Hochdruck-NMR-Experimente zum Nachweis von proteinarmen Konformationszuständen

Zusammenfassung

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine Hochdruckzelle zusammenzubauen, Hochdruck-NMR-Experimente einzurichten und aufzuzeichnen und schließlich sowohl die Spitzenintensität als auch chemische Verschiebungsänderungen unter Druck zu analysieren. Diese Experimente können wertvolle Einblicke in die Faltungswege und die strukturelle Stabilität von Proteinen liefern.

Zusammenfassung

Hochdruck ist eine bekannte Störungsmethode, mit der globuläre Proteine destabilisiert und Proteinkomplexe reversibel dissoziiert werden können. Hydrostatischer Druck treibt thermodynamische Gleichgewichte in Richtung des/der Zustand(e) mit dem unteren molaren Volumen. Steigender Druck bietet daher die Möglichkeit, die Stabilität von kugelförmigen Proteinen und die Oligomerisierungsgleichgewichte von Proteinkomplexen fein abzustimmen. Hochdruck-NMR-Experimente ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Faktoren, die die Stabilität von kugelförmigen Proteinen, ihre Faltungsmechanismen und Oligomerisierungsmechanismen steuern, indem die Feinstabilitätsabstimmungsfähigkeit der Druckstörung und die Standortauflösung der Lösungs-NMR-Spektroskopie kombiniert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der lokalen Faltungsstabilität eines Proteins über eine Reihe von 2D-1H-15N-Experimenten, die von 1 bar bis 2,5 kbar aufgezeichnet wurden. Die für die Erfassung und Analyse solcher Experimente erforderlichen Schritte werden anhand von Daten veranschaulicht, die auf der RRM2-Domäne von hnRNPA1 erfasst wurden.

Einleitung

Es ist seit langem bekannt, dass energiereichere, dünn besiedelte Konformationszustände von Proteinen und Proteinkomplexen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Signalwegen spielen^1,2,3. Dank Experimenten, die unter anderem auf Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)⁴, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)⁵und Dark-State Exchange Saturation Transfer (DEST)⁶ Pulssequenzen basieren, hat sich die Lösungs-NMR-Spektroskopie als Methode der Wahl zur Charakterisierung transienter Konformationszustände

Protokoll

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll erfordert (i) eine Hochdruckpumpe und -zelle mit einem 2,5 kbar aluminiumgespannten Zirkonoxidrohr^18,(ii) die Software SPARKY¹⁹ zur Analyse der NMR-Spektren und (iii) eine Kurvenanpassungssoftware.

1. Probenvorbereitung, Montage der Hochdruckzelle und Aufbau der Experimente.

1. Wahl des Puffers: Verwenden Sie eine gleiche Mischung aus anionischen und kationischen Puffern wie Phosphat und Tris^20,21.
   HINWEIS: Der pKa von anionischen Puffern wie Phosphat und MES ist mit einem erheblichen ....

Ergebnisse

Mit dem hier beschriebenen Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv von hnRNPA1 (Rückstände 95-106), untersucht, das sich im 2,5 kbar-Bereich (>90%) nahezu vollständig entfaltet. ^{1 H-15}N-Spektren wurden bei 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar und 2,5 kbar gesammelt (Abbildung 2). Da keine der nativen Quersprechen oberhalb des Geräuschpegels bei 2,5 kbar sichtbar war, wurde allen entsprechenden Rückständen bei diese.......

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das implementiert wurde, um die strukturellen und thermodynamischen Reaktionen von Proteinen auf Druckstörungen zu untersuchen. Die hier auf RRM2 aufgezeichneten Hochdruckexperimente zeigen, dass große Variationen der_ΔV-U-Werte, die auf eine nicht vollständig kooperative Entfaltung hinweisen, in einem relativ kleinen Einzeldomänenprotein gefunden werden können. Ein ähnliches Bild ergibt sich aus der Analyse von ¹H chemischen Verschiebungsänderungen unter Druck........

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bruker Nmr Cell 2,5 kbar	Daedalus Innovations LLC	NMRCELL-B
Sparky3	Universität von Kalifornien San Francisco, CA	N/A
Xtreme-60 Spritzenpumpe	Daedalus Innovations LLC	XTREME-60