Summary
여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.
Abstract
세포 외 소포 (EV)는 세포 통신에서 중요한 역할을 하는 생물학적 나노 채소입니다. 그들의 함량은 재생 의학에 있는 중대한 잠재력을 제시하는 단백질 과 핵산과 같은 적극적인 생체 분자를 포함합니다. 최근에는 혈소판 리사테(PL)에서 추출한 전기자동차가 PL에 필적하는 골성 능력을 보여주었다. 게다가, 생체 재료는 정형 외과 또는 치과 복원에 자주 사용됩니다. 여기서는 골성 특성을 향상시키기 위해 PL 유래 EV로 Ti 표면을 기능화하는 방법을 제공합니다.
EV는 크기 제외 크로마토그래피에 의해 PL에서 분리되며, 그 후 Ti 표면은 드롭 캐스팅에 의해 PL-EV로 기능화됩니다. 기능화는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석서에 의해 EV 방출 및 생체 적합성에 의해 입증된다.
Introduction
전기자동차는 모든 세포에 의해 분비되는 멤브레인 소포(30-200 nm)이며 화물을 전달함으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 그(것)들은 핵산, 성장 인자, 또는 생리활성 지질1을 포함할 수 있는 액티브한 생체 분자의 각종을 포함합니다. 이러한 이유로, EV치료에서 그들의 잠재적인 사용에 대 한 평가 되었습니다. 정형 외과 및 뼈 재생의 관점에서, 다른 소스에서 전기 테스트 되었습니다. 그 중에서도 혈소판 유래 전기는 낮은 세포독성 프로파일2,3을 유지하면서 줄기 세포에 대한 분화 효과를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 매일 임상 실습에서 이를 사용하기 위해서는 전기자동차와 생체재료의 결합 가능성을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요하다.
티타늄 기반 생체 재료는 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 장기 내구성으로 인해 뼈 치유 임상 개입을위한 발판으로 널리 사용됩니다4. 그럼에도 불구하고, Ti 임플란트는 생물활성 물질이므로 주변 뼈 조직5와 결합할 수 있는 능력이 좋지 않습니다. 이러한 이유로, 티타늄 수정은 표면에 보다 기능적인 마이크로 환경을 달성하여 성능을 향상시키기 위해 연구되고있다4,6,7. 이러한 의미에서, 전기자동차는 화학8 또는 물리적 상호작용에 의해 티타늄에 고정될 수 있다9,10. 줄기 세포 또는 대식세포로부터 유래된 고정된 전기는 세포 접착 및 증식을 촉진하여 Ti의 생체 활성을 향상시켜 골성 효과를 유도합니다8,9,10.
이 문서는 PL 유래 EV로 Ti 표면을 코팅하기위한 드롭 캐스팅 전략에 중점을 둡니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 따라 코팅 된 표면에서 EV 방출 프로파일을 평가하고 체외에서 세포 생체 적합성을 확인합니다.
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Protocol
혈소판 리사테(PL)는 IdISBa Biobank가 제공하는 신선한 버피 코트를 사용하여 기관 가이드라인3 에 따라 이전에 설명된 바와 같이 얻어진다. 현재 프로젝트에 대한 그들의 사용은 윤리위원회 (IB 1995/12 BIO)에 의해 승인되었습니다.
1. PL에서 격리된 EV
- 더 큰 바디 제거
- 실온에서 PL을 해동하십시오.
- 원심분리기 PL에서 1,500 x g 에서 4°C에서 15분 동안. 이 셀 파편이 포함된 펠릿을 폐기하십시오.
- 상체를 수집하고 4 °C에서 30 분 동안 10,000 x g 에서 2 개의 연속 원심 분리를 수행합니다.
참고: 펠릿은 마이크로베실과 같은 더 큰 전기에 해당하며,이 경우 폐기됩니다. - 상체를 먼저 0.8 μm 다공성 멤브레인을 통과한 다음 0.2 μm 다공성 멤브레인을 통해 필터링합니다.
참고: 이러한 단계는 원하지 않는 모든 EV를 제거합니다. - 필터링된 PL을 풀로 풀과 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
- 크기 제외 크로마토그래피
- 여과된 PBS와 원하는 유량으로 크로마토그래피 장비에 결합된 컬럼을 상형화합니다.
참고: 사용되는 유량은 열 특성에 따라 다릅니다. 이 경우 0.5 mL/분으로 설정됩니다. - 처리된 PL(5mL)을 주사기로 장비에 적재합니다.
