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Biology

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.

Abstract

Mückenspeicheldrüsen (SGs) sind ein notwendiges Einstiegsorgan für die Übertragung von durch Insekten übertragenen Krankheitserregern. Krankheitserreger, einschließlich Viren und die Plasmodium-Parasiten, die Malaria verursachen, sammeln sich in den sekretorischen Hohlräumen von SG-Zellen an. Hier sind sie bereit für die Übertragung auf ihre Wirbeltierwirte während einer anschließenden Blutmahlzeit. Da sich erwachsene Drüsen als Eine Ausarbeitung von Larven-SG-Gang-Knospenresten bilden, die über die frühe pupale SG-Histolyse hinaus bestehen bleiben, ist die Larven-SG ein ideales Ziel für Interventionen, die die Krankheitsübertragung begrenzen. Das Verständnis der Larven-SG-Entwicklung kann dazu beitragen, ein besseres Verständnis ihrer Morphologie und funktionellen Anpassungen zu entwickeln und bei der Bewertung neuer Interventionen zu helfen, die auf dieses Organ abzielen. Dieses Videoprotokoll demonstriert eine effiziente Technik zur Isolierung, Fixierung und Färbung von Larven-SGs von Anopheles gambiae-Mücken. Drüsen, die von Larven in einer 25% igen Ethanollösung seziert werden, werden in einem Methanol-Eisessig-Gemisch fixiert, gefolgt von einer kalten Acetonwäsche. Nach einigen Spülungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) können SGs mit einer breiten Palette von Markerfarbstoffen und/oder Antiseren gegen SG-exprimierte Proteine gefärbt werden. Diese Methode zur Larven-SG-Isolierung könnte auch verwendet werden, um Gewebe für die In-situ-Hybridisierungsanalyse, andere transkriptomische Anwendungen und Proteomstudien zu sammeln.

Introduction

Malaria ist eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, die im Jahr 2019 fast 230 Millionen Infektionen und schätzungsweise 409.000 Todesfälle verursacht1. Die meisten Todesfälle sind in Subsahara-Afrika und werden durch den Parasiten Plasmodium falciparumverursacht, dessen Insektenvektor Anopheles gambiaeist, der Gegenstand dieser Videodemonstration ist. Obwohl die Zahlen auf einen signifikanten Rückgang der jährlichen Sterberate seit der Jahrhundertwende hindeuten (>300.000 weniger jährliche Todesfälle), nehmen die vielversprechenden Rückgänge der Krankheitsraten, die von 2000 bis 2015 beobachtet wurden, ab, was auf die Notwendigkeit neuer Ansätze zur Begrenzung der Krankheitsübertragung hindeutet2. Zu den vielversprechenden zusätzlichen Strategien zur Kontrolle und möglichen Eliminierung von Malaria gehört das Targeting der Mückenvektorkapazität mittels CRISPR/Cas9-basierter Gen-Editing und Gene-Drive3,4,5. Tatsächlich ist es das Targeting des Mückenvektors (durch den erweiterten Einsatz von langlebigen, mit Insektiziden behandelten Moskitonetzen), das den größten Einfluss auf die Verringerung der Krankheitsübertragung hatte6.

Weibliche Moskitos erwerben Plasmodium-Gametozyten von einem infizierten Menschen während einer Blutmahlzeit. Nach Befruchtung, Reifung, Mitteldarmepithel-Traversal, Populationsexpansion und Hämocoel-Navigation in ihren obligaten Mückenwirten dringen Hunderte bis Zehntausende von Plasmodium-Sporozoiten in die Mücken-SGs ein und füllen die sekretorischen Hohlräume der konstituierenden sekretorischen Zellen. In den sekretorischen Hohlräumen angekommen, haben die Parasiten direkten Zugang zum Speichelgang und sind somit bereit für die Übertragung auf einen neuen Wirbeltierwirt bei der nächsten Blutmahlzeit. Da SGs für die Übertragung von Malaria verursachenden Sporozoiten auf ihre menschlichen Wirte von entscheidender Bedeutung sind und Laborstudien darauf hindeuten, dass SGs für die Bluternährung, das Überleben von Moskitos oder die Fruchtbarkeit nicht wesentlich sind7,8,9, stellen sie ein ideales Ziel für übertragungsblockierende Maßnahmen dar. Adulte Mücken-SGs bilden sich als Eine Ausarbeitung von "Gangknospen" -Überresten in den Larven-SGs, die über die frühe pupale SG-Histolyse10hinaus bestehen bleiben, was die Larven-SG zu einem idealen Ziel für Interventionen zur Begrenzung der Krankheitsübertragung im Erwachsenenstadium macht.

