Summary
Proteintioloxidation har betydande konsekvenser under normala fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Vi beskriver detaljerna i en kvantitativ redoxproteomikmetod, som använder hartsassisterad infångning, isobarisk märkning och masspektrometri, vilket möjliggör platsspecifik identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester av proteiner.
Abstract
Reversibla oxidativa modifieringar på proteintioler har nyligen framträtt som viktiga mediatorer av cellulär funktion. Häri beskriver vi det detaljerade förfarandet för en kvantitativ redoxproteomikmetod som använder hartsassisterad infångning (RAC) i kombination med tandemmasstagg (TMT) isobarisk märkning och vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) för att möjliggöra multiplexerad stochiometrisk kvantifiering av oxiderade proteintioler på proteomnivå. Den platsspecifika kvantitativa informationen om oxiderade cysteinrester ger ytterligare inblick i de funktionella effekterna av sådana modifieringar.
Arbetsflödet är anpassningsbart över många provtyper, inklusive odlade celler (t.ex. däggdjur, prokaryota) och hela vävnader (t.ex. hjärta, lunga, muskler), som initialt lyseras / homogeniseras och med fria tioler som alkyleras för att förhindra artificiell oxidation. De oxiderade proteintiolerna reduceras sedan och fångas upp av ett tiolaffinitetsharts, vilket effektiviserar och förenklar arbetsflödesstegen genom att tillåta att de fortsatta matsmältnings-, märknings- och tvättprocedurerna utförs utan ytterligare överföring av proteiner / peptider. Slutligen elueras och analyseras de märkta peptiderna av LC-MS / MS för att avslöja omfattande stökiometriska förändringar relaterade till tioloxidation över hela proteomet. Denna metod förbättrar avsevärt förståelsen för rollen av redoxberoende reglering under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd relaterade till proteintioloxidation.
Introduction
Under homeostatiska förhållanden genererar celler reaktiva syre-, kväve- eller svavelarter som hjälper till att underlätta processer, såsom metabolism och signalering 1,2,3, som sträcker sig till både prokaryoter och eukaryoter. Fysiologiska nivåer av dessa reaktiva arter är nödvändiga för korrekt cellulär funktion, även känd som 'eustress'1,4. Däremot kan en ökning av oxidanter som leder till en obalans mellan oxidanter och antioxidanter orsaka oxidativ stress, eller "nöd"1, vilket leder till cellskador. Oxidanter omvandlar signaler till biologiska vägar genom att modifiera olika biomolekyler, inklusive protein, DNA, RNA och lipider. I synnerhet är cysteinrester av proteiner mycket reaktiva platser benägna att oxidera på grund av tiolgruppen på cystein, som är reaktiv mot olika typer av oxidanter5. Detta ger upphov till ett varierat utbud av reversibla redoxbaserade posttranslationella modifieringar (PTM) för cystein, inklusive nitrosylering (SNO), glutationylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidering (SSH), polysulfidering (SSnH), acylering och disulfider. Irreversibla former av cysteinoxidation innefattar sulfinylering (SO2H) och sulfonylering (SO3H).
Reversibla oxidativa modifieringar av cysteinrester kan tjäna skyddande roller som förhindrar ytterligare irreversibel oxidation eller fungera som signalmolekyler för nedströms cellulära vägar 6,7. Reversibiliteten hos vissa tiol redox PTM gör det möjligt för cysteinställen att fungera som "redoxomkopplare"8,9, varvid förändringar i redoxtillståndet på dessa platser förändrar proteinfunktionen för att reglera deras roll i övergående processer. De modulerande effekterna av redox PTM 10 har observerats i många aspekter av proteinfunktion 11, inklusive katalys 12, protein-proteininteraktioner 13, konformationsförändring 14, metalljonkoordinering15 eller farmakologisk inhibitorbindning 16. Dessutom är redox-PTM involverade i cysteinställen för proteiner som reglerar vägar såsom transkription 17, översättning18 eller metabolism19. Med tanke på den inverkan som redox PTM har på proteinfunktion och biologiska processer är det viktigt att kvantifiera omfattningen av oxidation som en cystein plats genomgår som svar på en störning av redoxtillståndet.
