Summary
Aquí, presentamos un método para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) derivadas de los lisados plaquetarios (PL) y su uso para recubrir superficies de implantes de titanio (Ti). Describimos el método de recubrimiento de fundición por gota, el perfil de liberación de EV de las superficies y la biocompatibilidad in vitro de las superficies Ti recubiertas de EV.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son nanovesículas biológicas que desempeñan un papel clave en la comunicación celular. Su contenido incluye biomoléculas activas como proteínas y ácidos nucleicos, que presentan un gran potencial en medicina regenerativa. Más recientemente, los EV derivados del lisado plaquetario (PL) han demostrado una capacidad osteogénica comparable a pl. Además, los biomateriales se utilizan con frecuencia en ortopedia o restauración dental. Aquí, proporcionamos un método para funcionalizar las superficies de Ti con EV derivados de PL para mejorar sus propiedades osteogénicas.
Los EV se aíslan de PL mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y luego las superficies de Ti se funcionalizan con PL-EV mediante fundición por gota. La funcionalización se demuestra mediante la liberación de EV y su biocompatibilidad mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
Introduction
Los EV son vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por cualquier célula y desempeñan un papel clave en la comunicación de célula a célula al entregar su carga. Contienen una variedad de biomoléculas activas que pueden incluir ácidos nucleicos, factores de crecimiento o lípidos bioactivos1. Por estas razones, los EV han sido evaluados por su uso potencial en terapias. En términos de ortopedia y regeneración ósea, se han probado evs de diferentes fuentes. Entre ellos, se ha demostrado que los EV derivados de plaquetas inducen un efecto de diferenciación sobre las células madre manteniendo un perfil citotóxico bajo2,3. Por lo tanto, se requiere más investigación para explorar la posibilidad de combinar evs con biomateriales para usarlos en la práctica clínica diaria.
Los biomateriales a base de titanio son ampliamente utilizados como andamios para intervenciones clínicas de curación ósea debido a sus propiedades mecánicas, alta biocompatibilidad y durabilidad a largo plazo4. Sin embargo, los implantes ti son un material bioinerte y, por lo tanto, presentan una escasa capacidad de unión con el tejido óseo circundante5. Por este motivo, se están estudiando modificaciones de titanio con el fin de mejorar su rendimiento consiguiendo un microambiente más funcional en su superficie4,6,7. En este sentido, los vehículos eléctricos pueden anclarse al titanio mediante interacciones químicas8 o físicas9,10. Los EV inmovilizados derivados de células madre o macrófagos potencian la bioactividad del Ti al favorecer la adhesión y proliferación celular induciendo así un efecto osteogénico8,9,10.
Este artículo se centrará en una estrategia de fundición por gota para recubrir superficies Ti con vehículos eléctricos derivados de PL en detalle. Además, evaluaremos el perfil de liberación de evs de la superficie recubierta a lo largo del tiempo y confirmaremos su biocompatibilidad celular in vitro.
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Protocol
El Lisado plaquetario (PL) se obtiene como se describió anteriormente de acuerdo con las directrices institucionales3 utilizando como material de partida capas de buffy frescas proporcionadas por el Biobanco IdISBa. Su uso para el proyecto actual fue aprobado por su Comité de Ética (IB 1995/12 BIO).
1. Aislamiento de evs de PL
- Extracción de cuerpos más grandes
- Descongele PL a temperatura ambiente.
- Centrífuga PL a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el pellet ya que contiene restos celulares.
- Recoge el sobrenadante y realiza dos centrifugaciones consecutivas a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C.
NOTA: El pellet corresponde a vehículos eléctricos más grandes, como microvesículas, y en este caso, se descarta. - Filtre el sobrenadante primero a través de una membrana porosa de 0,8 μm y luego a través de una membrana porosa de 0,2 μm.
NOTA: Estos pasos eliminan todos los vehículos eléctricos no deseados. - Acumule el PL filtrado y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
- Cromatografía de exclusión de tamaño
- Equilibre la columna acoplada al equipo de cromatografía al caudal deseado con PBS filtrado.
