Methodenartikel

Gemultiplexte fluoreszierende immunhistochemische Färbung von vier endometrialen Immunzelltypen bei wiederkehrenden Fehlgeburten

DOI:

10.3791/62931

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4. August 2021

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1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.

Zusammenfassung

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Die Immunhistochemie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik. Es kann verwendet werden, um verschiedene biologische Prozesse oder Pathologien wie Wundheilung, Immunantwort, Gewebeabstoßung und Gewebe-Biomaterial-Interaktionen zu charakterisieren. Die Visualisierung und Quantifizierung mehrerer Antigene (insbesondere für Immunzellen) in einem einzigen Gewebeschnitt mittels konventioneller immunhistochemischer (IHC) Färbung bleibt jedoch unbefriedigend. Daher wurden in den letzten Jahren multiplexe Technologien eingeführt, um mehrere biologische Marker in einer einzelnen Gewebeprobe oder einem Ensemble verschiedener Gewebeproben zu identifizieren.

Diese Technologien können besonders nützlich sein, um die Veränderungen der Immun-Zell-zu-Zell-Interaktionen innerhalb des Endometriums zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit wiederkehrenden Fehlgeburten während der Implantation zu differenzieren. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die multiplexierte Fluoreszenz-IHC-Färbung, um die Dichte und Clusterbildung von vier wichtigen Immunzelltypen gleichzeitig in genau getimten Endometriumproben während der Embryonenimplantation zu untersuchen. Die Methode umfasst die Probenvorbereitung, die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen und das Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug auf den Nachweis endometrialer Immunzellen.

Mit dieser Methode kann die Dichte und Clusterbildung von vier großen Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die kritischen Faktoren und die Fehlerbehebung diskutiert, um mögliche Fluorophor-Interferenzen zwischen den aufgetragenen Fluoreszenzsonden zu überwinden. Wichtig ist, dass die Ergebnisse dieser Multiplex-Färbetechnik dazu beitragen können, ein tiefes Verständnis der immunologischen Interaktion und Regulation während der Embryonenimplantation zu vermitteln.

Einleitung

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Wiederkehrende Fehlgeburten (RM) können als der Verlust von zwei oder mehr Schwangerschaften vor der 24. Schwangerschaftswoche definiert werden1. Diese häufige Fortpflanzungsstörung betrifft bis zu 1% der Paare weltweit2,3. Die Pathophysiologie ist multifaktoriell und kann in embryologisch getriebene Ursachen (hauptsächlich aufgrund eines abnormalen embryonalen Karyotyps) und mütterlich getriebene Ursachen unterteilt werden, die die Endometrium- und / oder Plazentaentwicklung beeinflussen. Diese Manifestation kann aus elterlichen genetischen Anomalien, Uterusanomalien, prothrombotischen....

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Protokoll

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Die Studie wurde vom Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee genehmigt. Die Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde vor der Entnahme der Endometriumbiopsien eingeholt. Im Einleitungsabschnitt finden Sie die Einschlusskriterien der Kontroll- und RM-Gruppen.

1. Probenvorbereitung

  1. Stellen Sie sicher, dass sich alle Frauen in dieser Studie ab Tag 9 des Menstruationszyklus einem täglichen Urinmessstabtest unterziehen, um den Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) zu identifizieren, um den Eisprung zu erkennen, und die Endometriumbiopsien genau am7. Tag nac....

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Ergebnisse

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Der schematische Gesamtprozess zur Durchführung eines 4-Farben-Multiplex-Assays zum Nachweis von 4 endometrialen Immunzelltypen ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, das Protokoll für diese Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung erforderte 8 Schlüsselschritte: 1. Objektträgervorbereitung, 2. Epitop-Retrieval, 3. Blockierung, 4. Primäre Antikörperanwendung, 5. Sekundäre Antikörperanwendung, 6. Signalamplifikation, 7. Entfernung von Antikörpern und 8. Gegenfleck und Mount. Die Bildwiedergabe.......

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Diskussion

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Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es ist wichtig zu beachten, dass die Multiplexfärbung eine sorgfältige Optimierung erfordert. Die Antigengewinnung unter Verwendung der Citratpuffer- und Mikrowellentechnologie erfordert eine Optimierung, um ein vollständiges Antikörper-Stripping sicherzustellen und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Da TSA-Reagenzien kovalent an Stellen binden, die das Antigen umgeben, können sie möglicherweise die Bindung eines nachfolgenden primären Antikörpers .......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde 2018 vom Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund und dem Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AmplifikationsverdünnungsmittelPerkin ElmerFP1498Fluorophor-Verdünnungsmittel Puffer
AntikörperverdünnungsmittelPerkin ElmerARD1001EAVerdünnung des Antikörpers
CD3Spring BioscienceM3072Primärer Antikörper
CD20Biocare MedicalCM004BPrimärer Antikörper
CD56LeicaNCL-CD56-504Primär Antikörper
CD68Spring BioscienceM5510Primärer Antikörper
Citrat Pufferlösung, pH 6,0 (10x)AbcamAB64214Antigen-Rückgewinnungslösung
EMSURE Xylol (isomere Mischung)Merck108297Entparaffinierung
Ethanol absolutMerck107017Ethylalkohol zur Rehydratisierung
HistoCore BIOCUT Manuelle Rotation Leica MikrotomLeicaRM2125RTSSchnitte von paraffineingebettetem Gewebe
inForm Erweiterte BildanalysesoftwarePerkin ElmerinForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (Version 14.0)Datenanalyse-Software
Mantra® WorkstationAkoya BiosciencesCLS140089Spectral imaging
MikrowellePanasonicInverterMikrowellenstripping
Opal 520Perkin ElmerFP1487AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 620Perkin ElmerFP1495AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 650Perkin ElmerFP1496AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 690Perkin ElmerFP1497AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
OfenMemmertU10Entparaffinierungsperoxidase-Blockierungslösung
DAKOS2023Entfernung von Gewebeperoxidase-Aktivitäten
Poly-L-Lysin-beschichteter ObjektträgerFISHER SCIENTIFIC120-550-15Objektträger für histologische Routineanwendungen
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EASekundärantikörper
ProLong™ Gold Antifade EindeckmittelThemoFisher ScientificP36930Eindeckspachtel
/Version 2.1-0Räumliche Punktmusteranalyse
Spectral DAPIPerkin ElmerFP1490ANukleinsäurefärbung
Tissue ProcessorThermo FischerExcelsior ESGewebeaufbereitung für Dehydratisierung und Paraffinierung
Tris Puffer Kochsalzlösung (TBS), 10xCell Signaling Technology12498SWaschlösung
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LNichtionisches Reinigungsmittel

Referenzen

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  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L.

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Schlagwörter

Multiplex ImmunhistochemieFluoreszenzf rbungendometriale ImmunzellenClusterbildung von ImmunzellenGewebesegmentationEpitopenfreilegungAntik rpermarkierungZellz hlungEmbryoimplantation

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