Identifieringen av cystein platser med förändrade redoxtillstånd är inriktad på jämförelsen av oxidationstillståndet på platsspecifik nivå mellan normala och störda förhållanden. Fold change mätningar används ofta för att avgöra vilka platser som är signifikant förändrade eftersom detta hjälper användare att tolka vilka cystein platser kan vara fysiologiskt betydelsefulla för studien. Alternativt ger stökiometriska mätningar av reversibel tioloxidation över en specifik provtyp en allmän bild av det fysiologiska tillståndet med avseende på cellulär oxidation, en viktig mätning som ofta förbises och underutnyttjas. Modifieringsstökiometri baseras på kvantifiering av procentandelen modifierad tiol som ett förhållande till totalt proteintiol (modifierat och omodifierat)20,21. Som ett resultat erbjuder stökiometriska mätningar en mer exakt mätning än vikförändring, särskilt vid användning av masspektrometri. Betydelsen av ökningen av oxidation kan lättare fastställas genom att använda stökiometri för att bestämma PTM-beläggningen för en viss cysteinplats. Till exempel kan en 3-faldig ökning av tioloxidation bero på en övergång på så lite som 1% till 3% eller så stor som 30% till 90%. En 3-faldig ökning av oxidationen för en plats som endast har 1% beläggning kan ha liten inverkan på ett proteins funktion; En 3-faldig ökning för en plats med 30% beläggning i viloläge kan dock påverkas mer väsentligt. Stökiometriska mätningar, när de utförs mellan totala oxiderade tioler och specifika oxidativa modifieringar, inklusive proteinglutationylering (SSG) och nitrosylering (SNO), kan avslöja förhållanden och kvantitativ information med avseende på specifika modifieringstyper.
Eftersom reversibel tioloxidation vanligtvis är en posttranslationell modifiering med låg överflöd, har flera metoder utvecklats för anrikning av proteiner som innehåller dessa modifieringar ur biologiska prover. Ett tidigt tillvägagångssätt som utarbetats av Jaffrey och andra, som heter biotinomkopplartekniken (BST)22, involverar flera steg där omodifierade tioler blockeras genom alkylering, reversibelt modifierade tioler reduceras till begynnande fria tioler, framväxande fria tioler är märkta med biotin och de märkta proteinerna berikas av streptavidinaffinitetsdragning. Denna teknik har använts för att profilera SNO och SSG i många studier och kan anpassas för att undersöka andra former av reversibel tioloxidation23,24. Medan BST har använts för att undersöka olika former av reversibel tioloxidation, är ett problem med detta tillvägagångssätt att anrikning påverkas av den icke-specifika bindningen av obiotinylerade proteiner till streptavidin. Ett alternativt tillvägagångssätt som utvecklats i vårt laboratorium, kallat hartsassisterad fångst (RAC)25,26 (figur 1), kringgår frågan om anrikning av tiolgrupper via biotin-streptavidinsystemet.
Efter minskningen av reversibelt oxiderade tioler berikas proteiner med begynnande fria tioler av tiolaffinitetshartset, som kovalent fångar fria tiolgrupper, vilket möjliggör mer specifik anrikning av cysteinhaltiga proteiner än BST. Att koppla RAC med multiplexeringskraften i de senaste framstegen inom isobarisk märkning och masspektrometri skapar ett robust och känsligt arbetsflöde för anrikning, identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester på proteomomfattande nivå. De senaste framstegen inom masspektrometri har möjliggjort mycket djupare profilering av tiol redoxproteomet, vilket ökar förståelsen för både orsak och effekt av proteintioloxidation27. Den information som erhålls från platsspecifika kvantitativa data möjliggör ytterligare studier av de mekanistiska effekterna och nedströmseffekterna av reversibla oxidativa modifieringar28. Att använda detta arbetsflöde har gett insikt i de fysiologiska effekterna av reversibel cysteinoxidation med avseende på normala fysiologiska händelser som åldrande, där nivåerna av SSG skilde sig åt med avseende på ålder. Åldringseffekterna på SSG vändes delvis med hjälp av SS-31 (elamipretid), en ny peptid som förbättrar mitokondriell funktion och minskar SSG-nivåerna hos åldrade möss, vilket gör att de har en SSG-profil som mer liknar unga möss29.
Patofysiologiska tillstånd som tillskrivs nanopartikelexponering har visat sig involvera SSG i en musmakrofagmodell. Med hjälp av RAC i kombination med masspektrometri visade författarna att SSG-nivåerna var direkt korrelerade med graden av oxidativ stress och försämring av makrofagisk fagocytisk funktion. Data avslöjade också vägspecifika skillnader som svar på olika konstruerade nanomaterial som inducerar olika grader av oxidativ stress30. Metoden har också visat sin användbarhet hos prokaryota arter, där den tillämpades för att studera effekterna av dagliga cykler i fotosyntetiska cyanobakterier med avseende på tioloxidation. Breda förändringar i tioloxidation över flera viktiga biologiska processer observerades, inklusive elektrontransport, kolfixering och glykolys. Dessutom, genom ortogonal validering, bekräftades flera viktiga funktionella platser att modifieras, vilket tyder på reglerande roller för dessa oxidativa modifieringar6.
