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Methodenartikel

Gemultiplexte fluoreszierende immunhistochemische Färbung von vier endometrialen Immunzelltypen bei wiederkehrenden Fehlgeburten

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DOI:

10.3791/62931

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4. August 2021

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1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.

Zusammenfassung

Die Immunhistochemie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik. Es kann verwendet werden, um verschiedene biologische Prozesse oder Pathologien wie Wundheilung, Immunantwort, Gewebeabstoßung und Gewebe-Biomaterial-Interaktionen zu charakterisieren. Die Visualisierung und Quantifizierung mehrerer Antigene (insbesondere für Immunzellen) in einem einzigen Gewebeschnitt mittels konventioneller immunhistochemischer (IHC) Färbung bleibt jedoch unbefriedigend. Daher wurden in den letzten Jahren multiplexe Technologien eingeführt, um mehrere biologische Marker in einer einzelnen Gewebeprobe oder einem Ensemble verschiedener Gewebeproben zu identifizieren.

Diese Technologien können besonders nützlich sein, um die Veränderungen der Immun-Zell-zu-Zell-Interaktionen innerhalb des Endometriums zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit wiederkehrenden Fehlgeburten während der Implantation zu differenzieren. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die multiplexierte Fluoreszenz-IHC-Färbung, um die Dichte und Clusterbildung von vier wichtigen Immunzelltypen gleichzeitig in genau getimten Endometriumproben während der Embryonenimplantation zu untersuchen. Die Methode umfasst die Probenvorbereitung, die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen und das Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug auf den Nachweis endometrialer Immunzellen.

Mit dieser Methode kann die Dichte und Clusterbildung von vier großen Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die kritischen Faktoren und die Fehlerbehebung diskutiert, um mögliche Fluorophor-Interferenzen zwischen den aufgetragenen Fluoreszenzsonden zu überwinden. Wichtig ist, dass die Ergebnisse dieser Multiplex-Färbetechnik dazu beitragen können, ein tiefes Verständnis der immunologischen Interaktion und Regulation während der Embryonenimplantation zu vermitteln.

Einleitung

Wiederkehrende Fehlgeburten (RM) können als der Verlust von zwei oder mehr Schwangerschaften vor der 24. Schwangerschaftswoche definiert werden1. Diese häufige Fortpflanzungsstörung betrifft bis zu 1% der Paare weltweit2,3. Die Pathophysiologie ist multifaktoriell und kann in embryologisch getriebene Ursachen (hauptsächlich aufgrund eines abnormalen embryonalen Karyotyps) und mütterlich getriebene Ursachen unterteilt werden, die die Endometrium- und / oder Plazentaentwicklung beeinflussen. Diese Manifestation kann aus elterlichen genetischen Anomalien, Uterusanomalien, prothrombotischen Zuständen, endokrinologischen Faktoren und immunologischen Störungenresultieren 4.

In den letzten Jahren wurde die Dysfunktion der Immuneffektorzellen mit der Pathogenese des frühen Schwangerschaftsverlustes in Verbindung gebracht5. Dies hat viele Untersuchungen zur Aufklärung der spezifischen Populationen von Immunzellen im Endometrium während des Menstruationszyklus, der Implantation und der frühen Schwangerschaft mit spezifischen Rollen in der frühen Schwangerschaft inspiriert. Unter diesen Immunzellen spielen Uteruszellen des natürlichen Killers (uNK) eine entscheidende Rolle während der Embryonenimplantation und Schwangerschaft, insbesondere bei den Prozessen der trophoblastischen Invasion und Angiogenese6. Studien haben eine erhöhte uNK-Zelldichte im Endometrium von Frauen mit RM7, 8gezeigt,obwohl dieser Befund nicht miteinemerhöhten Risiko für eine Fehlgeburt verbunden war9. Dies stimulierte jedoch die Forschung zur Bewertung der Dichte anderer Immunzelltypen (wie Makrophagen, dendritische Uteruszellen) im Endometrium bei Frauen mit RM10,11. Dennoch bleibt ungewiss, ob es bei Frauen mit RM zu einer signifikanten Veränderung der Immunzelldichte im Periimplantations-Endometrium kommt.

