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Methodenartikel

Hochdruck-NMR-Experimente zum Nachweis von proteinarmen Konformationszuständen

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DOI:

10.3791/62701

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29. Juni 2021

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1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine Hochdruckzelle zusammenzubauen, Hochdruck-NMR-Experimente einzurichten und aufzuzeichnen und schließlich sowohl die Spitzenintensität als auch chemische Verschiebungsänderungen unter Druck zu analysieren. Diese Experimente können wertvolle Einblicke in die Faltungswege und die strukturelle Stabilität von Proteinen liefern.

Zusammenfassung

Hochdruck ist eine bekannte Störungsmethode, mit der globuläre Proteine destabilisiert und Proteinkomplexe reversibel dissoziiert werden können. Hydrostatischer Druck treibt thermodynamische Gleichgewichte in Richtung des/der Zustand(e) mit dem unteren molaren Volumen. Steigender Druck bietet daher die Möglichkeit, die Stabilität von kugelförmigen Proteinen und die Oligomerisierungsgleichgewichte von Proteinkomplexen fein abzustimmen. Hochdruck-NMR-Experimente ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Faktoren, die die Stabilität von kugelförmigen Proteinen, ihre Faltungsmechanismen und Oligomerisierungsmechanismen steuern, indem die Feinstabilitätsabstimmungsfähigkeit der Druckstörung und die Standortauflösung der Lösungs-NMR-Spektroskopie kombiniert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der lokalen Faltungsstabilität eines Proteins über eine Reihe von 2D-1H-15N-Experimenten, die von 1 bar bis 2,5 kbar aufgezeichnet wurden. Die für die Erfassung und Analyse solcher Experimente erforderlichen Schritte werden anhand von Daten veranschaulicht, die auf der RRM2-Domäne von hnRNPA1 erfasst wurden.

Einleitung

Es ist seit langem bekannt, dass energiereichere, dünn besiedelte Konformationszustände von Proteinen und Proteinkomplexen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Signalwegen spielen1,2,3. Dank Experimenten, die unter anderem auf Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5und Dark-State Exchange Saturation Transfer (DEST)6 Pulssequenzen basieren, hat sich die Lösungs-NMR-Spektroskopie als Methode der Wahl zur Charakterisierung transienter Konformationszustände7herauskristallisiert. Zusammen mit diesen Experimenten können Störungen wie Temperatur, pH-Wert oder chemische Denaturierungsmittel eingeführt werden, um die relative Population von konformationsreicheren Substaten zu erhöhen. In ähnlicher Weise können Proteingleichgewichte auch durch Anwendung eines hohen hydrostatischen Drucks gestört werden. Abhängig von der Größenordnung der Volumenänderung, die mit den entsprechenden Konformationsänderungen verbunden ist, kann ein Druckanstieg um einige hundert bis einige tausend bar einen höheren Energiezustand signifikant stabilisieren oder dazu führen, dass sich ein Protein vollständig entfaltet8,9,10. Protein-NMR-Spektren zeigen typischerweise zwei Arten von Veränderungen mit hydrostatischem Druck: (i) chemische Verschiebungsänderungen und (ii) Änderungen der Spitzenintensität. Chemische Verschiebungsänderungen spiegeln Veränderungen an der Proteinoberflächen-Wasser-Grenzfläche und/oder lokale Kompression der Proteinstruktur auf einer schnellen Zeitskala (relativ zur NMR-Zeitskala)wider 11. Crosspeaks, die große nichtlineare chemische Verschiebungen aufweisen, können auf das Vorhandensein von konformationsreicheren Zuständen hinweisen12,13. Auf der anderen Seite deuten Änderungen der Spitzenintensität auf große Konformationsübergänge auf einer langsamen Zeitskala hin, wie z. B. Veränderungen in gefalteten / entfalteten Zustandspopulationen. Das Vorhandensein von Faltungszwischenprodukten oder höheren Energiezuständen kann aus großen Variationen in der Größe der Volumenänderung bei der Entfaltung nachgewiesen werden, gemessen für verschiedene Rückstände eines bestimmten Proteins14,15,16,17. Basierend auf unserer Erfahrung zeigen selbst kleine Proteine, die typischerweise als Zwei-Zustands-Ordner klassifiziert werden, ungleichmäßige Reaktionen auf Druck, was nützliche Informationen über ihre lokale Faltungsstabilität liefert. Hier wird ein Protokoll zur Erfassung und Analyse der Amid-Spitzenintensität und der 1H chemischen Verschiebungen der Druckabhängigkeit beschrieben, wobei als Modellprotein das isolierte RNA-Erkennungsmotiv 2 (RRM2) des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1 (hnRNPA1) verwendet wird.

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Protokoll

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll erfordert (i) eine Hochdruckpumpe und -zelle mit einem 2,5 kbar aluminiumgespannten Zirkonoxidrohr18,(ii) die Software SPARKY19 zur Analyse der NMR-Spektren und (iii) eine Kurvenanpassungssoftware.