Häri beskriver vi detaljerna i ett standardiserat arbetsflöde (figur 1), som visar nyttan av RAC-metoden för anrikning av totala oxiderade cysteintioler av proteiner och deras efterföljande märkning och stökiometriska kvantifiering. Detta arbetsflöde har implementerats i studier av redoxtillståndet i olika provtyper, inklusive cellkulturer27,30 och hela vävnader (t.ex. skelettmuskulatur, hjärta, lunga)29,31,32,33. Även om det inte ingår här, är RAC-protokollet också lätt anpassat för undersökning av specifika former av reversibla redoxmodifieringar, inklusive SSG, SNO och S-acylation, som tidigare nämnts25,29,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i protokollet relaterade till djur- eller humana prover / vävnader godkändes av och följde de institutionella riktlinjerna för etikkommittén för forskning på människor och djur.
1. Provhomogenisering/-lys
- Frysta vävnadsprover
- Hacka fryst vävnad (~ 30 mg) på ett glasmikroskop som glider på torris med ett förkylt rakblad och pincett. Överför den malet vävnaden till ett förkylt 5 ml rundbottnat polystyrenrör som innehåller 700 μl buffert A (se tabell 1) och inkubera på is i 30 minuter, skyddad från ljus.
- Stör vävnaden i 30 s eller tills den är helt homogeniserad med en handhållen vävnadshomogenisator. Lägg proverna på is och låt skummet avta i ytterligare 10 minuter.
OBS: En aluminiumplåt placerad på torris ger en stabil arbetsyta och plattform för den första bearbetningen / malningen av vävnaden.
- Alternativt kan du använda vidhäftande cellkulturer i 100 mm odlingsskålar som utgångsmaterial.
- Håll cellerna på is och använd en serologisk pipett för att skölja cellerna två gånger med 10 ml iskall PBS innehållande 100 mM NEM.
- Lysera cellerna genom att tillsätta 1 ml kallhomogeniserings-/lysbuffert och skrapa kraftigt med en styv cellskrapa. Överför lysatet till ett 2 ml centrifugrör med hjälp av en mikropipett.
OBS: Sköljbuffert och lysbuffert kan skalas i enlighet med olika storlek odlingskärl. Vanligtvis krävs 2-5 miljoner celler; Detta varierar dock beroende på lyseffektiviteten och proteinutbytet för specifika celltyper. Homogeniseringsbuffert kan beredas utan NEM för prover som analyseras för totala tioler.
- Överför det resulterande homogenatet (steg 1.1.2 eller 1.2.2) till ett centrifugrör på 2 ml med hjälp av en mikropipett och centrifugera med full hastighet (≥16 000 × g) vid 4 °C i 10 minuter.
- Överför supernatanten (~ 700 μL eller ~ 1 ml för cellodling) med en mikropipett till ett 5 ml koniskt mikrocentrifugrör och inkubera i 30 minuter vid 55 ° C i mörkret med skakning vid 850 rpm.
- Tillsätt 4 ml iskall aceton till proverna med hjälp av en serologisk glaspipett och inkubera vid -20 °C över natten för utfällning av protein och avlägsnande av överskott av N-etylmaleimid.
2. Hartsassisterad fångst
- Tvätta de utfällda proteinpelletsen två gånger med aceton genom att centrifugera vid 20 500 × g vid 4 °C i 10 minuter, dekantera acetonen, avlägsna eventuell kvarvarande aceton med hjälp av en mikropipett och tillsätt 3 ml färsk, iskall aceton med hjälp av en serologisk glaspipett. Invertera flera gånger för att blanda. Efter den andra tvätten, låt pelletsen lufttorka i 1-2 min, var försiktig så att du inte övertorkar eftersom resuspension kan bli svårt.
- Med hjälp av en mikropipett, tillsätt 1 ml buffert B (se tabell 1) och solubilize proteinet med upprepad ultraljudsbehandling för 15-30 s åt gången med hjälp av en bad sonicator med en utgång på 250 W och kort virvel. Mät proteinkoncentrationen med hjälp av bicinchoninic acid (BCA) -analysen enligt tillverkarens protokoll.
- För att standardisera proteinkoncentrationerna över prover för vidare bearbetning och säkerställa fullständigt avlägsnande av NEM, överför 500 μg protein till ett 0,5 ml 10 kDa centrifugalfilter med hjälp av en mikropipett och justera till en slutlig volym på 500 μL med resuspensionsbuffert.
- Centrifugera vid 14 000 × g vid rumstemperatur tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 μl. Samla upp proverna genom att vända filtret i ett uppsamlingsrör. Centrifugera vid 1 000 × g i 2 min och justera till en slutlig volym på 500 μl med buffert C (se tabell 1).
- Minska proteintiolerna genom att tillsätta 20 μl 500 mM ditiotreitol (DTT) med hjälp av en mikropipett till en slutlig koncentration på 20 mM och inkubera proverna i 30 minuter vid 37 °C under skakning vid 850 rpm.