- PL을 컬럼에 주입하고 15mL 튜브에서 5mL 분획을 수집하기 시작합니다.
- EV농축 분획을 수집하고 사용할 때까지 -80°C에 보관하십시오.
참고: 처음으로 실험을 수행할 때, 단백질 정량화 및 면역 검출에 의해 모든 분획을 특성화하여 EVs3,11로 농축된 것을 결정합니다. 이 실험에서 9번째 분획이 수집됩니다. - 크로마토그래피 컬럼을 0.2% NaOH 용액의 30mL로 세척하고 평형에 도달하면 20% 에탄올 용액에 보관하십시오.
- 여과된 PBS와 원하는 유량으로 크로마토그래피 장비에 결합된 컬럼을 상형화합니다.
그림 1: 혈소판 리세이트(PL) 세포외 소포(EV) 절연의 회로도도. PL은 먼저 1,500 x g에서 원심 분리된 다음 10,000 x g 에서 더 큰 바디를 제거합니다. 상체는 0.8 및 0.2 μm 필터를 통해 필터링됩니다. 처리된 PL은 컬럼에 로드되고, EV는 크기 배제 크로마토그래피로 구분된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. EV 특성화
참고: 기능학을 수행하기 위해서는 전기자동차 특성화가 필요합니다12. 전자 현미경 검사법 또는 서부 얼룩 특성화는 이전에보고되었다13. 이 보고서는 Ti 표면 기능화를 위한 필수 특성화 기술에 중점을 둡니다.
- 나노 입자 추적 분석 (NTA)
- 0.2 μm 여과 된 PBS에서 전기 자동차 (1:1000)를 희석시하십시오.
참고: 너무 농축된 시료 또는 너무 희석된 시료는 NTA 측정을 위해 범위를 벗어나고 조정이 필요합니다. - 희석된 전기자동차의 1mL을 주사기로 NTA 장비에 적재하고 NTA 장비에 주입한다.
- 입자 농도 및 크기 분포 측정을 위해 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.
- 0.2 μm 여과 된 PBS에서 전기 자동차 (1:1000)를 희석시하십시오.
- 단백질 농도
- 1μL의 EV 용액을 사용하여 농도를 결정합니다. 280 nm의 파장에서 분광계로 흡광도를 측정합니다.
참고: 전기 는 입자의 수에 비해 단백질의 낮은 수준을 제시한다. - 제조 업체의 지시에 따라 분광계를 사용하여 흡광도 판독을 얻을 수 있습니다.
- 1μL의 EV 용액을 사용하여 농도를 결정합니다. 280 nm의 파장에서 분광계로 흡광도를 측정합니다.
3. 티타늄 표면 기능화
참고:이 방법에서는 가공티타늄 디스크, c.p. 등급 IV, 직경 6.2mm 및 높이 2mm가 사용됩니다. 디스크는 Ti 핀셋으로 조작될 수 있지만 표면을 긁지 않는 것이 중요합니다. 또한, 가공된 쪽은 전체 프로세스 중에 위쪽으로 직면해야 합니다.
- 티 디스크 세척
참고 : Ti 세척에 사용되는 솔루션의 양은 Ti 디스크를 커버하기에 충분해야합니다. 티 디스크를 유리 비커에 넣고 솔루션을 붓습니다. 그런 다음 해독하여 용액을 제거합니다.- 티 임플란트를 탈온화(DI) 물로 씻은 다음 물을 버립니다.
- 에탄올70%로 Ti 임플란트를 세척한 다음 용액을 제거합니다.
- 임플란트를 DI 물에 놓고 50°C에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 버리십시오.
- 교반으로 10 분 동안 50 °C에서 40 % NaOH 용액으로 Ti 임플란트를 인큐베이션합니다. 솔루션을 폐기합니다.
주의: NaOH 솔루션은 준비 중에 따뜻해합니다. 용액은 부식성이며 연기 후드 내부에 사용해야합니다. - 50°C에서 50°C에서 임플란트를 초음파 처리한 다음 물을 제거합니다.
- 중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기와 pH를 확인합니다.
- 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리하여 물을 제거합니다.
- 50°C에서 50° C의 50% HNO3 용액에 Ti 임플란트를 10분 동안 교배하여 배양합니다. 솔루션을 제거합니다.
주의: HNO3 는 부식성 및 산화제 물질이며 연기 후드 내부에 사용해야 합니다. - 50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다.
- 중립 pH가 얻어질 때까지 DI 수(최소 5)로 여러 번 의 세하를 수행한다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.
- 50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다.
참고: 이 시점에서 Ti 임플란트를 70% 에탄올 용액에 저장하여 실험을 중지할 수 있습니다.
- 티 패시베이션
참고: Ti 통과 단계는 아래에 나열된 순서대로 Ti 디스크를 다른 솔루션으로 완전히 덮음으로써 수행됩니다. 티 디스크는 유리 비커에 배치하고 솔루션은 부드럽게 그들에 부어된다. 모든 세척 단계에서 사용되는 볼륨은 임플란트를 완전히 커버해야하며 탈충을 통해 제거됩니다.- Ti 임플란트를 30% HNO3 솔루션으로 배양하여 부드러운 동요 하에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 솔루션을 제거합니다.
- 중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.
- 디 워터의 실온에서 하룻밤 동안 티 임플란트를 인큐베이션합니다.
- 진공 조건에서 임플란트를 40°C에서 10분 동안 건조시하십시오.
- EV 드롭 캐스팅
참고: 세포 기능 연구의 경우 세포 배양 캐비닛에서 작업하는 것이 중요합니다.- Ti 임플란트를 96웰 플레이트에 놓고 가공된 면이 위를 향합니다.
참고: 임플란트가 거꾸로 뒤집힌 경우 바늘을 사용하여 다시 설정할 수 있습니다. - 전기자동차 용액을 해동하고 교반과 섞습니다. 소용돌이를 사용하여 3초 동안 펄스를 사용하십시오.
- 티 표면에 전기 를 입금합니다. 이 연구에서는 NTA가 결정한 농도에 따라 임플란트당 최대 4 x 1011 EV를 고정하기 위해 40μL의 EV 용액을 Ti에 배치합니다.
- 낙하가 완전히 건조 할 때까지 진공 조건하에서 Ti가 함유 된 플레이트를 37 °C에서 놓습니다 (~2 h).
참고: 진공 챔버에 존재하는 임플란트 수와 물에 따라 시간을 조정합니다.
- Ti 임플란트를 96웰 플레이트에 놓고 가공된 면이 위를 향합니다.
그림 2: 드롭 캐스팅에 의한 Ti 패시베이션 및 EV 기능화의 회로도. Ti 임플란트는 실온에서 30% HNO3 용액에서 30분 동안 인큐베이션으로 먼저 전달됩니다. DI 물로 여러 번 해시 한 후 pH는 중립에 도달합니다. 그런 다음, Ti 임플란트는 DI 물의 실온에서 하룻밤 동안 배양됩니다. 그 후, 임플란트는 40 °C에서 진공 조건하에서 건조된다. 전기자동차의 경우 40μL의 전기자동차 용액이 Ti 임플란트에 증착됩니다. 다음으로, 임플란트는 전기가 물리적으로 표면에 결합될 때까지 진공 상태에서 2시간 동안 배양됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. Ti 표면 특성화
- 릴리스 스터디
- 37°C에서 여과된 PBS의 200 μL로 Ti 표면을 배양합니다.
참고: PBS는 NTA 측정과의 간섭을 피하기 위해 필터링됩니다. - PBS를 다른 시점에서 교체하고 -80 °C에 저장합니다.
참고: 이 연구에서는 2일, 6일, 10일, 14일 의 시간 점을 분석했습니다. - 제조업체의 지침에 따라 NTA에 의해 입자 연구를 위해 저장된 PBS를 분석합니다.
참고: PBS의 입자 농도는 시간이 지남에 따라 EV 릴리스 프로파일을 나타냅니다.
- 37°C에서 여과된 PBS의 200 μL로 Ti 표면을 배양합니다.
- 생체 적합성 연구
참고: 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUC-MSC)는 기관 가이드라인에 따라 IdISBa 바이오뱅크로부터 수득된다.- 사용 전까지 20%의 FBS로 보충된 DMEM 저혈당에서 hUC-MSC를 유지하십시오. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
- 세포 파종의 경우, PBS의 5mL로 플라스크에서 셀을 두 번 세척하십시오.
- 트립신 솔루션의 1 mL을 추가하여 hUC-MSC를 트립시니즈합니다. 세포의 단층이 완전히 커버되는지 확인합니다. 트립신 용액을 제거하고 세포 배양 플라스크를 37°C에서 약 2분 동안 배치합니다. 현미경의 밑에 세포 분리를 봅니다. 분리된 셀은 둥근 모양으로 나타나며 서스펜션에 있을 것입니다.
