Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.
Reversible oxidative Modifikationen an Proteinthiolen haben sich kürzlich als wichtige Mediatoren der Zellfunktion herausgestellt. Hierin beschreiben wir das detaillierte Verfahren einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang (RAC) in Kombination mit isobarer Tandem-Massenmarkierung (TMT) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) verwendet, um eine gemultiplexte stöchiometrische Quantifizierung oxidierter Proteinthiole auf Proteomebene zu ermöglichen. Die standortspezifischen quantitativen Informationen zu oxidierten Cysteinresten liefern zusätzliche Einblicke in die funktionellen Auswirkungen solcher Modifikationen.
Der Arbeitsablauf kann an viele Probentypen angepasst werden, einschließlich kultivierter Zellen (z. B. Säugetierzellen, Prokaryoten) und ganzer Gewebe (z. B. Herz, Lunge, Muskel), die zunächst lysiert/homogenisiert und mit freien Thiolen alkyliert werden, um eine künstliche Oxidation zu verhindern. Die oxidierten Proteinthiole werden dann reduziert und von einem Thiol-Affinitätsharz erfasst, das die Arbeitsschritte rationalisiert und vereinfacht, indem die fortschreitenden Verdauungs-, Markierungs- und Waschvorgänge ohne zusätzlichen Transfer von Proteinen / Peptiden durchgeführt werden können. Schließlich werden die markierten Peptide eluiert und mittels LC-MS/MS analysiert, um umfassende stöchiometrische Veränderungen im Zusammenhang mit der Thioloxidation über das gesamte Proteom aufzudecken. Diese Methode verbessert das Verständnis der Rolle der redoxabhängigen Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Zuständen im Zusammenhang mit der Proteinthioloxidation erheblich.
Unter homöostatischen Bedingungen erzeugen Zellen reaktive Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelspezies, die dazu beitragen, Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung 1,2,3 zu erleichtern, die sich sowohl auf Prokaryoten als auch auf Eukaryoten erstrecken. Die physiologischen Ebenen dieser reaktiven Spezies sind für die ordnungsgemäße Zellfunktion notwendig, auch bekannt als “Eustress”1,4. Im Gegensatz dazu kann ein Anstieg der Oxidationsmittel, der zu einem Ungleichgewicht zwischen Oxidationsmitteln und Antioxidantien führt, oxidativen Stress oder “Distress”1 verursachen, der zu Zellschäden führt. Oxidantien leiten Signale an biologische Signalwege weiter, indem sie verschiedene Biomoleküle modifizieren, einschließlich Protein, DNA, RNA und Lipide. Insbesondere Cysteinreste von Proteinen sind hochreaktive Stellen, die aufgrund der Thiolgruppe auf Cystein, die gegenüber verschiedenen Arten von Oxidationsmitteln reaktiv ist, oxidationsanfällig sind5. Dies führt zu einer Vielzahl von reversiblen redoxbasierten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) für Cystein, einschließlich Nitrosylierung (SNO), Glutathionylierung (SSG), Sulfenylierung (SOH), Persulfidierung (SSH), Polysulfidierung (SSnH), Acylierung und Disulfiden. Irreversible Formen der Cysteinoxidation umfassen Sulfinylierung (SO2H) und Sulfonylierung (SO3H).
Reversible oxidative Modifikationen von Cysteinresten können eine schützende Rolle spielen, die eine weitere irreversible Oxidation verhindert, oder als Signalmoleküle für nachgeschaltete zelluläre Signalwege dienen 6,7. Die Reversibilität einiger Thiol-Redox-PTMs ermöglicht es Cysteinstellen, als “Redoxschalter”8,9 zu fungieren, wobei Änderungen im Redoxzustand dieser Stellen die Proteinfunktion verändern, um ihre Rolle in transienten Prozessen zu regulieren. Die modulatorischen Wirkungen von Redox-PTMs 10 wurden in vielen Aspekten der Proteinfunktion 11 beobachtet, einschließlich Katalyse 12, Protein-Protein-Interaktionen13, Konformationsänderung14, Metallionenkoordination 15 oder pharmakologische Inhibitorbindung 16. Darüber hinaus sind Redox-PTMs an Cysteinstellen von Proteinen beteiligt, die Wege wie Transkription 17, Translation18 oder Stoffwechsel19 regulieren. Angesichts des Einflusses, den Redox-PTMs auf die Proteinfunktion und biologische Prozesse haben, ist es wichtig, das Ausmaß der Oxidation zu quantifizieren, das eine Cysteinstelle als Reaktion auf eine Störung des Redoxzustands erfährt.