- Efter reduktion, överför proverna med hjälp av en mikropipett till 0,5 ml 10 kDa centrifugalfilter och centrifugera i 15 minuter vid 14 000 × g vid rumstemperatur eller tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 μl. Tillsätt buffert D (se tabell 1) för att öka volymen i centrifugalfiltret till 500 μl.
- Upprepa centrifugeringen och tillsatsen till 500 μl i steg 2.6 tre gånger, och efter den fjärde centrifugeringen samlar du upp proverna genom att vända filtret i ett uppsamlingsrör och centrifugera vid 1 000 × g i 2 minuter.
- Mät proteinkoncentrationen med BCA-analysen enligt tillverkarens protokoll.
- Bered tiolaffinitetshartset under detta buffertutbyte genom att väga lämplig mängd harts (30 mg/prov) med hjälp av en mikrobalans och överföra det till ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt sedan vatten med hjälp av en serologisk pipett för en slutlig koncentration av 30 mg/ml harts och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme med omrörning för korrekt hydrering av hartset.
OBS: Tiol-affinitetshartset som nämns ovan har avbrutits av tillverkaren. En möjlig ersättning för detta tiol-affinitetsharts är kommersiellt tillgängligt. Denna ersättning har dock en nästan 5-faldig mindre bindningskapacitet (se Kompletterande information). Alternativt kan tiol-affinitetshartset syntetiseras med användning av 2-(pyridyldithio) etylaminhydroklorid och N-hydroxisuccinimidaktiverat harts (se Kompletterande information).- Efter hydrering av hartset, placera spinnkolonnerna på ett vakuumgrenrör och överför 500 μL av hartsuppslamningen med hjälp av en mikropipett till varje kolonn. Applicera vakuum för avlägsnande av vatten; Upprepa detta steg en gång för att få totalt 30 mg harts per kolumn. Alternativt kan du centrifugera vid 1 000 × g i 2 minuter istället för att använda vakuumgrenröret för detta och alla hartstvätt- och elueringssteg.
OBS: Skärning av änden av en 1000 μL pipettspets för att öka borrstorleken hjälper till med överföringen av hartset. Det är viktigt att triturera mellan pipettering för att säkerställa att hartset förblir suspenderat och homogent och lika stora mängder harts överförs till varje kolonn. - Tvätta hartset genom att tillsätta 500 μl ultrarent vatten med en mikropipett och applicera vakuum för avlägsnande av vattnet; upprepa detta 5 gånger. Tvätta sedan hartset 5 gånger med 500 μl buffert E (se tabell 1).
OBS: Alternativt kan centrifugering vid 1 000 x g i 2 minuter användas i stället för ett vakuumgrenrör för alla efterföljande tvättsteg. Alla pågående tvättsteg utförs med en volym på 500 μl. När du lägger till tvättbuffertar i kolonnen, tillsätt försiktigt med tillräcklig kraft för att helt återsuspendera hartset samtidigt som du undviker stänk och förlust av harts; Detta möjliggör fullständig och effektiv tvättning av harts.
- Efter hydrering av hartset, placera spinnkolonnerna på ett vakuumgrenrör och överför 500 μL av hartsuppslamningen med hjälp av en mikropipett till varje kolonn. Applicera vakuum för avlägsnande av vatten; Upprepa detta steg en gång för att få totalt 30 mg harts per kolumn. Alternativt kan du centrifugera vid 1 000 × g i 2 minuter istället för att använda vakuumgrenröret för detta och alla hartstvätt- och elueringssteg.
- Överför med hjälp av en mikropipett 150 μg protein från varje reducerat prov till ett nytt rör och justera till en slutlig volym på 120 μl buffert C (se tabell 1). Överför proteinlösningen med hjälp av en mikropipett till en pluggad spinnkolonn som innehåller hartset, placera locket på kolonnen och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm.
- Tvätta hartset fem gånger med 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M urea; följt av fem gånger med 2 M NaCl; följt av fem gånger med 80% acetonitril (ACN) med 0,1% trifluorättiksyra (TFA); och slutligen fem gånger med 25 mM HEPES, pH 7,7, enligt beskrivningen i steg 2.8.2 och byt ut kontakten.
OBS: Prover kan elueras här för analys på proteinnivå (t.ex. SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), western blot) enligt beskrivningen i steg 4.1.
3. På-harts tryptisk matsmältning och TMT-märkning
- Bered tillräckligt med modifierad trypsinlösning av sekvenseringskvalitet för 6–8 μg per prov genom att solubilisera den i en koncentration av 0,5 μg/μl i buffert C (se tabell 1) så att den slutliga volymen tillåter minst 120 μl per prov. Tillsätt 120 μl av denna trypsinlösning med hjälp av en mikropipett till proverna och inkubera över natten vid 37 °C vid skakning vid 850 rpm.