Eine mögliche Erklärung für die Unsicherheit ist, dass die Bewertung der endometrialen Immunzelldichte aufgrund der schnellen Veränderungen des Endometriums während des Implantationsfensters schwierig sein könnte. Während des 24-Stunden-Zeitrahmens verändern signifikante Veränderungen im Endometrium die Immunzelldichte und die Zytokinsekretion, was zu einer Variationsquelle in diesen Ergebnissenführt 12. Darüber hinaus stützen sich die meisten Berichte hauptsächlich auf die Verwendung von Einzelzellfärbungen (z. B. traditionelle IHC-Methoden), die nicht mehrere Marker auf demselben Gewebeschnitt untersuchen konnten. Obwohl die Durchflusszytometrie zum Nachweis mehrerer Zellpopulationen in einer einzigen Probe verwendet werden kann, behindern die großen Mengen an benötigten Zellen und die zeitaufwändige Optimierung die Popularität und Effizienz dieser Methode. Daher könnte die jüngste Weiterentwicklung der Multiplex-IHC-Färbung dieses Problem lösen, indem mehrere Marker auf demselben Objektträger immungefärbt werden, um mehrere Parameter zu bewerten, einschließlich der Zelllinie und der histologischen Lokalisation einzelner Immunsubpopulationen. Darüber hinaus kann diese Technologie die erhaltenen Informationen im Falle einer begrenzten Gewebeverfügbarkeit maximieren. Letztendlich kann diese Technik helfen, die Unterschiede in den Immunzellinteraktionen im Endometrium zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit RM aufzuklären.

Zwei Gruppen von Frauen wurden aus dem Prince of Wales Hospital rekrutiert, darunter fruchtbare Kontrollfrauen (FC) und Frauen mit unerklärlichen wiederkehrenden Fehlgeburten (RM). Fruchtbare Kontrolle war definiert als Frauen, die mindestens eine Lebendgeburt ohne spontane Fehlgeburt in der Vorgeschichte hatten, und RM-Frauen wurden als diejenigen definiert, die vor der 20. Schwangerschaftswoche eine Vorgeschichte von ≥2 aufeinanderfolgenden Fehlgeburten hatten. Die Probanden aus den beiden Gruppen erfüllten die folgenden Einschlusskriterien: (a) Alter zwischen 20 und 42 Jahren, (b) Nichtraucher, (c) regelmäßiger Menstruationszyklus (25-35 Tage) und normale Gebärmutterstruktur, (d) keine Anwendung eines hormonellen Regimes für mindestens 3 Monate vor der Endometriumbiopsie, (e) keine Hydrosalpinx durch Hystero-Salpingogramm. Darüber hinaus hatten alle rekrutierten Probanden eine normale Karyotypisierung, ein normales 3-dimensionales Ultraschall-Hysterosalpingogramm, ein follikelstimulierendes Hormon am Tag 2 < 10 IE / L, mittelluteales Progesteron > 30 nmol / L, eine normale Schilddrüsenfunktion und wurde negativ auf Lupus-Antikoagulans und Anticardiolipin-IgG- und IgM-Antikörper getestet.

Um die immunologischen Grundlagen der RM besser zu verstehen, wäre es am wünschenswertesten, die wichtigsten Immunzelltypen, die zum Zeitpunkt der Implantation im Endometrium vorhanden sind, gleichzeitig zu quantifizieren und zu lokalisieren. Dieser Beitrag beschreibt das gesamte Protokoll von der Probenvorbereitung über die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen bis hin zum Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug zum Nachweis endometrieller Immunzellen. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit, wie die Dichte und Clusterbildung der Immunzelltypen gleichzeitig im Endometrium bestimmt werden kann.