NOTA: El caudal utilizado depende de las características de la columna; en este caso, se establece en 0,5 ml/min. - Cargue el PL procesado (5 ml) con una jeringa al equipo.
- Inyecte el PL en la columna y comience a recolectar fracciones de 5 ml en tubos de 15 ml.
- Recoge las fracciones enriquecidas con EV y guárdalas a -80 °C hasta su uso.
NOTA: Al realizar el experimento por primera vez, caracterizar todas las fracciones mediante cuantificación de proteínas e inmunodetección para determinar la enriquecida con EV3,11. En este experimento, se recoge la 9ª fracción. - Lave la columna cromatográfica con 30 ml de solución de NaOH al 0,2% y guárdela en una solución de etanol al 20% una vez que alcance el equilibrio.
- Equilibre la columna acoplada al equipo de cromatografía al caudal deseado con PBS filtrado.
Figura 1: Diagrama esquemático del aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de lisado plaquetario (PL). Pl se centrifuga primero a 1.500 x g, y luego a 10.000 x g para eliminar cuerpos más grandes. El sobrenadante se filtra a través de filtros de 0,8 y 0,2 μm. El PL procesado se carga en la columna, y los EV se separan por cromatografía de exclusión de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Caracterización de los vehículos eléctricos
NOTA: La caracterización de los EV es necesaria para realizar estudios funcionales12. Previamente se ha reportado microscopía electrónica o caracterización de western blot13. Este informe se centrará en las técnicas de caracterización esenciales para la funcionalización de la superficie de Ti.
- Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
- Diluya los EV (1:1000) en PBS filtrados de 0,2 μm.
NOTA: Las muestras demasiado concentradas o demasiado diluidas estarán fuera del rango para la determinación de NTA, y se requerirá un ajuste. - Cargue 1 ml de los EV diluidos con una jeringa en el equipo NTA e inyértelos en el equipo NTA.
- Siga el protocolo del fabricante para la determinación de la concentración de partículas y la distribución del tamaño.
- Diluya los EV (1:1000) en PBS filtrados de 0,2 μm.
- Concentración de proteínas
- Determine la concentración utilizando 1 μL de la solución de EV. Mida la absorbancia con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm.
NOTA: Los EV deben presentar niveles bajos de proteínas en comparación con el número de partículas. - Siga las instrucciones del fabricante para obtener la lectura de absorbancia utilizando el espectrofotómetro.
- Determine la concentración utilizando 1 μL de la solución de EV. Mida la absorbancia con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm.
3. Funcionalización de la superficie de titanio
NOTA: En este método, se utilizan discos de titanio mecanizados, c.p. grado IV, 6,2 mm de diámetro y 2 mm de altura. Los discos pueden ser manipulados con pinzas Ti, pero es importante no rayar la superficie. Además, el lado mecanizado debe mirar hacia arriba durante todo el proceso.
- Lavado de discos Ti
NOTA: El volumen de soluciones utilizadas para el lavado de Ti debe ser suficiente para cubrir los discos de Ti. Coloque los discos Ti en un vaso de precipitados de vidrio y vierta soluciones sobre ellos. Luego, retire la solución decantando.- Lave los implantes Ti con agua desionizada (DI) y luego deseche el agua.
- Lave los implantes Ti con etanol al 70% y luego decante para eliminar la solución.
- Coloque los implantes en agua DI y sonice a 50 °C durante 5 min. Deseche el agua.
- Incubar los implantes de Ti en una solución de NaOH al 40% a 50 °C durante 10 min con agitación. Deseche la solución.
PRECAUCIÓN: La solución de NaOH se calienta durante la preparación. La solución es corrosiva y debe usarse dentro de una campana extractora de humos. - Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min, y luego retirar el agua.
- Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
- Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min y retirar el agua.
- Incubar los implantes ti en una solución de HNO3 al 50% a 50 °C durante 10 min con agitación. Retire la solución.
PRECAUCIÓN: HNO3 es una sustancia corrosiva y oxidante, y debe usarse dentro de una campana extractora de humos. - Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
- Realizar varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta obtener pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
- Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
NOTA: En este punto, el experimento se puede detener almacenando implantes ti en una solución de etanol al 70%.
- Pasivación ti
NOTA: Los pasos de pasivación de Ti se realizan cubriendo completamente los discos Ti con las diferentes soluciones en el orden que se enumera a continuación. Los discos ti se colocan en un vaso de precipitados de vidrio y las soluciones se vierten suavemente sobre ellos. Los volúmenes utilizados en todas las etapas de lavado deben cubrir completamente los implantes y se eliminan mediante decantación.- Incubar los implantes Ti en una solución de HNO3 al 30 % durante 30 min a temperatura ambiente bajo una agitación suave. Retire la solución.
- Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
- Incubar los implantes ti durante la noche a temperatura ambiente en agua DI.
- Secar los implantes en condiciones de vacío a 40 °C durante 10 min.
- Lanzamiento de vehículos eléctricos
NOTA: Para los estudios funcionales celulares, es importante trabajar en un gabinete de cultivo celular.- Coloque los implantes Ti en una placa de 96 pocillos, con el lado mecanizado hacia arriba.
NOTA: Si los implantes están volteados boca abajo, se puede usar una aguja para colocarlos hacia atrás. - Descongele la solución de EV y mézclelos con agitación. Use un vórtice para pulsar durante 3 s.
- Deposite los vehículos eléctricos en la superficie ti. En este estudio, se colocan gotas de 40 μL de solución de EV sobre el Ti para inmovilizar un máximo de 4 x 1011 EV por implante de acuerdo con la concentración determinada por NTA.
- Coloque las placas que contienen el Ti en condiciones de vacío a 37 °C hasta que las gotas estén completamente secas (~2 h).
NOTA: Ajuste el tiempo dependiendo del número de implantes y el agua presente en la cámara de vacío.
- Coloque los implantes Ti en una placa de 96 pocillos, con el lado mecanizado hacia arriba.
Figura 2: Diagrama esquemático de pasivación ti y funcionalización de EV por drop casting. Los implantes de Ti se pasivan primero por incubación durante 30 min en una solución de HNO3 al 30 % a temperatura ambiente. Después de varios lavados con agua DI, el pH alcanza neutro. Luego, los implantes de Ti se incuban durante la noche a temperatura ambiente en agua DI. Después de eso, los implantes se secan en condiciones de vacío a 40 ° C. Para la inmovilización de EV, 40 μL de solución de EV se depositan en los implantes ti. A continuación, los implantes se incuban al vacío durante 2 h hasta que los EV se unen físicamente a la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Caracterización de la superficie ti
- Estudio de lanzamiento
- Incubar la superficie de Ti con 200 μL de PBS filtrado a 37 °C.
NOTA: PBS se filtra para evitar interferencias con la medición NTA. - Reemplace el PBS en diferentes puntos de tiempo y guárdelo a -80 °C.
NOTA: En este estudio, se analizaron los puntos de tiempo de 2, 6, 10 y 14 días. - Analice el PBS almacenado para estudios de partículas por NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: La concentración de partículas en PBS en diferentes momentos es una representación del perfil de liberación de EV a lo largo del tiempo.
- Incubar la superficie de Ti con 200 μL de PBS filtrado a 37 °C.
- Estudios de biocompatibilidad
NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC) se obtienen del Biobanco IdISBa de conformidad con las directrices institucionales.- Mantener hUC-MSC en DMEM bajo en glucosa suplementado con 20% FBS hasta su uso. Cambie el medio dos veces por semana.
- Para la siembra celular, lave las células en matraces con 5 ml de PBS dos veces.
- Tripsinize hUC-MSC añadiendo 1 ml de solución de tripsina. Asegúrese de que cubre completamente la monocapa de células. Retire la solución de tripsina y coloque el matraz de cultivo celular a 37 °C durante 2 min aproximadamente. Vea el desprendimiento celular bajo el microscopio. Las celdas separadas aparecerán de forma redonda y estarán en suspensión.
- Células resuspend en DMEM glucosa baja con EV 1% agotado FBS.
NOTA: Prepare medios suplementados con 1% de FBS, y luego ultracentrífuga a 120,000 x g durante 18 h para eliminar FBS-EV. Es importante eliminar los EV para evitar interferencias con los EV plaquetarios. - Determinar la concentración celular contando el número de células con una cámara de Neubauer14.
- Llevar hUC-MSC a una concentración de 50.000 células/ml.
- Sembra 200 μL de la solución celular sobre los implantes Ti.
- Después de 48 h, recolectar 50 μL de medios y realizar la determinación citotóxica utilizando el kit de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
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Representative Results
El método presentado en este artículo permite obtener discos de titanio funcionalizados evs. Los vehículos eléctricos están físicamente unidos a la superficie, lo que permite una liberación sostenida en el tiempo. La cantidad de vehículos eléctricos liberados puede ser medida por NTA en los días 2, 6, 10 y 14. Las primeras mediciones, en el día 2, muestran que se liberan alrededor de 109 EV, seguidos de una liberación sostenida en el día 6 (~ 108 EV); día 10 (~107 EV) y día 14 (~107 EV). Esto confirma una liberación sostenida, a pesar de mostrar una disminución en la cantidad de vehículos eléctricos liberados con el tiempo.
Figura 3: Liberación acumulativa de EV de superficies funcionalizadas de Ti. Las partículas se liberaron en PBS en los días 2, 6, 10 y 14 a 37 °C. Los datos representan la media ± SEM con n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, los estudios de biocompatibilidad realizados en MSC revelan que después de 48 h de crecimiento celular en Ti y Ti-EV, se observó una mejora en la biocompatibilidad en Ti-EV en comparación con el grupo de control ti, demostrado por los niveles de actividad de LDH más bajos del grupo Ti-EV en comparación con el grupo Ti. Los medios se recogieron después de 48 h de crecimiento celular en implantes. Las células cultivadas directamente en plástico de cultivo tisular se utilizaron como control negativo con 0% de actividad LDH, mientras que las células tratadas con 1% Triton X-100 se utilizaron como control positivo con 100% de citotoxicidad.
Figura 4: Biocompatibilidad celular in vitro de Ti-EV. La actividad de la LDH se midió en medios de cultivo 48 h después de la siembra celular en los implantes. Las células sembradas en plástico de cultivo de tejidos se establecieron como 0% de toxicidad, mientras que las células sembradas en plástico de cultivo de tejidos y tratadas con tritón X-100 1% se establecieron como 100% de toxicidad. Una línea discontinua se muestra al 30%, que es el valor máximo aceptado para la citotoxicidad de los dispositivos médicos de acuerdo con ISO-10993: 5. Los datos representan la media ± SEM, con n = 15 (se realizaron tres experimentos independientes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras para la funcionalización de los vehículos eléctricos en las superficies ti. El método presentado se basa en una estrategia de drop casting, que es un tipo de funcionalización de fisiorción. Existe una bibliografía deficiente con respecto a la funcionalización de los evs en las superficies de Ti, aunque hay pocos estudios que muestren diferentes ventajas al inmovilizar los EV en Ti10. De todos modos, algunas de las estrategias exploradas incluyen la unión bioquímica8, el atrapamiento polimérico9 o el drop casting10. Aunque el uso de recubrimientos químicos a través de enlaces covalentes podría lograr un recubrimiento más homogéneo con un mayor grado de funcionalización, las reacciones químicas pueden dañar la estructura y funcionalidad de los EV15. La fundición por gota es un método fácil y de bajo costo en comparación con el atrapamiento polimérico o la unión bioquímica.
Un punto importante del protocolo que se puede abordar es la fuente EV. En este estudio, los EV se obtienen de PL. Sin embargo, el método de drop casting es adaptable a cualquier tipo de EV, ya que se basa en interacciones físicas. Estudios previos con otros métodos presentan resultados positivos tras evaluar el uso de EV cultivados celulares como células madre8,10 o machropages9. Es importante, en cuanto al uso de los EV, realizar una caracterización completa de los mismos. La Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares tiene como objetivo determinar la mayoría de los principales parámetros de los EV para asegurar la reproducibilidad en el campo12. Otros estudios ya han descrito la metodología para la caracterización de EVs, por lo que en este protocolo no hemos detallado los protocolos de microscopía electrónica y técnica western blot realizados13.
Un paso crítico para la funcionalización de Ti por fundición por gota es el tiempo y las condiciones permitidas para la fisisorción de los VEHÍCULOS eléctricos. En el protocolo que presentamos, la incubación en condiciones de vacío se realiza hasta que las gotas están completamente secas. Por lo general, se necesitan 2 h para asegurar la evaporación del agua a 37 ° C y en condiciones de vacío. Sin embargo, el número de implantes que se están funcionalizando puede aumentar el tiempo necesario para garantizar la correcta adhesión de los EV en Ti. Es importante asegurarse de que no quede agua antes de proceder a la caracterización o estudios funcionales. Sin embargo, las variaciones en el protocolo para la funcionalización de los EV en Ti se pueden encontrar en la literatura. Por ejemplo, ya se ha explorado una incubación nocturna a 4 °C sin condiciones de vacío10. Sin embargo, en nuestras manos, el uso de este método condujo a malos resultados en comparación con el secado completo que describimos.
Aunque no se realiza en el presente protocolo, la funcionalización de los EV podría evaluarse a través de diferentes metodologías, entre otras, los cambios en la humectabilidad de la superficie podrían caracterizarse midiendo el ángulo de contacto con el agua en la superficie; y cambios en la naturaleza química de los recubrimientos mediante espectroscopia infrarroja transformada por Fourier (FTIR) acoplada a microscopía óptica. Además, los EV pueden teñirse con tintes específicos (como el tinte PKH26), y las superficies funcionalizadas pueden ser fotografiadas por microscopía de fluorescencia.
En general, se pueden realizar más pruebas funcionales para explorar la funcionalidad osteogénica de la deposición de EV en Ti. Por un lado, los ensayos de adhesión o crecimiento celular realizados mediante microscopía confocal o actividad enzimática pueden ser el primer abordaje para probar la funcionalidad10. En este trabajo, hemos descrito el ensayo de citotoxicidad como uno de los primeros enfoques de los efectos de los implantes en las células. Por otro lado, los ensayos de PCR pueden utilizarse para determinar la expresión génica de marcadores osteogénicos en cultivo celular realizado en discos Ti8,9,10. Además, la detección de proteínas a través de western blot también puede sugerir un perfil osteogénico, a pesar de ser una técnica semicuantitativa. Otras técnicas de detección de proteínas, como las matrices de detección o los kits enzimáticos, también podrían ser buenos enfoques para el rendimiento de los experimentos de funcionalidad9. Un ensayo funcional adicional es la determinación de la deposición de calcio a través de Calcein Blue Staining16. Una vez demostrada la funcionalidad in vitro, se podrían realizar más experimentos utilizando moldeles animales8.
En conclusión, la funcionalización superficial permite un mejor diseño terapéutico de los biomateriales. La combinación de EV con biomateriales implantables puede permitir una liberación sostenida asociada a una mejora de la biocompatibilidad y las propiedades osteogénicas del biomaterial. Es importante explorar diferentes enfoques para la unión de EV; por lo tanto, la fundición por gota es un punto de partida interesante para futuros estudios que tienen como objetivo producir dispositivos ortopédicos clínicamente disponibles. El protocolo presentado en este manuscrito tiene como objetivo dar una guía fácil y reproducible para el rendimiento de futuros experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), y el PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiados por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
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