3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Zusammenfassung

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Astrozyten sind Gliazellen mit einer wesentlichen Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), einschließlich neuronaler Unterstützung und Funktionalität. Diese Zellen reagieren auch auf neuronale Verletzungen und schützen das Gewebe vor degenerativen Ereignissen. In-vitro-Studien zur Funktionalität von Astrozyten sind wichtig, um die Mechanismen solcher Ereignisse aufzuklären und zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen beizutragen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Biofabrikation einer neuralen Gewebestruktur, die reich an Astrozyten ist, durch 3D-Bioprinting von Astrozyten-beladener Bioink. Ein extrusionsbasierter 3D-Bioprinter wurde in dieser Arbeit verwendet, und Astrozyten wurden aus den Gehirnkortexen von C57Bl/6 Mäusenwelpen extrahiert. Die Bioink wurde hergestellt, indem kortikale Astrozyten von bis Zurgang 3 zu einer Biomateriallösung aus Gelatine, Gelatine-Methacryloyl (GelMA) und Fibrinogen gemischt wurden, ergänzt mit Laminin, das optimale Bioprinting-Bedingungen aufwies. Die 3D-Bioprinting-Bedingungen minimierten den Zellstress und trugen zur hohen Lebensfähigkeit der Astrozyten während des Prozesses bei, bei dem 74,08% ± 1,33% der Zellen direkt nach dem Bioprinting lebensfähig waren. Nach 1 Woche Inkubation stieg die Lebensfähigkeit der Astrozyten signifikant auf 83,54% ± 3,00%, was darauf hindeutet, dass das 3D-Konstrukt eine geeignete Mikroumgebung für das Zellwachstum darstellt. Die Zusammensetzung des Biomaterials ermöglichte die Zellanheftung und stimulierte das astrozytäre Verhalten, wobei zellen den spezifischen Astrozytenmarker glial fibrillary acidic protein (GFAP) exprimierten und eine typische astrozytäre Morphologie besaßen. Dieses reproduzierbare Protokoll bietet eine wertvolle Methode zur Bioschmierung von 3D-neuralem Gewebe, das reich an Astrozyten ist und der nativen Mikroumgebung der Zellen ähnelt, nützlich für Forscher, die die Funktionalität von Astrozyten und ihre Beziehung zu den Mechanismen neurologischer Erkrankungen verstehen wollen.

Einleitung

Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und spielen eine Schlüsselrolle bei der Homöostase des Gehirns. Neben der dauerhaften neuronalen Unterstützung sind Astrozyten für die Modulation der Aufnahme von Neurotransmittern, die Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und die Regulierung der neuronalen Synaptogenese verantwortlich^1,2. Astrozyten spielen auch eine wesentliche Rolle bei ZNS-Entzündungen und reagieren auf Verletzungen des Gehirns in einem Prozess, der zu einer Astrocitary-Reaktivität oder reaktiven Astrogliose führt³<....

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren folgten den internationalen Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (http://www.iclas.org) und wurden vom Komitee für Ethik in der Forschung der Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519) genehmigt.

1. Gehirndissektion von Mäusen

1. 10 ml kalte Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) in eine 100 mm Kulturschale und 1 ml in eine 1,5 ml Mikroröhre geben. Bereiten Sie eine Mikroröhrchen pro Tier vor.
   HINWEIS: Sowohl die Kulturschale als auch die Mikroröhre müssen auf Eis aufbewahrt werden.
2. Bereiten Sie Astrozytenkulturmedium mit DMEM F12 + 10% fetalem Rinderserum (FBS....

Ergebnisse

Diese Arbeit zielte darauf ab, ein neuralähnliches Gewebe zu entwickeln, das die 3D-Bioprinting-Technologie nutzt, um Schicht für Schicht primäre Astrozyten-beladene Gelatine / GelMA / Fibrinogen-Biotinte abzuscheiden. Astrozyten wurden extrahiert und aus der Großhirnrinde von Mäusewelpen isoliert (Abbildung 1), zu einer Biomaterialzusammensetzung hinzugefügt, die die Biofabrikation eines lebenden 3D-Konstrukts ermöglicht.