OBS: För att öka matsmältningseffektiviteten kan ett ytterligare matsmältningssteg inkluderas nästa dag genom att ta bort trypsinlösningen och ersätta den med färsk lösning och fortsätta matsmältningen i 2 timmar. - Tvätta hartset fem gånger med 25 mM HEPES, pH 7,0; följt av fem gånger 2 M NaCl; följt av fem gånger med 80 % ACN med 0,1 % TFA; följt av tre gånger med 25 mM HEPES, pH 7,7. Tvätta slutligen hartset två gånger med 50 mM trietylammoniumbikarbonatbuffert (TEAB) och byt ut kontakten.
- Förbered TMT-märkningsreagenser genom att först låta dem värmas till rumstemperatur innan de snurrar ner en kort stund med en centrifug vid 16 000 × g. Tillsätt 150 μl vattenfri ACN till varje injektionsflaska med TMT-märkningsreagens med hjälp av en mikropipett. Inkubera injektionsflaskorna vid rumstemperatur på en termomixer inställd på 850 rpm i 5 minuter för att solubilisera reagenset helt. Virvla kort och snurra ner vid 16 000 × g för att samla reagenset.
- Tillsätt 40 μl 100 mM TEAB till det tvättade hartset med en mikropipett, tillsätt sedan 70 μl av det upplösta TMT-reagenset och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm. Förvara eventuellt kvarvarande TMT-reagens vid -80 °C.
OBS: Notera de enskilda TMT-etiketterna som tilldelats varje biologiskt prov (figur 1). - Tvätta hartset fem gånger med 80% ACN med 0,1% TFA, tre gånger med 100 mM ammoniumbikarbonatbuffert (ABC), pH 8,0 och två gånger med vatten som tidigare beskrivits och byt ut kontakten.
4. Eluering av peptider
- Eluera de märkta peptiderna genom att tillsätta 100 μL 20 mM DTT i 100 mM ABC, pH 8,0, till varje kolonn med hjälp av en mikropipett och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter på en termomixer inställd på 850 rpm.
OBS: Efter tillsats av DTT kommer hartset att klumpa sig. Hartset kan störas med en pipettspets för att bryta upp klumpar och säkerställa fullständig eluering av peptiderna. - Efter denna inkubation, placera kolonnen på ett vakuumgrenrör avsett för fastfasextraktion (SPE), applicera vakuum och eluera proverna i ett 5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa detta steg en gång.
- Slutligen tillsätt 100 μl 80 % ACN med 0,1 % TFA, inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur och eluera i samma 5 ml centrifugrör. Samla alla fraktioner i samma 5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: För att förhindra provförlust måste lågbindande rör användas för eluering, och volymerna måste hållas vid eller under en volym på 4,0 ml för ett enda 5 ml rör. - Placera de eluterade proverna i ett vakuumkoncentrator tills det är torrt. Förvara de torra peptiderna vid -80 °C och återsuspendera dem senare.
OBS: Prover kan också elueras separat, och en alikvot kan tas bort och analyseras av SDS-PAGE för analys på peptidnivå innan proverna kombineras.
5. Peptidalkylering och avsaltning/sanering
- Återsuspendera de torkade peptiderna genom att tillsätta en liten volym 100 mM ABC-buffert, pH 8,0 (högst 500 μL), med hjälp av en mikropipett. Använd upprepad ultraljudsbehandling för 15-30 s åt gången med hjälp av en bad sonicator med en utgång på 250 W och virvel för att solubilisera och överföra till en 2 ml rör.
OBS: Volymen på 100 mM ABC, pH 8,0 som ska tillsättas baseras på den volym som behövs för att återsuspendera DTT vid en molaritet av 150 mM. Användarna måste bestämma mängden DTT som finns i deras prov baserat på vad som ursprungligen lades till i steg 4.1. - Tillsätt tillräckligt med koncentrerad stamlösning (600 mM) jodacetamid (IAA) upplöst i den automatiska ljusstyrkeregleringen med hjälp av en mikropipett för att uppnå ett molförhållande på 1:4 av DTT:IAA och inkubera proverna vid RT i 1 timme med skakning vid 850 rpm.
- Surgör proverna till pH < 3 genom att tillsätta koncentrerad TFA (10%) med hjälp av en mikropipett och utför provavsaltning med omvänd fasrengöring enligt tillverkarens instruktioner.
- Placera de rena peptiderna i en vakuumkoncentrator tills de är torra. Förvara de torra peptiderna vid -80 °C tills vidare analys.
6. Vätskekromatografi-tandem masspektrometri
- Resuspendera de torkade peptiderna genom upprepad ultraljudsbehandling för 15-30 s åt gången med hjälp av en bad sonicator med en utgång av 250 W och virvel i 20-40 μL vatten innehållande 3% ACN. Bestäm peptidkoncentrationen genom att utföra en BCA-analys enligt tillverkarens protokoll.
- Separera proverna med omvänd fas LC och MS / MS som tidigare beskrivits6 och registrera MS1-spektra över m / z-intervallet 400-2000. Se till att kollisionsdissociation med hög energi (HCD) används för att erhålla information om reporterjonintensitet för analys av isobariskt märkta peptider. Se metodavsnitten i tidigare rapporter för mer information om instrumentkörningsförhållanden 27,30 och analys av MS-data 27,31.
OBS: Olika LC-MS / MS-system eller inställningar kan användas för att analysera peptidproverna. Täckningen och känsligheten för peptididentifiering beror på det specifika systemet och inställningarna som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slutförandet av protokollet kommer att resultera i mycket specifik anrikning av tidigare oxiderade cysteinhaltiga peptider, ofta med >95% specificitet 27,35,36. Flera viktiga steg i protokollet kräver emellertid särskild uppmärksamhet, t.ex. den initiala blockeringen av fria tioler före provlys/homogenisering, vilket förbjuder artificiell oxidation och icke-specifik anrikning av artificiellt oxiderade tioler25. Prover kan analyseras i flera steg i protokollet och med olika metoder, inklusive SDS-PAGE-analys av både proteiner och peptider. SDS-PAGE möjliggör kvalitativ analys av prover där total-tiolprover möjliggör ratio-metriska jämförelser mellan prover för att bestämma olika nivåer av oxidation på grund av behandlingar/stimuli (Figur 2A). För att ytterligare undersöka oxidationsnivåerna för enskilda proteiner kan SDS-PAGE-geler utsättas för western blotting36 (figur 2B). Detta gör det möjligt att analysera modellsystemet mer detaljerat, vilket genererar stödjande data och ytterligare hypoteser om nätverk och biologiska vägar. Dessa metoder/stödjande data kan också användas som kvalitetskontroll för att bekräfta de förväntade svaren innan ytterligare djupgående analys såsom LC-MS/MS. Reporterjonintensiteter av cysteinhaltiga peptider analyserade av LC-MS/MS kan användas för att kvantifiera tioloxidationsstökiometri på individuella Cys-platsnivåer (figur 2C,D).
Bild 1: Arbetsflöde för exempelbearbetning. Arbetsflödet för provbearbetning är anpassningsbart för att undersöka tioloxidation i olika provtyper och biologiska system. Arbetsflödet möjliggör undersökning av oxidation på både protein- och peptidnivå (t.ex. SDS-PAGE, western blot) samt djup täckning för kvantitativ, platsspecifik identifiering av enskilda cysteinställen med hjälp av HPLC i kombination med masspektrometri. Provbearbetning kan slutföras på så lite som tre dagar, inklusive slutförandet av flera kritiska steg för generering av konsekventa kvalitetsdata. Provmultiplexering via TMT-märkning möjliggör bearbetning av flera prover parallellt samtidigt. Det representativa 10-plex TMT-märkningsschemat illustrerar hur prover kan ordnas med tanke på den potentiella överhörningen från den totala tiolkanalen. Med de isotopiska föroreningarna hos TMT-reagenserna kan signalintensiteten hos en kanal med hög intensitet (såsom total-tiol) bidra till en annan kanal med låg signalintensitet och påverka dess kvantifiering37. I schemat förväntas en poolad total-tiolkanal (en kombination av kontroll- och experimentella prover) innehålla höga nivåer av Cys-peptider och är märkt med 131N, som kommer att ha en signal i kanal 130N. Således används inte kanal 130N i experimentet. Mängden kanalöverhörning som skapas av TMT-etiketter finns i tillverkarens analyscertifikat för en motsvarande sats av reagenset. Denna siffra har anpassats från Guo et al., Nature Protocols, 201425. Förkortningar: NEM = N-etylmaleimid; DTT = ditiotreitol; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; SPE = fastfasextraktion; LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri; TMT = tandemmasstagg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av peptider från RAC-anrikning. (A) SDS-PAGE-analys av oxiderade peptider från RAW 264.7-celler behandlade med den kemiska oxidanten, diamid, i 30 minuter vid ökande koncentrationer (0.1 och 0.5 mM) och totala peptidtioler. Denna underfigur och underfigur D är anpassade från Guo et al., Nature Protocols, 2014 25. Peptider visualiserades genom silverfärgning. (B) RAW 264,7 celler behandlades med exogena oxidanter (väteperoxid och diamid) vid ökande koncentrationer. Det resulterande SSG-berikade proteinet eluat separerades av SDS-PAGE och undersöktes därefter av western blot för enskilda proteiner (GAPDH, TXN, PRDX3 och ANXA1). Denna underfigur är anpassad från Su et al., Free Radical Biology and Medicine, 201436. (C) Representativa MS/MS-spektrumdata för en cysteininnehållande peptid sedd i Xcalibur-programvaran. Den infällda MS/MS-bilden visar motsvarande reporterjonintensiteter för samma peptid i varje TMT-kanal. I detta experiment tilldelades det totala tiolprovet TMT-etiketten 131N, som har den högsta intensiteten av