Die Identifizierung von Cysteinstellen mit veränderten Redoxzuständen konzentriert sich auf den Vergleich der Oxidationsstufe auf der standortspezifischen Ebene zwischen normalen und gestörten Bedingungen. Faltenänderungsmessungen werden häufig verwendet, um festzustellen, welche Stellen signifikant verändert sind, da dies den Benutzern hilft, zu interpretieren, welche Cysteinstellen für die Studie physiologisch bedeutsam sein können. Alternativ liefern stöchiometrische Messungen der reversiblen Thioloxidation über einen bestimmten Probentyp hinweg ein allgemeines Bild des physiologischen Zustands in Bezug auf die zelluläre Oxidation, eine wichtige Messung, die oft übersehen und nicht ausreichend genutzt wird. Die Modifikationsstöchiometrie basiert auf der Quantifizierung des Prozentsatzes des modifizierten Thiols im Verhältnis zum Gesamtproteinthiol (modifiziert und unmodifiziert)20,21. Infolgedessen bieten stöchiometrische Messungen eine präzisere Messung als Faltenänderungen, insbesondere bei Verwendung der Massenspektrometrie. Die Bedeutung der Zunahme der Oxidation kann leichter durch die Stöchiometrie ermittelt werden, um die PTM-Belegung einer bestimmten Cysteinstelle zu bestimmen. Zum Beispiel könnte ein 3-facher Anstieg der Thioloxidation aus einem Übergang von nur 1% zu 3% oder so groß wie 30% zu 90% resultieren. Eine 3-fache Erhöhung der Oxidation für eine Stelle, die nur bei 1% Belegung ist, kann wenig Einfluss auf die Funktion eines Proteins haben; Eine 3-fache Erhöhung für einen Standort mit 30% Belegung im Ruhezustand kann jedoch stärker betroffen sein. Stöchiometrische Messungen, wenn sie zwischen insgesamt oxidierten Thiolen und spezifischen oxidativen Modifikationen, einschließlich Proteinglutathionylierung (SSG) und Nitrosylierung (SNO), durchgeführt werden, können Verhältnisse und quantitative Informationen in Bezug auf bestimmte Modifikationstypen aufdecken.
Da die reversible Thioloxidation typischerweise eine posttranslationale Modifikation mit geringer Häufigkeit ist, wurden mehrere Ansätze für die Anreicherung von Proteinen entwickelt, die diese Modifikationen aus biologischen Proben enthalten. Ein früher Ansatz, der von Jaffrey und anderen entwickelt wurde und als Biotin-Switch-Technik (BST)22 bezeichnet wird, umfasst mehrere Schritte, bei denen unmodifizierte Thiole durch Alkylierung blockiert werden, reversibel modifizierte Thiole zu entstehenden freien Thiolen reduziert werden, naszierende freie Thiole mit Biotin markiert werden und die markierten Proteine durch Streptavidin-Affinitätspulldown angereichert werden. Diese Technik wurde in vielen Studien verwendet, um SNO und SSG zu profilieren und kann angepasst werden, um andere Formen der reversiblen Thioloxidation23,24 zu untersuchen. Während BST verwendet wurde, um verschiedene Formen der reversiblen Thioloxidation zu untersuchen, besteht ein Problem bei diesem Ansatz darin, dass die Anreicherung durch die unspezifische Bindung von unbiotinylierten Proteinen an Streptavidin beeinflusst wird. Ein alternativer Ansatz, der in unserem Labor entwickelt wurde, genannt Resin-assisted capture (RAC)25,26 (Abbildung 1), umgeht das Problem der Anreicherung von Thiolgruppen über das Biotin-Streptavidin-System.