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Protokoll

Die Studie wurde vom Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee genehmigt. Die Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde vor der Entnahme der Endometriumbiopsien eingeholt. Im Einleitungsabschnitt finden Sie die Einschlusskriterien der Kontroll- und RM-Gruppen.

1. Probenvorbereitung

  1. Stellen Sie sicher, dass sich alle Frauen in dieser Studie ab Tag 9 des Menstruationszyklus einem täglichen Urinmessstabtest unterziehen, um den Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) zu identifizieren, um den Eisprung zu erkennen, und die Endometriumbiopsien genau am7. Tag nach dem LH-Anstieg (LH + 7) zu timen.
  2. Erhalten Sie ein 0,5 cm2 Fragment der Endometriumbiopsie mit einem Pipelle-Probenehmer oder Pipet Curet von fruchtbaren Frauen und Frauen mit unerklärlicher RM. Beschriften Sie den Behälter und legen Sie die Probe sofort in 10% neutral-gepuffertes Formalin (pH 7) zur nächtlichen Fixierung bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Das Volumen des Fixiermittels sollte das 5-10-fache des Gewebes betragen.
  3. Legen Sie das Gewebe in eine Kartusche zur Dehydrierung in eine Gewebeverarbeitungsmaschine, bevor Sie es in geschmolzenes Paraffinwachs einbetten. Das Gewebe bei 58-60 °C in Paraffin einbetten.
  4. Lassen Sie den Paraffinblock über Nacht bei Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie ein Mikrotom, um die Paraffinblöcke auf eine Dicke von 3 μm zu trimmen.
    HINWEIS: Die Verwendung von destilliertem Wasser hilft bei der ordnungsgemäßen Gewebemontage und Adhärenz während der Multiplexfärbung.
  5. Legen Sie das Paraffinband 30 s lang in ein Wasserbad bei 40-45 °C.
  6. Montieren Sie die Schnitte auf Poly-L-Lysin (0,1% w/v)-beschichteten Objektträgern aus Mikroskopglas. Legen Sie die Objektträger mit dem Gewebe nach oben und lassen Sie sie über Nacht bei 37 °C trocknen. Bewahren Sie die Dias in einem Diakasten bis zur weiteren Verwendung von extremen Temperaturen auf.

2. Bestimmen Sie die ideale Konzentration von Antikörpern für Multiplex-IHC mit herkömmlicher IHC.

HINWEIS: Dies ist wichtig, um das Expressionsniveau und das Muster jedes Immunmarkers in der Endometriumprobe zu identifizieren und die Färbesequenz jedes Markers sowie die zugehörigen Tyramid-Signalverstärkungs-(TSA)-Fluorophorpaarungen zu bestimmen.

  1. Testen Sie die Antikörper auf ihre Eignung für Multiplex-IHC mit manueller konventioneller IHC13.
  2. Verwenden Sie Endometriumgewebe für Einzelantikörpertests.
  3. Umfassen Sie eine Positivkontrolle (z. B. Milz) und eine Negativkontrolle (Isotypkontrolle) zur Optimierung des Färbezustands jedes Antikörpers.
  4. Führen Sie die Färbung mit der im Datenblatt des Antikörpers empfohlenen Verdünnung durch.
  5. Führen Sie eine zusätzliche Färbung mit Konzentrationen oberhalb und unterhalb der empfohlenen Verdünnung durch, die in Schritt 2.3 verwendet wird.
    HINWEIS: Ein klinischer Pathologe sollte die gefärbten Objektträger blind beurteilen, um die Lokalisation der Antikörpersondierung und die zelluläre Integrität zu bestätigen.