1. Probenvorbereitung, Montage der Hochdruckzelle und Aufbau der Experimente.

  1. Wahl des Puffers: Verwenden Sie eine gleiche Mischung aus anionischen und kationischen Puffern wie Phosphat und Tris20,21.
    HINWEIS: Der pKa von anionischen Puffern wie Phosphat und MES ist mit einem erheblichen Reaktionsvolumen verbunden (d.h. der Differenz in den partiellen Molalvolumina der Säure und der ionisierten Produkte). Der pH-Wert solcher Puffer kann daher durch eine Druckänderung (~0,25-0,5 pH-Einheit/kbar) erheblich beeinflusst werden.
  2. Stellen Sie sicher, dass das erforderliche Probenvolumen dem eines Standard-NMR-Röhrchens mit 3 mm Durchmesser (~ 300μL) ähnelt.
  3. Die 15N-markierte Probe mit einer Glaspipette in das Zirkonoxidröhrchen einführen. Stellen Sie sicher, dass die Probe am Boden des Röhrchens sitzt. Komplett mit 200 μL Mineralöl, um zu verhindern, dass sich die Probe mit der Transmissionsflüssigkeit (z. B. Wasser) vermischt. Füllen Sie den Rest des Röhrchens mit Getriebeflüssigkeit.
  4. Legen Sie einen Einweg-O-Ring auf das Zirkonoxidrohr und schieben Sie das Rohr in die Basis (Abbildung 1A, B). Verbinden Sie dann das Rohr mit der Hochdruck-Haltelinie und ziehen Sie die Basis zuerst von Hand an der Zelle fest. Wenden Sie dann 14,7 Nm Drehmoment an, um Leckagen bei niedrigerem Druck zu verhindern (Abbildung 1C, D).
  5. Um die Integrität der Druckzellenanordnung zu überprüfen, drücken Sie das Rohr bis zu 300 bar außerhalb des Spektrometers mit Zellunterstützung und Containment-Gefäß. Warten Sie 15 Minuten, setzen Sie den Druck auf 1 bar zurück und überprüfen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch auf Lecks.
  6. Setzen Sie das drucklose Rohr in das Spektrometer ein, indem Sie die Seillinie vorsichtig führen. Schieben Sie das Röhrchen in das Spektrometer, bis die Sitzposition der Probe erreicht ist (Abbildung 1E).
  7. Sperren, Shimen, Anpassen und Abstimmen der 1H- und 15N-Kanäle wie gewohnt.
    HINWEIS: Shims für Hochdruck-Zirkonoxidrohre unterscheiden sich stark von Standard-NMR-Rohren. Es wird empfohlen, die optimierten Shims für die zukünftige Verwendung zu speichern.
  8. Richten Sie einen 1H-15N-HSQC oder TROSY-HSQC ein und zeichnen Sie ein Referenzexperiment unter atmosphärischen Bedingungen auf (1bar).

2. Aufzeichnung von Hochdruck-NMR-Experimenten

  1. Erhöhen Sie schrittweise den Druck von 1 bar auf 2,5 kbar mit 500 bar-Schritten, um die Gesamtstabilität des Proteins zu testen. Stellen Sie die Drehzahl der Druckpumpe standardmäßig auf ~18 bar/s ein. Wenn die genauen Falt-/Entfaltungsraten nicht bekannt sind, lassen Sie die Probe 15-20 Minuten nach jedem 500-bar-Schritt ausgleichen. Zeichnen Sie ein Spektrum mit 2,5 kbar auf.
  2. Verringern Sie den Druck allmählich wieder auf 1 bar mit 500 bar Schritten, um die Reversibilität der Druckstörungen zu testen. Zeichnen Sie ein anderes Spektrum unter atmosphärischen Bedingungen auf und vergleichen Sie die chemischen Verschiebungen und Spitzendichten mit denen des Referenzspektrums, das zuvor unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde.
    HINWEIS: Wenn die nativen Kreuze nach dem Drucklauf intensiver sind, kann dies darauf hindeuten, dass kleine Aggregate, die bei atmosphärem Druck in Lösung vorhanden sind, sich dissoziiert und ordnungsgemäß neu gefaltet haben können. Auf der anderen Seite deuten ein Intensitätsverlust oder signifikante chemische Verschiebungsänderungen darauf hin, dass das Protein unter Hochdruckbedingungen eine nicht reversible Fehlfaltung erfahren kann.
  3. Zeichnen Sie eine Reihe von 2D-Experimenten von 1 bar bis 2,5 kbar alle 500 bar auf. Es wird empfohlen, zusätzliche Experimente in der Nähe des Wendepunkts des Falt-/Entfaltungsübergangs aufzuzeichnen, um die Präzision der Passform zu verbessern.

3. Analyse von Änderungen der Spitzenintensität

  1. Verarbeiten Sie alle Spektren und übertragen Sie die Backbone-Zuweisung vom Referenzspektrum bei 1 bar auf das bei 500 bar aufgezeichnete Spektrum und übertragen Sie dann die Zuweisung von 500 bar auf 1 kbar und so weiter.
    HINWEIS: Da Druck eine ungleichmäßige Verschiebung von 1H und 15N chemische Verschiebungen induziert, kopieren Sie nicht einfach die Backbone-Zuordnung von einem Spektrum zum nächsten. Passen Sie es manuell an.
  2. Klicken Sie im Sparky-Menü auf Peak > Peak List (lt). Klicken Sie im Fenster Peakliste auf Optionen und wählen Sie die Option, um sowohl Frequenzen (ppm) als auch Datenhöheanzuzeigen. Speichern Sie die für jedes Spektrum erhaltene Liste.
  3. Kopieren Sie in einer Kurvenanpassungssoftware die Crosspeak-Identität und die Spitzenintensitätswerte, um die Druckwerte (in bar) als X-Achsenvariable und die Intensität als Y-Achsenvariable zu erhalten.
  4. Wenn eine vollständige oder nahezu vollständige (>80%) Entfaltung beobachtet wird, passen Sie die einzelnen Spitzenintensitätsprofile an, um die freie Energie- bzw. Volumenänderung bei der Entfaltung mit einem einfachen Zwei-Zustands-Modell zu extrahieren:
    figure-protocol-1Gleichung 1
    Dabei ist "I" die beobachtete Intensität eines Crosspeaks bei einem gegebenen Druck p und IF ist die Intensität desselben Crosspeaks in einem vollständig gefalteten Zustand. R ist die Gaskonstante, T ist die absolute Temperatur, ΔGU0 die Standard-Gibbs-Freie-Energiedifferenz zwischen dem entfalteten und dem gefalteten Zustand bei Atmosphärendruck p0 (1 bar) und ΔVu die Volumenänderung beim Entfalten. Mit dem Druck p in bar und der Temperatur T in Kelvin, R = 1,987 cal/K, ist ΔGU0 in cal/mol und ΔVU in cal/mol/bar. Multiplizieren Sie die ΔVU-Werte, die aus der Anpassung erhalten wurden, mit 41,84, um sie in ml/mol umzurechnen. ΔVU-Werte liegen typischerweise im Bereich von -50 bis -150 ml/mol für kugelförmige Proteine22. Hier werden alle Parameter in Bezug auf die Entfaltungsreaktion ausgedrückt, können aber leicht in Faltreaktionsparameter umgewandelt werden (ΔGU0 = -ΔGF0 und ΔVU = -ΔVF).

4. Analyse chemischer Verschiebungsänderungen

  1. Ordnen Sie die Spalten in der Software so an, dass druckpunkte als variabel und die aus Sparky extrahierten chemischen Verschiebungen von 1H als Y-Achse aufgeführt werden.
  2. Passen Sie die Druckabhängigkeit der chemischen Verschiebungenvon 1 H an eine einfache quadratische Gleichung an:
    δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Äq. 2
    Wobei δ(p) die gemessene chemische Verschiebung eines Crosspeaks um 1 H bei einemgegebenen Druck p und δ0(p0) die 1H chemischen Verschiebungen desselben Crosspeaks im Referenzspektrum bei 1 bar gemessen wird. B1 und B2 stellen die Parameter erster und zweiter Ordnung dar, ausgedrückt in ppm/bar bzw. ppm/bar2.

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Ergebnisse

Mit dem hier beschriebenen Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv von hnRNPA1 (Rückstände 95-106), untersucht, das sich im 2,5 kbar-Bereich (>90%) nahezu vollständig entfaltet. 1 H-15N-Spektren wurden bei 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar und 2,5 kbar gesammelt (Abbildung 2). Da keine der nativen Quersprechen oberhalb des Geräuschpegels bei 2,5 kbar sichtbar war, wurde allen entsprechenden Rückständen bei diese...

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Diskussion

Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das implementiert wurde, um die strukturellen und thermodynamischen Reaktionen von Proteinen auf Druckstörungen zu untersuchen. Die hier auf RRM2 aufgezeichneten Hochdruckexperimente zeigen, dass große Variationen derΔV-U-Werte, die auf eine nicht vollständig kooperative Entfaltung hinweisen, in einem relativ kleinen Einzeldomänenprotein gefunden werden können. Ein ähnliches Bild ergibt sich aus der Analyse von 1H chemischen Verschiebungsänderungen unter Druck....

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Offenlegungen

Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt. Sie erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Mittel des Roy J. Carver Charitable Trust an Julien Roche unterstützt. Wir danken J. D. Levengood und B. S. Tolbert für die freundliche Bereitstellung der RRM2-Probe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bruker Nmr Cell 2,5 kbarDaedalus Innovations LLCNMRCELL-B
Sparky3Universität von Kalifornien San Francisco, CAN/A
Xtreme-60 SpritzenpumpeDaedalus Innovations LLCXTREME-60

Referenzen

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