Nach der Reduktion reversibel oxidierter Thiole werden Proteine mit entstehenden freien Thiolen durch das Thiolaffinitätsharz angereichert, das kovalent freie Thiolgruppen einfängt, was eine spezifischere Anreicherung von Cystein-haltigen Proteinen als BST ermöglicht. Die Kopplung von RAC mit der Multiplexleistung der jüngsten Fortschritte in der isobaren Markierung und Massenspektrometrie schafft einen robusten und empfindlichen Workflow für die Anreicherung, Identifizierung und Quantifizierung reversibel oxidierter Cysteinreste auf proteomweiter Ebene. Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie haben eine viel tiefere Profilierung des Thiolredoxproteoms ermöglicht und das Verständnis sowohl der Ursache als auch der Wirkung der Proteinthioloxidation verbessert27. Die aus standortspezifischen quantitativen Daten gewonnenen Informationen ermöglichen weitere Studien der mechanistischen Auswirkungen und nachgelagerten Effekte reversibler oxidativer Modifikationen28. Die Verwendung dieses Workflows hat Einblicke in die physiologischen Auswirkungen der reversiblen Cysteinoxidation in Bezug auf normale physiologische Ereignisse wie Alterung gegeben, wobei sich die SSG-Spiegel in Bezug auf das Alter unterschieden. Die Alterungseffekte auf SSG wurden teilweise mit SS-31 (Elamipretid) umgekehrt, einem neuartigen Peptid, das die mitochondriale Funktion verbessert und den SSG-Spiegel bei älteren Mäusen senkt, wodurch sie ein SSG-Profil haben, das jungen Mäusen ähnlicher ist29.
Es wurde gezeigt, dass pathophysiologische Bedingungen, die auf die Exposition von Nanopartikeln zurückzuführen sind, SSG in einem Mausmakrophagenmodell einbeziehen. Unter Verwendung von RAC in Verbindung mit Massenspektrometrie zeigten die Autoren, dass die SSG-Spiegel direkt mit dem Grad des oxidativen Stresses und der Beeinträchtigung der phagozytischen Makrophagenfunktion korrelierten. Die Daten zeigten auch wegspezifische Unterschiede in der Reaktion auf verschiedene technisch hergestellte Nanomaterialien, die unterschiedliche Grade von oxidativem Stress induzieren30. Die Methode hat sich auch bei prokaryotischen Spezies bewährt, wo sie angewendet wurde, um die Auswirkungen von Tageszyklen in photosynthetischen Cyanobakterien in Bezug auf die Thioloxidation zu untersuchen. Es wurden breite Veränderungen in der Thioloxidation über mehrere wichtige biologische Prozesse hinweg beobachtet, einschließlich Elektronentransport, Kohlenstofffixierung und Glykolyse. Darüber hinaus wurde durch orthogonale Validierung bestätigt, dass mehrere wichtige funktionelle Stellen modifiziert wurden, was auf eine regulatorische Rolle dieser oxidativen Modifikationen hindeutet6.
Hier beschreiben wir die Details eines standardisierten Workflows (Abbildung 1) und demonstrieren den Nutzen des RAC-Ansatzes für die Anreicherung von insgesamt oxidierten Cysteinthiolen von Proteinen und deren anschließende Markierung und stöchiometrische Quantifizierung. Dieser Workflow wurde in Studien des Redoxzustands in verschiedenen Probentypen implementiert, einschließlich Zellkulturen27,30 und ganzen Geweben (z. B. Skelettmuskel, Herz, Lunge)29,31,32,33. Obwohl das RAC-Protokoll hier nicht enthalten ist, kann es auch leicht für die Untersuchung spezifischer Formen reversibler Redoxmodifikationen angepasst werden, einschließlich SSG, NSO und S-Acylierung, wie bereits erwähnt25,29,34.
Die harzunterstützte Abscheidung wurde in einer Vielzahl von Probentypen und biologischen Systemen zur Untersuchung oxidativer Modifikationen von Cysteinresteneingesetzt 25,29,30. Diese Methode ermöglicht die Auswertung von Proben auf mehreren Ebenen und Auslesen, einschließlich Proteinen und Peptiden mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analyse sowie einzelner Cysteinstellen mittels Massenspektrometrie. Unabhängig vom Probenty…
The authors have nothing to disclose.
Teile der Arbeit wurden durch NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 und U24 DK112349 unterstützt.
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Trypsin | Promega | V5820 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |