Summary
Här presenterar vi en metod för isolering av extracellulära vesicles (EVs) som härrör från trombocyt lysates (PL) och deras användning för beläggning titan (Ti) implantat ytor. Vi beskriver droppgjutningsmetoden, EVs-utlösningsprofilen från ytorna och in vitro-biokompatibiliteten hos EVs belagda Ti-ytor.
Abstract
Extracellulära vesicles (EVs) är biologiska nanovesicles som spelar en nyckelroll i cellkommunikation. Deras innehåll inkluderar aktiva biomolekyler som proteiner och nukleinsyror, som utgör stor potential inom regenerativ medicin. På senare tid har EVs som härrör från Trombocyt lysate (PL) visat en osteogen förmåga jämförbar med PL. Dessutom används biomaterial ofta i ortopedi eller tandåterställning. Här tillhandahåller vi en metod för att funktionalisera Ti-ytor med PL-härledda EVs för att förbättra deras osteogena egenskaper.
EVs isoleras från PL efter storlek exkludering kromatografi, och efteråt Ti ytor är funktionella med PL-EVs genom droppgjutning. Funktionalisering bevisas av EVs release och dess biokompatibilitet genom laktat dehydrogenas (LDH) release assay.
Introduction
EVs är membranblåsor (30-200 nm) som utsöndras av alla celler och spelar en nyckelroll i cell-till-cell-kommunikation genom att leverera sin last. De innehåller en mängd aktiva biomolekyler som kan inkludera nukleinsyror, tillväxtfaktorer eller bioaktiva lipider1. Av dessa skäl har EVs utvärderats för deras potentiella användning i terapier. När det gäller ortopedi och benregenerering har EVs från olika källor testats. Bland dem har trombocyt-härledda EVs visat sig inducera en differentieringseffekt på stamceller samtidigt som en låg cytotoxisk profil2,3 bibehålls. Därför krävs ytterligare forskning för att undersöka möjligheten att kombinera EVs med biomaterial för att använda dem i daglig klinisk praxis.
Titanbaserade biomaterial används ofta som byggnadsställningar för benläkande kliniska ingrepp på grund av deras mekaniska egenskaper, hög biokompatibilitet och långsiktig hållbarhet4. Ändå är Ti-implantat ett bioinertmaterial och utgör därför en dålig förmåga att binda sig med den omgivande benvävnaden5. Av denna anledning studeras titanmodifieringar för att förbättra deras prestanda genom att uppnå en mer funktionell mikromiljö på dess yta4,6,7. I den meningen kan EVs förankras i titan genom kemiska8 eller fysiska interaktioner9,10. Immobiliserade EVs som härrör från stamceller eller makrofager förbättrar tis bioaktivitet genom att främja cellulär vidhäftning och spridning och därigenom inducera en osteogen effekt8,9,10.
Denna artikel kommer att fokusera på en droppgjutningsstrategi för beläggning av Ti-ytor med PL-härledda EVs i detalj. Dessutom kommer vi att utvärdera EVs-releaseprofil från den belagda ytan över tid och bekräfta dess cellulära biokompatibilitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Trombocyt lysate (PL) erhålls som tidigare beskrivits i enlighet med institutionella riktlinjer3 med färska buffy coats som tillhandahålls av IdISBa Biobank som utgångsmaterial. Deras användning för det nuvarande projektet godkändes av dess etikkommitté (IB 1995/12 BIO).
1. EVs isolering från PL
- Avlägsnande av större kroppar
- Tina PL vid rumstemperatur.
- Centrifug PL vid 1 500 x g i 15 min vid 4 °C. Kassera pelleten eftersom den innehåller cellrester.
- Samla upp supernatanten och utför två centrifugeringar i följd vid 10 000 x g i 30 min vid 4 °C.
OBS: Pelleten motsvarar större EL-fordon som mikrovesicles, och i detta fall kasseras den. - Filtrera supernatanten först genom 0,8 μm poröst membran och sedan genom 0,2 μm poröst membran.
OBS: De här stegen tar bort alla icke-önskade EVs. - Poola den filtrerade PL och förvara vid -20 °C tills den används.
- Storleksuteslutningskromatografi
- Balansera kolonnen kopplad till kromatografiutrustning med önskad flödeshastighet med filtrerad PBS.
OBS: Flödeshastigheten som används beror på kolumnegenskaperna. I det här fallet är den inställd på 0,5 ml/min. - Ladda den bearbetade PL (5 ml) med en spruta till utrustningen.
- Injicera PL i kolonnen och börja samla 5 ml fraktioner i 15 ml-rör.
- Samla upp elbilar berikade fraktioner och förvara dem vid -80 °C tills de används.
OBS: När du utför experimentet för första gången, karakterisera alla fraktioner av proteinkvantifiering och immunodetection för att bestämma den berikad med EVs3,11. I det här experimentet samlas den 9: e fraktionen in. - Tvätta den kromatografiska kolonnen med 30 ml 0,2% NaOH-lösning och förvara den i 20% etanollösning när den når jämvikt.
- Balansera kolonnen kopplad till kromatografiutrustning med önskad flödeshastighet med filtrerad PBS.
Bild 1: Schematiskt diagram över trombocyt lysate (PL) extracellulär vesicle (EVs) isolering. PL centrifugeras först vid 1 500 x g och sedan vid 10 000 x g för att avlägsna större kroppar. Supernatanten filtreras genom filter på 0,8 och 0,2 μm. Bearbetad PL laddas på kolumnen och EVs separeras av storleksuteslutningskromatografi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
2. EVs-karakterisering
OBS: EVs-karakterisering är nödvändig för att utföra funktionella studier12. Elektronmikroskopi eller western blot karakterisering har tidigare rapporterats13. Denna rapport kommer att fokusera på de väsentliga karakteriseringstekniker för Ti yta funktionalisering.
- Nanopartikelspårningsanalys (NTA)
- Späd ut EL-fordonen (1:1000) i 0,2 μm filtrerade PBS.
OBS: För koncentrerade prover eller för utspädda prover kommer att vara utom räckhåll för NTA-bestämning, och justering kommer att krävas. - Ladda 1 ml av de utspädda elfordonen med en spruta till NTA-utrustningen och injicera dem i NTA-utrustningen.
- Följ tillverkarens protokoll för partikelkoncentration och storleksfördelning.
- Späd ut EL-fordonen (1:1000) i 0,2 μm filtrerade PBS.
- Proteinkoncentration
- Bestäm koncentrationen med hjälp av 1 μL av EL-lösningen. Mät absorbansen med en spektrofotometer vid en våglängd på 280 nm.
OBS: EVs bör uppvisa låga nivåer av proteiner jämfört med antalet partiklar. - Följ tillverkarens anvisningar för att få absorbansavläsningen med hjälp av spektrofotometern.
- Bestäm koncentrationen med hjälp av 1 μL av EL-lösningen. Mät absorbansen med en spektrofotometer vid en våglängd på 280 nm.
3. Titan yta funktionalisering
OBS: I denna metod används bearbetade titanskivor, c.p. grade IV, 6,2 mm diameter och 2 mm höjd. Skivorna kan manipuleras med Ti pincett, men det är viktigt att inte repa ytan. Dessutom måste den bearbetade sidan vända uppåt under hela processen.
- Ti skivor tvätta
OBS: Mängden lösningar som används för Ti-tvätt bör vara tillräcklig för att täcka Ti-skivor. Placera Ti-skivor i en glasbägare och häll lösningar på dem. Ta sedan bort lösningen genom dekantering.- Tvätta Ti-implantat med avjoniserat (DI) vatten och kassera sedan vattnet.
- Tvätta Ti-implantat med etanol 70%, och dekantera sedan för att ta bort lösningen.
- Placera implantaten i DI-vatten och sonkat vid 50 °C i 5 min. Kasta vattnet.
- Inkubera Ti-implantat i en 40% NaOH-lösning vid 50 °C i 10 min med omrörning. Kassera lösningen.
VARNING: NaOH-lösningen värms upp under beredningen. Lösningen är frätande och ska användas inuti en rökhuv. - Sonikera implantaten i DI-vatten vid 50 °C i 5 minuter och ta sedan bort vattnet.
- Utför flera tvättar med DI-vatten (minst 5) tills det når neutralt pH. Kontrollera pH med pH-indikatorer.
- Sonikera implantaten i DI-vatten vid 50 °C i 5 minuter och ta bort vattnet.
- Inkubera Ti-implantat i en 50% HNO3-lösning vid 50 °C i 10 minuter med omrörning. Ta bort lösningen.
VARNING: HNO3 är ett frätande ämne och oxidationsmedel, och det bör användas inuti en rökhuv. - Sonikera implantaten i DI-vatten vid 50 °C i 5 min. Ta bort vattnet.
- Utför flera tvättar med DI-vatten (minst 5) tills neutralt pH erhålls. Kontrollera pH-värdet med pH-indikatorer.
- Sonikera implantaten i DI-vatten vid 50 °C i 5 min. Ta bort vattnet.
OBS: Vid denna tidpunkt kan experimentet stoppas genom att lagra Ti-implantat i en 70% etanollösning.
- Ti passivation
OBS: Ti passivation steg utförs genom att helt täcka Ti-skivor med de olika lösningarna i den ordning som anges nedan. Ti-skivor placeras i en glasbägare och lösningar hälls försiktigt på dem. Volymer som används i alla tvättsteg måste helt täcka implantaten och avlägsnas via dekantering.- Inkubera Ti-implantaten i en 30% HNO3-lösning i 30 minuter vid rumstemperatur under mild omrörning. Ta bort lösningen.
- Utför flera tvättar med DI-vatten (minst 5) tills det når neutralt pH. Kontrollera pH-värdet med pH-indikatorer.
- Inkubera Ti-implantat över natten vid rumstemperatur i DI-vatten.
- Torka av implantaten under vakuumförhållanden vid 40 °C i 10 min.
- EVs släpper gjutning
OBS: För cellfunktionella studier är det viktigt att arbeta i ett cellodlingsskåp.- Placera Ti-implantaten i en 96-välplatta, med den bearbetade sidan vänd uppåt.
OBS: Om implantaten vänds upp och ner kan en nål användas för att ställa tillbaka dem. - Tina UPP EL-lösningen och blanda dem med omrörning. Använd en virvel för att pulsera i 3 s.
- Sätt in elfordonen på Ti-ytan. I denna studie placeras droppar på 40 μL EVs-lösning på Ti för att immobilisera högst 4 x 1011 EVs per implantat enligt den koncentration som bestäms av NTA.
- Placera plattorna som innehåller Ti under vakuumförhållanden vid 37 °C tills dropparna är helt torra (~2 h).
OBS: Justera tiden beroende på antalet implantat och vattnet som finns i vakuumkammaren.
- Placera Ti-implantaten i en 96-välplatta, med den bearbetade sidan vänd uppåt.
Bild 2: Schematiskt diagram över Ti passivation och EVs funktionalisering genom droppgjutning. Tiimplantat passiveras först genom inkubation i 30 min i en 30% HNO3-lösning vid rumstemperatur. Efter flera tvättar med DI-vatten når pH neutralt. Sedan inkuberas Ti-implantat över natten vid rumstemperatur i DI-vatten. Därefter torkas implantaten av under vakuumförhållanden vid 40 °C. För EVs immobilisering deponeras 40 μL EVs-lösningen på Ti-implantat. Därefter inkuberas implantat vid vakuum i 2 timmar tills EVs är fysiskt bundna till ytan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
4. Ti ytkarakterisering
- Releasestudie
- Inkubera Ti yta med 200 μL filtrerad PBS vid 37 °C.
OBS: PBS filtreras för att undvika störningar i NTA-mätningen. - Byt ut PBS vid olika tidpunkter och förvara vid -80 °C.
OBS: I denna studie analyserades 2-, 6-, 10- och 14-dagars tidspunkter. - Analysera lagrad PBS för partikelstudier av NTA enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Partikelkoncentration i PBS vid olika tidpunkter är en representation av EVs-utlösningsprofil över tid.
- Inkubera Ti yta med 200 μL filtrerad PBS vid 37 °C.
- Biokompatibilitetsstudier
OBS: Human navelsträngsbaserade mesenkymala stamceller (hUC-MSC) erhålls från IdISBa Biobank i enlighet med institutionella riktlinjer.- Behåll hUC-MSC i DMEM låg glukos kompletterad med 20% FBS fram till användning. Byt medium två gånger i veckan.
- För cellsådd, tvätta cellerna i flaskor med 5 ml PBS två gånger.
- Prova hUC-MSC genom att lägga till 1 ml trypsinlösning. Se till att den helt täcker cellernas monoskikt. Ta bort trypsinlösningen och placera cellodlingskolven vid 37 °C i 2 min ungefär. Visa cellavlossning under mikroskopet. Fristående celler kommer att visas runda i form och kommer att vara i suspension.
- Resuspend celler i DMEM låg glukos med 1% EVs utarmade FBS.
OBS: Förbered media kompletterat med 1% FBS, och sedan ultracentrifuge vid 120 000 x g i 18 h för att ta bort FBS-EVs. Det är viktigt att ta bort elfordon för att undvika störningar med trombocyt-EL. - Bestäm cellkoncentrationen genom att räkna antalet celler med en Neubauer-kammare14.
- Föra hUC-MSC till en koncentration av 50 000 celler/ml.
- Frö 200 μL av celllösningen på Ti-implantaten.
- Efter 48 timmar samlar du in 50 μL media och utför den cytotoxiska bestämningen med hjälp av laktatdehydrogenas (LDH) aktivitetssats, enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som presenteras i denna artikel gör det möjligt att erhålla EVs funktionaliserade titanskivor. EVs är fysiskt bundna till ytan, vilket möjliggör en varaktig frisättning över tiden. Mängden elfordon som släpps ut kan mätas med NTA dag 2, 6, 10 och 14. De första mätningarna, på dag 2, visar att cirka 109 EVs släpps, följt av en ihållande utgåva på dag 6 (~ 108 EVs); dag 10 (~107 EL) och dag 14 (~107 EL). Detta bekräftar en varaktig utgåva, trots att den visar en minskning av mängden EL som släpps över tid.
Figur 3: Ackumulerande EV-frisättning av Ti-funktionaliserade ytor. Partiklar släpptes ut i PBS dag 2, 6, 10 och 14 vid 37 °C. Data representerar medelvärdet ± SEM med n = 3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Dessutom visar biokompatibilitetsstudier som utförts på MSC att efter 48 h celltillväxt på Ti- och Ti-EVs observerades en förbättring av biokompatibiliteten i Ti-EVs jämfört med Ti-kontrollgruppen, vilket framgår av ti-ev-gruppens lägre LDH-aktivitetsnivåer jämfört med Ti-gruppen. Media samlades in efter 48 h celltillväxt på implantat. Celler som odlades direkt på vävnadsodlingsplast användes som en negativ kontroll med 0% LDH-aktivitet, medan celler som behandlades med 1% Triton X-100 användes som en positiv kontroll med 100% cytotoxicitet.
Figur 4: In vitro-cellsbiokompatibilitet hos Ti-EVs. LDH aktivitet mättes i kultur media 48 h efter cell sådd på implantaten. Celler som såddes på vävnadsodling plast sattes som 0% av toxiciteten medan celler sådda på vävnadsodling plast och behandlas med triton X-100 1% sattes som 100% av toxiciteten. En streckad linje visas på 30%, vilket är det maximala värdet som accepteras för cytotoxicitet hos medicintekniska produkter enligt ISO-10993:5. Data representerar medelvärdet ± SEM, med n = 15 (tre oberoende experiment utfördes). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll syftar till att ge tydliga instruktioner för EVs-funktionalisering på Ti-ytor. Metoden som presenteras är baserad på en drop casting strategi, som är en fysisorption typ av funktionalisering. Dålig bibliografi finns när det gäller EVs funktionalisering på Ti-ytor, även om det finns få studier som visar olika fördelar genom att immobilisera EVs på Ti10. Hur som helst, några av de strategier som utforskas inkluderar biokemisk bindning8, polymera entrapment9 eller droppgjutning10. Även om användningen av kemiska beläggningar genom kovalenta bindningar kan uppnå en mer homogen beläggning med en högre grad av funktionalisering, kan kemiska reaktioner skada EVs struktur och funktionalitet15. Droppgjutning är en enkel och billig metod jämfört med polymerinfångning eller biokemisk bindning.
En viktig punkt i protokollet som kan åtgärdas är EV-källan. I denna studie erhålls EVs från PL. Droppgjutningsmetoden är dock anpassningsbar till alla typer av EVs, eftersom den är baserad på fysiska interaktioner. Tidigare studier med andra metoder ger positiva resultat efter att ha utvärderat användningen av cellodlings-EVs såsom stamceller8,10 eller machropages9. Det är viktigt, när det gäller användningen av EVs, att utföra en fullständig karakterisering av dem. International Society of Extracellular Vesicles strävar efter att bestämma de flesta av de viktigaste EVs-parametrarna för att säkerställa reproducerbarhet i fältet12. Andra studier har redan beskrivit metoden för EVs-karakterisering, så i detta protokoll har vi inte specificerat de elektroniska mikroskopi- och western blot-teknikprotokollen som utförs13.
Ett kritiskt steg för Ti-funktionalisering genom droppgjutning är den tid och de förutsättningar som är tillåtna för EVs fysisorption. I det protokoll vi presenterar utförs inkubation under vakuumförhållanden tills dropparna är helt torka. Vanligtvis behövs 2 h för att säkerställa vattenavdunstning vid 37 °C och under vakuumförhållanden. Antalet implantat som funktionaliseras kan dock öka den tid som behövs för att säkerställa korrekt vidhäftning av EVs på Ti. Det är viktigt att se till att inget vatten finns kvar innan du fortsätter till karakterisering eller funktionella studier. Variationer i protokollet för EVs funktionalisering på Ti finns dock i litteraturen. Till exempel har en inkubation över natten vid 4 °C utan vakuumförhållanden redan undersökts10. Men i våra händer ledde användningen av denna metod till dåliga resultat jämfört med den fullständiga torr som vi beskriver.
Även om det inte utförs i det nuvarande protokollet, kan EVs-funktionalisering utvärderas genom olika metoder, bland annat kan förändringar på ytans våthet karakteriseras genom att mäta vattenkontaktvinkeln på ytan; och förändringar i beläggningarnas kemiska karaktär av Fourier-transformerad infraröd (FTIR) spektroskopi kopplad till optisk mikroskopi. Dessutom kan EVs färgas med specifika färgämnen (såsom PKH26 färgämne), och de funktionella ytorna kan avbildas av fluorescensmikroskopi.
Sammantaget kan ytterligare funktionella tester utföras för att utforska den osteogena funktionaliteten hos EVs deposition på Ti. Å ena sidan kan cell vidhäftning eller tillväxtanalyser som utförs genom konfokal mikroskopi eller enzymatisk aktivitet vara det första tillvägagångssättet för att testa funktionalitet10. I detta dokument har vi beskrivit cytotoxicitetsanalysen som en av de första metoderna för implantatens effekter på celler. Å andra sidan kan PCR-analyser användas för att bestämma genuttrycket av osteogena markörer i cellkulturen som utförs på Ti-skivor8,9,10. Dessutom kan proteindetektering genom västra fläcken också föreslå en osteogen profil, trots att det är en semi kvantitativ teknik. Andra proteindetekteringstekniker som detektionsmatriser eller enzymatiska kit kan också vara bra metoder för funktionsexperimentens prestanda9. En ytterligare funktionell analys är bestämning av kalciumdeposition genom Calcein Blue Staining16. När in vitro-funktionaliteten har bevisats kan ytterligare experiment utföras med hjälp av djur moldels8.
Sammanfattningsvis möjliggör ytfunktionalisering en förbättrad terapeutisk design av biomaterial. Kombinationen av EVs med implanterbara biomaterial kan möjliggöra hållbar frisättning i samband med en förbättring av biokompatibilitet och osteogenic egenskaper hos biomaterialet. Det är viktigt att undersöka olika metoder för ev-bindning. Droppgjutning är därför en intressant utgångspunkt för framtida studier som syftar till att producera kliniskt tillgängliga ortopediska produkter. Protokollet som presenteras i detta manuskript syftar till att ge en enkel och reproducerbar guide för framtida experiment prestanda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansierad av ESF:s socialfond och Erufs Europeiska regionala utvecklingsfond (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) och PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansierad av balearernas hållbara turistskatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