3. Multiplex-Färbemethode

  1. Folienvorbereitung und Fixierung
    1. Legen Sie die Objektträger (ab Schritt 1.6) flach mit dem Gewebe nach oben in einen Ofen und backen Sie sie bei 60 °C für mindestens 1 h.
    2. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 20 minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie in ein vertikales Schiebegestell legen.
    3. Entwachsen und rehydrieren Sie die formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Objektträger mit 10 Minuten, die jedem der folgenden Schritte zugeteilt sind: Xylol (2x), 100% Ethanol (2x), 95% Ethanol (1x), 70% Ethanol (2x) und destilliertes Wasser (2x).
    4. Legen Sie das Dia-Rack in eine Kunststoff-Diabox und tauchen Sie sie in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, pH 7,6).
      HINWEIS: Die Objektträger müssen ab diesem Rehydratationsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben.
    5. Fixieren Sie die Proben, indem Sie die Objektträger in eine Kunststoff-Objektträgerbox tauchen, die mit einer Mischung aus in Methanol (1:9) verdünntem Formaldehyd gefüllt ist, für 30 minuten im Dunkeln.
    6. Waschen Sie die Objektträger zweimal in entionisiertem Wasser für 2 minuten und fahren Sie dann mit der Antigengewinnung fort.
  2. Epitop-Abruf
    1. Legen Sie das Dia-Rack in eine hitzebeständige Box und füllen Sie es mit Zitronensäurepuffer (pH 6,0), um die Dias abzudecken.
    2. Stellen Sie die Box in die Mikrowelle und erhitzen Sie die Objektträger für 50 s bei 100% Leistung, gefolgt von 20 minuten bei 20% Leistung, um die gleiche Temperatur aufrechtzuerhalten.
    3. Lassen Sie die Folien bei Raumtemperatur ca. 15 min abkühlen.
    4. Spülen Sie die Objektträger 2 min lang in Wasser ab, gefolgt von TBS-Tween 20 (TBST) für 2 min.
      HINWEIS: TBST besteht aus 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20 (v/v).
  3. Blockierend
    1. Blockieren Sie die endogene Peroxidaseaktivität im Gewebe, indem Sie den Objektträger für 10 Minuten auf ein Glas mit Peroxidase-Blockierungslösung (siehe Materialtabelle)tauchen.
    2. Waschen Sie die Objektträger mit TBST für 5 min.
    3. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu markieren.
    4. Bedecken Sie die Gewebeschnitte mit einem Blockierpuffer (siehe Materialtabelle)oder Rinderserumalbumin (5%, w/v) und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer.
  4. Antikörper- und Signalanwendung
    1. Entfernen Sie die blockierenden Reagenzien.
    2. Inkubieren Sie mit dem primären Antikörper von Interesse (z. B. CD3, 1:100 Verdünnung in Antikörperverdünnungsmittel, siehe Tabelle 1) in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 30 min.
    3. Entfernen Sie den primären Antikörper. 3x mit TBST jeweils 5 min waschen.
    4. Inkubieren Sie mit dem Polymer Meerrettichperoxidase (HRP)-markierten sekundären Antikörper (Tabelle 1) für 15 min in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. 3x mit TBST jeweils 5 min waschen.
    5. Tragen Sie die Opalfluorophor-TSA-Arbeitslösung (1:100 in Amplifikationsverdünnungsmittel) auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min, um eine Fluorophorkonjugation zur Gewebeprobe an primären Antikörperbindungsstellen zu ermöglichen. Mit TBST in dreifacher Ausfertigung jeweils 5 min waschen.
  5. Mikrowellenbasiertes
    1. Spülen Sie mit dem Antigen-Retrieval-Puffer (Citrat-Pufferlösung, pH 6,0).
    2. Führen Sie mikrowellenbasiertes Stripping durch, um den Primär-Sekundär-HRP-Komplex zu entfernen und den nächsten primären Antikörper (z. B. CD20) einzuführen.
    3. Legen Sie die Objektträger in einen Antigen-Abrufpuffer, erhitzen Sie sie bei 100% Leistung für 50 s, gefolgt von 20% Leistung für 20 minuten in mikrowellensicheren Behältern, und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur für 15 minuten.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 bis 3.5.2, bis die Gewebeproben mit allen primären Antikörpern untersucht wurden.
  6. Gegenpflände und Montage
    1. Nach mikrowellenbasiertem und Abkühlen des Antigen-Retrieval-Puffers spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und TBST ab.
    2. Mit 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung (1,0 μg/ml) für 5 min in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. 3x mit TBST jeweils 5 min waschen. Einmal mit Wasser für 5 Min. waschen.
    4. Trocknen Sie den Schlitten an der Luft und montieren Sie ihn mit dem entsprechenden Montagemedium (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Für Monoplex-Dias, die für die Entwicklung von Spektralbibliotheken verwendet werden sollen, ist kein Counterstaining erforderlich.

4. Bild und Analyse

  1. Erstellung von Spectral Library Slides
    1. Erstellen Sie Bibliotheksobjektträger (Single-Stain-Referenzbilder) für jeden Fluorophor, DAPI und jede Autofluoreszenz mit demselben Kontrollgewebe für die multispektrale Bildanalyse.
    2. Führen Sie unter Verwendung der Objektträger der Endometriumbiopsieproben von Frauen mit RM und fruchtbaren Frauen die Schritte 1.1 bis 3.6.4 für den Einzelantikörpernachweis für jeden Objektträger durch (ohne weitere Antikörper- oder Fluorophorzugabe).
    3. Färben Sie für jeden Antikörpernachweis einen der Objektträger mit DAPI (wie in Schritt 3.6.2) und lassen Sie einen Objektträger ungefärbt, um eine mögliche Gewebeautofluoreszenz im Spektrum nachzuweisen.
    4. Verwenden Sie die entsprechenden Filter in der Workstation, um das Bild für diesen Satz von Objektträgern für jeden Antikörper zu erhalten und in die Bildanalysebibliothek hochzuladen (wie in Schritt 4.2 beschrieben).
    5. Sobald das Bild aufgenommen wurde, wählen Sie inForm als Spektralbibliotheksquelle und erstellen Sie die Spektralbibliothek.
    6. Wenn Fluorophore verwendet werden, wählen Sie Stains/Fluors... aus dem Menü.
    7. Schränken Sie bei der Auswahl der Flecken oder Fluorophore die Auswahl ein, indem Sie eine oder mehrere Gruppen auswählen. Wählen Sie Alle, um alle Spektren anzuzeigen, die mit den Bildern kompatibel sind.
  2. Spektrale Bildgebung
    HINWEIS: Die Bilder wurden mit der Mantra Workstation aufgenommen, wobei die Spektralbibliothek mit der inForm Image Analysis-Software eingerichtet wurde.
    1. Erfassen Sie das Bild der einzeln antikörpergefärbten Objektträger mit den geeigneten Epifluoreszenzfiltern wie in Tabelle 2 vorgeschlagen (z. B. DAPI, Fluoresceinisothiocyanat [FITC], CY3, Texas Red und CY5) mit der Workstation.
      HINWEIS: Empfohlene Filter für die spezifischen Fluorophore, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
    2. Identifizieren Sie eine geeignete Belichtungszeit für ein optimales Signal, indem Sie jeden Marker in seinem entsprechenden Fluoreszenzkanal untersuchen.
      HINWEIS: Das optimale Signal wird gemäß der Referenz auf die Positivität und Lokalisation bestimmt, die in der Einzelantikörperfärbung erhalten wurde.
    3. Bestimmen Sie eine feste Expositionszeit für jeden Analyten (Antikörper-Fluorophor-Kombination), um einen Probenvergleich zu standardisieren.
      ANMERKUNG: Die Bestimmung des festen Engagements hängt von der Intensität der Interessenstichprobe ab.
    4. Scannen Sie die multiplexgefärbten Dias im entsprechenden Scanmodus mit dem eingebetteten Autofokus-Algorithmus.
      HINWEIS: Die etablierte Spektralbibliothek würde verwendet werden, um den multispektralen Bildwürfel in einzelne Einzelkomponenten zu differenzieren (spektrale Entmischung). Dies würde es ermöglichen, die farbbasierte Identifizierung für alle Marker von Interesse mit den folgenden zwei Hauptschritten zu verarbeiten: Trainingseinheit und Bildanalysesitzung.
  3. Bildanalyse
    1. Zellzählung ausgewählter Immunzelltypen im Endometrium
    2. Erfassen Sie mindestens 10 Felder für die Analyse unter 200-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: Die Felder wurden erfasst, indem der gesamte Abschnitt ohne Auswahl gescannt wurde. Dies kann die gleichzeitige Erfassung aller Zellbestandteile des Endometriums sicherstellen, z. B. der luminalen Epithelgrenze, des Stromas und der Drüsen.
    3. Um die Zellen zu zählen, klicken Sie in der Schrittleiste auf die Schaltfläche Objekte zählen, um das Bedienfeld "Objektzählungseinstellungen" anzuzeigen.
    4. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Objekt verwerfen, wenn Sie eine Kante berühren, um auszuschließen, dass Objekte den Rand des Bildes, des Prozessbereichs oder des Gewebebereichs berühren.
    5. Wenn das Gewebe segmentiert wurde, wählen Sie die Gewebekategorie aus, in der die Objekte zu finden sind. Zählen Sie keine Objekte außerhalb der ausgewählten Gewebekategorie.
    6. Wählen Sie den gewünschten Ansatz zum Identifizieren von Objekten aus: Objektbasiert oder Pixelbasiert (Schwellenwert).
      HINWEIS: Der Pixel-basierte (Schwellenwert) Ansatz sollte im Falle eines zuverlässigen oder konsistenten Flecks gewählt werden, bei dem die Anwendung eines einfachen Schwellenwerts die Objektpixel ergibt. Der objektbasierte Ansatz wird empfohlen, wenn fortgeschrittenere morphometriebasierte Ansätze bei mangelnder Konsistenz und Spezifität der Färbung von Objekten erforderlich sind.
    7. Wählen Sie die gewünschte Signalskalierungaus: Automatische Skalierung oder feste Skalierung.
      HINWEIS: Wenn Sie "Automatische Skalierung" wählen, wird jede Komponentenebene automatisch skaliert, bevor die Objektsegmentierung durchgeführt wird. Die Option "Feste Skalierung" wird empfohlen, wenn eine bessere Segmentierungsleistung erforderlich ist und die Fleckensignale konsistent und zuverlässig sind.
    8. Wählen Sie in der Dropdown-Liste die primäre Komponente für die Objektsegmentierung aus.
    9. Passen Sie den Mindestsignalwert für die Primärkomponente an den gewünschten Schwellenwert an.
    10. Um Löcher in Objekten automatisch zu füllen, wählen Sie "Löcher füllen".
    11. Um Objekte, die andere Objekte berühren, als einzelne Objekte und nicht als ein Objekt zu erkennen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Aufteilung verfeinern, nachdem Sie das Kontrollkästchen Maximale Größe (Pixel) aktiviert haben.
    12. Um Objekte basierend auf der Rundheit des Objekts auszuschließen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Rundheit (Roundness), und geben Sie die gewünschte minimale Zirkularität an.
    13. Zählen Sie alle Stromazellen (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−und DAPI+), einschließlich der Zellen, die die Blutgefäße umgeben.
    14. Zählen Sie die Immunzellen separat, einschließlich T-Zellen (CD3+ und DAPI+),B-Zellen (CD20+ und DAPI+),Makrophagen (CD68+ und DAPI+) und uNK-Zellen (CD56+ und DAPI+).
    15. Drücken Sie die Daten als Prozentsätze der Immunzellen relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen für jedes aufgenommene Bild aus und geben Sie die endgültige Zellzahl als Durchschnitt aller Felder an.
    16. Verwenden Sie den Ansichts-Editor, um die resultierenden Datentabellen nach der Verarbeitung anzuzeigen. Exportieren Sie die Tabelle Count Data.
    17. Quantifizierung der räumlichen Verteilung der endometrialen Immunzelle
    18. Schätzen Sie unter 200-facher Vergrößerung die L-Funktion mit dem R-Programm für einen Bereich von 0-20 μm, der als maximaler Zell-Zell-Kontaktabstand14betrachtet wird.
      HINWEIS: Die R-Sprach-Toolbox 'spatstat' wurde verwendet, um die L-Funktion zu messen.
      1. Bezeichnen Sie den Grad der Clusterbildung verschiedener Paare von Immunzellen basierend auf der Fläche unter der Kurve (AUC) ihrer L-Funktion.

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Ergebnisse

Der schematische Gesamtprozess zur Durchführung eines 4-Farben-Multiplex-Assays zum Nachweis von 4 endometrialen Immunzelltypen ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, das Protokoll für diese Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung erforderte 8 Schlüsselschritte: 1. Objektträgervorbereitung, 2. Epitop-Retrieval, 3. Blockierung, 4. Primäre Antikörperanwendung, 5. Sekundäre Antikörperanwendung, 6. Signalamplifikation, 7. Entfernung von Antikörpern und 8. Gegenfleck und Mount. Die Bildwiedergabe...

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Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es ist wichtig zu beachten, dass die Multiplexfärbung eine sorgfältige Optimierung erfordert. Die Antigengewinnung unter Verwendung der Citratpuffer- und Mikrowellentechnologie erfordert eine Optimierung, um ein vollständiges Antikörper-Stripping sicherzustellen und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Da TSA-Reagenzien kovalent an Stellen binden, die das Antigen umgeben, können sie möglicherweise die Bindung eines nachfolgenden primären Antikörpers ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.

Danksagungen

Diese Studie wurde 2018 vom Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund und dem Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AmplifikationsverdünnungsmittelPerkin ElmerFP1498Fluorophor-Verdünnungsmittel Puffer
AntikörperverdünnungsmittelPerkin ElmerARD1001EAVerdünnung des Antikörpers
CD3Spring BioscienceM3072Primärer Antikörper
CD20Biocare MedicalCM004BPrimärer Antikörper
CD56LeicaNCL-CD56-504Primär Antikörper
CD68Spring BioscienceM5510Primärer Antikörper
Citrat Pufferlösung, pH 6,0 (10x)AbcamAB64214Antigen-Rückgewinnungslösung
EMSURE Xylol (isomere Mischung)Merck108297Entparaffinierung
Ethanol absolutMerck107017Ethylalkohol zur Rehydratisierung
HistoCore BIOCUT Manuelle Rotation Leica MikrotomLeicaRM2125RTSSchnitte von paraffineingebettetem Gewebe
inForm Erweiterte BildanalysesoftwarePerkin ElmerinForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (Version 14.0)Datenanalyse-Software
Mantra® WorkstationAkoya BiosciencesCLS140089Spectral imaging
MikrowellePanasonicInverterMikrowellenstripping
Opal 520Perkin ElmerFP1487AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 620Perkin ElmerFP1495AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 650Perkin ElmerFP1496AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
Opal 690Perkin ElmerFP1497AGeeignetes Fluoreszenzreagenz auf Tyramidbasis
OfenMemmertU10Entparaffinierungsperoxidase-Blockierungslösung
DAKOS2023Entfernung von Gewebeperoxidase-Aktivitäten
Poly-L-Lysin-beschichteter ObjektträgerFISHER SCIENTIFIC120-550-15Objektträger für histologische Routineanwendungen
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EASekundärantikörper
ProLong™ Gold Antifade EindeckmittelThemoFisher ScientificP36930Eindeckspachtel
/Version 2.1-0Räumliche Punktmusteranalyse
Spectral DAPIPerkin ElmerFP1490ANukleinsäurefärbung
Tissue ProcessorThermo FischerExcelsior ESGewebeaufbereitung für Dehydratisierung und Paraffinierung
Tris Puffer Kochsalzlösung (TBS), 10xCell Signaling Technology12498SWaschlösung
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LNichtionisches Reinigungsmittel

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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