- 1% 전기 자동차고갈고갈기 FBS와 DMEM 낮은 포도당에서 세포를 다시 중단합니다.
참고: 1% FBS로 보충된 미디어를 준비한 다음 18h에 120,000 x g 의 초원심분리기를 준비하여 FBS-EV를 제거합니다. 혈소판 EV와의 간섭을 피하기 위해 전기 를 제거하는 것이 중요합니다. - Neubauer 챔버를 가진 세포의 수를 계산하여 세포 농도를 결정14.
- hUC-MSC를 50,000세포/mL 농도로 가져옵니다.
- 세포 용액의 200 μL을 Ti 임플란트에 시드합니다.
- 48h 후, 50 μL의 매체를 수집하고 제조업체의 프로토콜에 따라 젖산 탈수소효소(LDH) 활동 키트를 사용하여 세포독성 측정을 수행한다.
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Representative Results
이 문서에 제시된 방법을 사용하면 기능성 티타늄 디스크를 사용하여 EV를 얻을 수 있습니다. 전기 자동차는 물리적으로 표면에 결합되어 시간이 지남에 따라 지속적인 방출을 허용합니다. 방출되는 전기자동차의 양은 2일, 6, 10 및 14일에 NTA로 측정할 수 있다. 첫 번째 측정, 2 일에, 약 109 EV가 출시 되는 것을 보여, 6 일에 지속적인 출시 다음 (~108 EV); 10일(~107EV ), 14일차(~107EV ). 이는 시간이 지남에 따라 출시된 EV의 양이 감소했음에도 불구하고 지속적인 릴리스를 확인합니다.
그림 3: Ti 기능화 표면의 누적 EV 릴리스. 입자는 37°C에서 2일, 6, 10 및 14일에 PBS로 방출되었다. 데이터는 n = 3을 가진 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
더욱이, MSC에서 수행된 생체 적합성 연구는 Ti 및 Ti-EV에 세포 성장48시간 이후에 티-EV 그룹의 낮은 LDH 활성 수준에 의해 나타난 티 대조군에 비해 Ti-EV에서 생체 적합성향상이 관찰되었다는 것을 알 수 있다. 미디어는 임플란트에 세포 성장의 48 시간 후에 수집되었다. 조직 배양 플라스틱에서 직접 자란 세포는 0% LDH 활성을 가진 음성 대조군으로 사용되었고, 1% 트리톤 X-100으로 치료된 세포는 100% 세포 독성을 가진 양성 대조군으로 사용되었다.
그림 4: 티-EV의 체외 세포 생체 적합성. LDH 활성은 임플란트에 세포 파종 후 배양 배지 48h에서 측정하였다. 조직 배양 플라스틱에 시드된 세포는 독성의 0%로 설정되었고, 세포는 조직 배양 플라스틱에 시드되고 트리톤 X-100 1%로 처리되어 독성의 100%로 설정하였다. ISO-10993:5에 따라 의료기기의 세포독성에 허용되는 최대 값인 30%에 파선선이 표시됩니다. 데이터는 n = 15 (세 개의 독립적 인 실험이 수행된)와 함께 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 TI 표면에 EV 기능화에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 방법은 기능화의 물리작용 형인 낙하 주조 전략을 기반으로 한다. Ti 표면에 대한 EV 기능화에 관한 불쌍한 참고 문헌이 존재하지만 Ti10에서 EV를 고정하여 다른 이점을 보여주는 연구는 거의 없습니다. 어쨌든, 탐구된 전략의 몇몇은 생화학적 결합8, 중합체 함정9 또는 드롭 주조10을 포함합니다. 공유 결합을 통한 화학 코팅의 사용은 더 높은 등급의 기능화로 보다 균일한 코팅을 달성할 수 있지만 화학 반응은 EV 구조 및 기능에 해를 끼칠 수 있습니다15. 낙하 주조는 중합체 함정 또는 생화학 적 결합에 비해 쉽고 저렴한 방법입니다.
해결할 수 있는 프로토콜의 한 가지 중요한 점은 EV 소스입니다. 이 연구에서는, 전기는 PL에서 얻어진다. 그러나 드롭 캐스팅 방법은 물리적 상호 작용을 기반으로 하기 때문에 모든 종류의 EV에 적응할 수 있습니다. 다른 방법을 사용한 이전 연구는 줄기 세포8,10 또는 machropages9와 같은 세포 배양 전기의 사용을 평가한 후 긍정적인 결과를 제시한다. EV의 사용에 관해서는 완전한 특성을 수행하는 것이 중요합니다. 세포 외 소포의 국제 사회는 분야에서 재현성을 보장하기 위해 주요 전기 매개 변수의 대부분을 결정하는 것을 목표로12. 다른 연구는 이미 EV 특성화를위한 방법론을 설명, 따라서이 프로토콜에서 우리는 수행 된 전자 현미경 검사법과 서양 blot 기술 프로토콜을 자세히 설명하지 않았다13.
낙하 주조에 의한 Ti 기능화를 위한 중요한 단계는 전기자동차의 물리작용에 허용되는 시간과 조건입니다. 우리가 제시하는 프로토콜에서, 낙하가 완전히 가뭄이 될 때까지 진공 조건하에서 인큐베이션이 수행됩니다. 일반적으로 37°C및 진공 조건에서 물 증발을 보장하기 위해 2h가 필요합니다. 그러나 기능화되는 임플란트의 수는 Ti에 대한 EV의 올바른 접착을 보장하는 데 필요한 시간을 증가시킬 수 있습니다. 특성화 나 기능 적 연구를 진행하기 전에 물이 남지 않도록하는 것이 중요합니다. 그러나, Ti에 대한 EV 기능화를 위한 프로토콜의 변형은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 진공 조건 없이 4°C에서 하룻밤 잠복이 이미 탐구되었다10. 그러나, 우리의 손에, 이 방법의 사용은 우리가 설명하는 완전한 건조에 비해 가난한 결과로 이끌어 냈습니다.
본 프로토콜에서 수행되지 는 않지만, EV 기능화는 다른 방법론을 통해 평가될 수 있으며, 그 중에서도 표면의 수질적 접촉 각을 측정하는 것이 특징일 수 있다. 그리고 포리에 변환 적외선 (FTIR) 분광법에 의해 코팅의 화학적 특성의 변화는 광학 현미경 검사법에 결합. 더욱이, 전기는 특정 염료(예: PKH26 염료)로 염색될 수 있고, 기능화된 표면은 형광 현미경검사법에 의해 심화될 수 있다.
전반적으로, Ti에 대한 EV 증착의 골성 기능을 탐구하기 위해 추가 기능 테스트를 수행할 수 있습니다. 한편, 공초점 현미경 또는 효소 활동을 통해 수행된 세포 접착 또는 성장 아약은 기능성을 테스트하는 첫 번째 접근법이 될 수 있다10. 이 논문에서, 우리는 세포 독성 분석이 세포에 대한 임플란트의 효과의 첫 번째 접근 의 하나로 설명했습니다. 한편, PCR 어약은 Ti 디스크8,9,10에서 수행되는 세포 배양에서 골성 마커의 유전자 발현을 결정하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 서양 얼룩을 통한 단백질 검출은 반정성 기술임에도 불구하고 골성 프로파일을 제안할 수 있다. 검출 어레이 또는 효소 키트와 같은 다른 단백질 검출 기술은 기능 실험의 성능9에 좋은 접근법이 될 수 있습니다. 추가 기능적인 분석법은 칼신 블루 스테닝16을 통해 칼슘 증착의 결정입니다. 시험관 내 기능이 입증되면 동물 몰델스8을 사용하여 추가 실험을 수행할 수 있습니다.
결론적으로 표면 기능화는 생체 재료의 개선된 치료 설계를 가능하게 합니다. 이식형 생체 재료와 EV의 조합은 생체 재료의 생체 적합성 및 골성 특성의 개선과 관련된 지속적인 방출을 허용할 수 있습니다. EV 바인딩에 대한 다양한 접근 방식을 탐색하는 것이 중요합니다. 따라서 드롭 캐스팅은 임상적으로 사용할 수 있는 정형 외과 장치를 생산하는 것을 목표로 하는 향후 연구를 위한 흥미로운 출발점입니다. 이 원고에 제시된 프로토콜은 향후 실험의 성능을 위한 쉽고 재현 가능한 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), 디레치오 제너럴 디Investigació, 콘셀러티아 d'Investigació, 지배 발레어 (FPI/2046/2017), 그리고 PROGRAMA 주니어 델 프로젝트 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (주니어01/18), 지속 가능한 관광 에 의해 금융.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
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