alla kanaler som används i experimentet. D) Stökiometri av iTRAQ-märkta, berikade, oxiderade peptider mätt med LC-MS/MS. Den totala tiolkanalen användes som referens för att beräkna stökiometrin för oxidation baserat på förhållandet mellan reporterjonintensiteten för varje prov jämfört med den för den totala tiolkanalen. Förkortningar: RAC = hartsassisterad fångst; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; Ctrl = kontroll; GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas; TXN = tioredoxin; PRDX3 = tioredoxinberoende peroxidreduktas; ANXA1 = bilaga i A1, LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri; MS/MS = tandemmasspektrometri; TMT = tandemmasstagg; iTRAQ = isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffertens namn | Avsikt | Innehåll |
| Buffert A | Lys/homogenisering | 250 mM 2-(N-morfolin)etansulfonsyra (MES), pH 6,0; 1% natriumdodecylsulfat (SDS); 1% Triton X-100; och 100 mM N-etylmaleimid (NEM) |
| Buffert B | Resuspension efter proteinutfällning och första buffertutbyte | 250 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra (HEPES), pH 7,0; 8 M urea; 0,1% SDS |
| Buffert C | Reduktion/anrikning/matsmältning av cysteinhaltiga proteiner | 25 mM HEPES, pH 7,7; 1 M urea; 0,1% SDS |
| Buffert D | Andra buffertutbytet efter sänkning | 25 mM HEPES, pH 7,0, 8 M urea; 0,1% SDS |
| Buffert E | Tvätta hartset efter hydrering | 25 mM HEPES, pH 7,7 |
Tabell 1. Förteckning över buffertar
Kompletterande information. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hartsassisterad fångst har använts i en mängd olika provtyper och biologiska system för undersökning av oxidativa modifieringar av cysteinrester25,29,30. Denna metod möjliggör utvärdering av prover på flera nivåer och avläsningar, inklusive proteiner och peptider med hjälp av SDS-PAGE och western blot-analys, såväl som enskilda cysteinställen med masspektrometri. Oavsett provtyp eller slutlig slutpunkt möjliggör metoden i slutändan mycket effektiv och specifik anrikning av cysteinhaltiga proteiner och peptider38. Med hjälp av RAC har vi identifierat förändringar i oxidationstillståndet för upp till flera tusen cysteinställen i olika modellsystem efter en störning.
Hos möss som utsattes för tröttande muskelsammandragningar identifierades 2 200 S-glutationyleringsställen, där mer än hälften hade signifikant förändrade nivåer av S-glutationylering 32. RAC har också använts för att profilera reversibel tioloxidation av >2,100 platser i cyanobakterier efter exponering för en fotosynteshämmare eller olika ljusförhållanden6. Nyligen profilerade vi total reversibel tioloxidation och S-glutationylering av >4 000 cysteinställen i RAW 264,7 makrofagceller under viloförhållanden27. kvantifierade oxidationen av ~ 4,200 cysteinställen i A431-celler efter epidermal tillväxtfaktorstimulering39. Dessa studier visar robustheten hos RAC för att identifiera många cystein platser (minst flera tusen) som genomgår reversibel tiol oxidation. Dessutom kan fraktionering av prover förbättra täckningen av peptider som återvinns från ett experiment.
Utanför experimentella kontroller, där antingen positiva eller negativa kontrollprover kan användas för att bekräfta modellsystemets biologiska svar, kan total tiolanrikning utföras parallellt med oxidation av tioler. Detta totaltiolingprov ger både stökiometriska jämförelser och en baslinje från vilken experimentella eller behandlade prover kan jämföras. Kort sagt, detta totala tiolprov ger en mätning av det totala antalet cysteintioler för ett givet Cys-ställe i ett givet prov. Detta koncept antogs också av OxiTMT-metoden, som genererar prover som innehåller helt reducerade tioler som representerar "totalt cysteininnehåll" för jämförelse med oxiderade cysteiner40.
Till skillnad från OxiTMT begränsas RAC inte av plex-antalet jodTMT och kan därmed införliva fler totala tiolkanaler för att bättre representera tiolhalten i flera provtyper som används i en studie. Dessutom kan beredning av ett globalt prov (inte föremål för anrikning) parallellt med arbetsflödet för tiol redoxproteomik behövas för att kontrollera om proteinmängder förändras i olika provtyper. Eftersom metoden kan anpassas till flera typer av redoxmodifieringar måste lämpliga kontroller för den specifika ändringen av intresse övervägas. Till exempel är ultraviolett ljus och kvicksilverklorid båda effektiva för att klyva SNO från proteiner, vilket skapar en effektiv negativ kontroll för mätning av SNO 7,25. En effektiv kontroll för att undersöka SSG-modifierade proteiner är utelämnandet av glutaredoxinenzymet från reduktionscocktailen under reduktionssteget. På grund av den relativt höga specificiteten hos glutaredoxin eliminerar dess utelämnande minskningen av SSG-modifierade proteiner och förhindrar att de genomgår disulfidutbyte och slutligen berikas i den slutliga analysen36.
Det finns flera steg i arbetsflödet för RAC som är grundläggande för generering av kvalitetsreproducerbara data. Ett av de första avgörande stegen, och det viktigaste, är alkylering/blockering av fria tioler med hjälp av det membrangenomsläppliga alkyleringsmedlet N-etylmaleimid (NEM), som reagerar snabbt över ett brett pH-område 41,42. Detta steg förbjuder att framväxande tioler oxideras under provbearbetningen och mildrar icke-specifik anrikning av dessa artificiellt oxiderade tioler under anrikning av disulfidutbyte. Otillräcklig alkylering kommer att resultera i en ökad bakgrund och falskt positiv signal, vilket identifierades i en tidigare rapport6.
På grund av dess höga reaktivitet och förmåga att blockera fria tioler måste dock försiktighet också vidtas för att säkerställa att det fullständigt avlägsnas från prover före anrikning, där eventuella återstående NEM kan binda och störa hartskopplingen, vilket i slutändan resulterar i signalförlust på grund av en minskning av proteinbindningen. Detta åstadkoms genom att utföra acetonutfällning och flera omgångar av buffertutbyte med hjälp av molekylviktsavgränsningsfilter. Övervakning och upprätthållande av korrekt pH i hela protokollet är också avgörande. Ett pH på 6,0 bibehålls för att mildra disulfidblandning och bildandet av blandade disulfider före anrikning. Andra åtgärder där extra försiktighet måste vidtas inkluderar anriknings- och elueringsstegen, där pH-värden på 7,7 och 8,0 krävs för korrekt anrikning respektive eluering. Felaktiga pH-värden under dessa steg kommer att resultera i en minskning eller förlust av signal.
Hittills finns det många kemibaserade metoder förutom RAC som används i stor utsträckning för att studera cysteintioloxidation, inklusive den mest använda metoden, biotinomkopplartekniken43,44. En sak som alla dessa metoder har gemensamt, inklusive RAC, är att de är baserade på indirekta metoder för detektion av oxiderade cysteiner. De förlitar sig på kemiskt modifierade mellanprodukter av den ursprungliga oxiderade tiolen för detektion. Emellertid, ett nyckelattribut som skiljer RAC från andra metoder är förmågan att samla in multiplexerade, kvantitativa data om specifika cystein platser av oxiderade tioler.
Metoden utförs med proteiner/peptider kovalent bundna till hartset, vilket gör att stegvisa (t.ex. reduktion, märkning, tvättning, matsmältning) kan utföras utan vidare hantering. Genom att utföra LC-MS/MS på multiplexerade prover genereras datauppsättningar som möjliggör proteomomfattande upptäckter. Effekterna av en specifik behandling eller stimuli över flera provgrupper observeras på global nivå, vilket möjliggör upptäckt av nya mekanismer och vägar. Det grundläggande arbetsflödet är mycket anpassningsbart till slutanvändarnas specifika behov och intresseområden. Ortogonal validering av fynd som observerats i masspektrometridata är fortfarande en utmaning. Platsstyrd mutagenes av en specifik plats och användning av analyser som undersöker de resulterande effekterna är ett vanligt men arbetsintensivt tillvägagångssätt.
För att screena kandidatplatser som kan vara biologiskt signifikanta kan bioinformatiska studier användas för att lära sig mer om egenskaperna hos en plats med hög oxidationsnivå, såsom en plats närhet till en aktiv plats eller sekundär struktur27. Molekyldynamiksimuleringar kan visa sig vara av stort värde i framtida studier eftersom de kan modellera effekterna av redoxmodifieringar på proteinstrukturen och ge insikt i hur ett proteins funktion kan påverkas13,45. Genom att implementera denna robusta strategi hoppas vi att det vetenskapliga samfundet kommer att dra nytta av att anpassa denna metod till sitt eget unika modellsystem och utöka den nuvarande kunskapen om redoxbiologi över många olika modeller och biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter, ekonomiska eller på annat sätt.
Acknowledgments
Delar av arbetet stöddes av NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 och U24 DK112349
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
- Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
- Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
- Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
- Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
- Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
- Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B.
- Go, Y. M., Jones, D. P.
- Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
- Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
- Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
- Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
- Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
- Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
- Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
- Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
- Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
- Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
- Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
- Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
- Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
- Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
- Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
- Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
- Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
- Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
- Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
- Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
- Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
- Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
- Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
- Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
- Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
- Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
- Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
- Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
- Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
- Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
- Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
- Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).
