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Methodenartikel

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

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DOI:

10.3791/62671

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21. Juni 2021

Matthew J. Gaffrey¹ , Nicholas J. Day¹ , Xiaolu Li² , Wei-Jun Qian¹

¹Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, ²Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Reversible oxidative Modifikationen an Proteinthiolen haben sich kürzlich als wichtige Mediatoren der Zellfunktion herausgestellt. Hierin beschreiben wir das detaillierte Verfahren einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang (RAC) in Kombination mit isobarer Tandem-Massenmarkierung (TMT) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) verwendet, um eine gemultiplexte stöchiometrische Quantifizierung oxidierter Proteinthiole auf Proteomebene zu ermöglichen. Die standortspezifischen quantitativen Informationen zu oxidierten Cysteinresten liefern zusätzliche Einblicke in die funktionellen Auswirkungen solcher Modifikationen.

Der Arbeitsablauf kann an viele Probentypen angepasst werden, einschließlich kultivierter Zellen (z. B. Säugetierzellen, Prokaryoten) und ganzer Gewebe (z. B. Herz, Lunge, Muskel), die zunächst lysiert/homogenisiert und mit freien Thiolen alkyliert werden, um eine künstliche Oxidation zu verhindern. Die oxidierten Proteinthiole werden dann reduziert und von einem Thiol-Affinitätsharz erfasst, das die Arbeitsschritte rationalisiert und vereinfacht, indem die fortschreitenden Verdauungs-, Markierungs- und Waschvorgänge ohne zusätzlichen Transfer von Proteinen / Peptiden durchgeführt werden können. Schließlich werden die markierten Peptide eluiert und mittels LC-MS/MS analysiert, um umfassende stöchiometrische Veränderungen im Zusammenhang mit der Thioloxidation über das gesamte Proteom aufzudecken. Diese Methode verbessert das Verständnis der Rolle der redoxabhängigen Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Zuständen im Zusammenhang mit der Proteinthioloxidation erheblich.

Einleitung

Unter homöostatischen Bedingungen erzeugen Zellen reaktive Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelspezies, die dazu beitragen, Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung ^1,2,3 zu erleichtern^, die sich sowohl auf Prokaryoten als auch auf Eukaryoten erstrecken. Die physiologischen Ebenen dieser reaktiven Spezies sind für die ordnungsgemäße Zellfunktion notwendig, auch bekannt als "Eustress"^1,4. Im Gegensatz dazu kann ein Anstieg der Oxidationsmittel, der zu einem Ungleichgewicht zwischen Oxidationsmitteln und Antiox....