Das Computer-Aided-Design (CAD) wurde unt.......

Diskussion

Die 3D-Bioprinting-Technologie hat sich als Biofabrikationsalternative herausgestellt, die die Entwicklung verfeinerter Konstrukte ermöglicht, die strukturell und physiologisch nativen Geweben ähneln²², einschließlich des Gehirns²³. Die Biofabrikation von neuralähnlichen Geweben ermöglicht eine in vitro native Mikroumgebungsmodellierung und ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die mit der Entwicklung und Behandlung .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-Bioprinter	3D-Biotechnologie-Lösungen		Biodrucker auf Extrusionsbasis
Pinzette mit stumpfer Spitze	Integra Miltex	6--30	Pinzette für die Dissektion des Gehirns Zuvor sterilisiertes
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Proteasefrei, fettsäurefrei, im Wesentlichen globulinfrei
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Zellkulturkolben	Fisher Scientific	156340	Kulturkolben T25
Zellsieb	Corning Incorporated	352340	Zellsieb 40 & Mikro; m
Konfokalmikroskop	Leica		Confocal TCS SP8 Mikroskopie in Verbindung mit einem konfokalen Olympus FluoView 300 System
Konische Röhrchen	Thermo Scientific	339651, 339652	Sterile Röhrchen mit 15 mL und 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	DAPI Färbelösung
DMEM/F12	Gibco; Life Technologies Corporation	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) mit L-Glutamin-Dyalisis-Schlauch
	Sigma-Aldrich	D9527	Molekulargewichts-Cut-off = 14 kDa
Ethanol	Fisher Scientific	64-15-5	Reagenzqualität
Fötales Rinderserum	Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	Forschungsqualität
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogen Kristallinpulver aus Rinderplasma
Gelatine	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatinepulver aus Schweinehaut
Glycin	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glycinpulver
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	Kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutamin kristallines Pulver
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live Dead Cell Imaging Kit	Thermo Scientific	R37601	Grüne Fluoreszenz in lebenden Zellen (ex/em 488 nm/515 nm). Rote Fluoreszenz in toten Zellen (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylanhydrid	Sigma-Aldrich	760-93-0	Für die GelMA-Vorbereitung
Mikroröhrchen	Corning Incorporated	MCT-150-C	Mikroröhrchen mit 1,5 mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Nadel 22G	Fisher Scientific	NC1362045	Sterile stumpfe Nadel
Betrieb Schere	Integra Miltex	05--02	Scharfe Schere für die Dissektion des Gehirns, zuvor sterilisiert
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehydpulver
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Pen Strep (5.000 Einheiten/ml Penicillin; 5.000 μg/ml Streptomycin)
Petrischale	Corning Incorporated 430591	, 430588	Sterile Petrischalen von 35 und 100 mm
Phalloidin	Abcam	ab176753	iFluor 488 Reagenz
Photoinitiator	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hydroxy-4′-(2-Hydroxyethoxy)-2-
Methylpropiophenonphosphat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, Kulturqualität, kein Calcium, kein Magnesium
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Poly-L-Lysinhydrobromid mol wt 30.000-70.000
Primärer Antokörper	Abcam	ab4674	Huhn polyklonal zu GFAP
Sekundärer Antikörper	Abcam	ab150176	Alexa Fluor 594 Anti-Hühnerspatel
	Miltex	V973-70	Nummer 24 Zementspatel zuvor sterilisiert
Stereomikroskop	Fisherbrand	3000038	Mikroskop für die Dissektion des Gehirns
Spritze 5 mL	BD	1222C84	Sterile Spritze
Spritzenfilter 2 & Mikro; m	Fisher Scientific	09-740-105	Polypropylenfilter für die Sterilisation
Thrombin	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Thrombin Kristallinpulver aus Rinderplasma
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Trypsin-EDTA	Gibco in Laborqualität; Life Technologies Corporation	15400054	Trypsin ohne Phenolrot 1 x verdünnt in PBS
Versene Lösung	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	Versene Solution (0,48 mM), formuliert als 0,2 g EDTA(Na4) pro Liter PBS
Well-Platte	Thermo Scientific	144530	Sterile 24-Well-Platte