Die Charakterisierung des Larvenstadiums der SG-Entwicklung kann nicht nur dazu beitragen, ein besseres Verständnis seiner Morphologie und funktionellen Anpassungen zu entwickeln, sondern auch bei der Bewertung neuer Interventionen helfen, die auf dieses Organ abzielen, durch Gen-Editing von wichtigen SG-Regulatoren. Da alle früheren Studien zur Larven-Speicheldrüsenarchitektur älter sind als Immunfärbung und moderne bildgebende Verfahren10,11, haben wir ein Protokoll zur Isolierung und Färbung von Speicheldrüsen mit einer Vielzahl von Antikörpern und Zellmarkern entwickelt12. Dieses Video demonstriert diesen Ansatz zur Extraktion, Fixierung und Färbung von Larven-SGs aus Anopheles gambiae L4-Larven für die konfokale Bildgebung.

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Protocol

1. Vorbereitung von Lösungen und Tools

  1. Herstellung der Dissektionslösung
    1. Zur Herstellung der Sezierlösung werden 2,5 ml 100% iges Ethanol zu 7,5 ml destilliertemH2Oin einem 15-jährigen Kunststoffröhrchen gegeben. Drehen Sie die Tube 3 mal um, um zu mischen.
      HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Herstellung von 10x phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmaterial (PBS)
    1. Zur Herstellung von 10x PBS-Brühe werden 17,8 gNa2HPO4•2H 2O, 2,4 gKH2PO4,80 g NaCl und 2 g KCl auf 800 ml entionisiertes Wasser gegeben. Mit einem Rührstab auf einer Rührplatte vermischen, bis sich die Feststoffe vollständig aufgelöst haben. Stellen Sie das Endvolumen mit gereinigtem Wasser auf 1 L ein.
      HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
  3. Vorbereitung von 1x PBS
    1. 10 mL 10x PBS zu 90 mLH2Oin eine sterile Glasflasche geben. Schließen Sie den Deckel fest und wenden Sie 3x zum Mischen um.
      HINWEIS: Die Lösung kann mehrere Wochen bei 4 °C gelagert werden.
  4. Vorbereitung von Fixiermitteln.
    1. Fügen Sie 600 μL Methanol zu 200 μL Eisessig hinzu. Machen Sie die Lösung jedes Mal frisch.
  5. Aufbau einer Spachtelplatte (eine mit Silikonkautschuk gefüllte Gewebekulturschale)
    1. Mischen Sie die Komponenten (1:50) von Epoxidharz (1 g) und Wasser (50 ml) und gießen Sie die Mischung in eine Petrischale. Warten Sie, bis die Komponenten getrocknet sind, bevor Sie sie verwenden.
      HINWEIS: Einmal konstruiert, kann die Spachtelplatte jahrelang verwendet werden.

2. Drüsendissektion (Abbildung 1A)

  1. Sammeln Sie L4-Larven im Spätstadium (~ 10 Tage nach dem Schlüpfen; Abbildung 2) von Zuführschalen mit einer Kunststoff-Transferpipette.
    HINWEIS: Siehe dieses hilfreiche Online-Handbuch für Standard-Mückenhaltung und Larvenkultur13.
    1. Legen Sie eine Spachtelplatte auf die Bühne eines Seziermikroskops und übertragen Sie die Larven auf die Spachtelplatte.
      HINWEIS: Beim Aliquotieren von Larven für die anfängliche Dissektion ist es hilfreich, ~ 10 Larven gleichzeitig mit einer Kunststoff-Transferpipette auf den Objektträger zu übertragen.
  2. Geben Sie einen Tropfen Dissektionslösung (1:3 EtOH:H2 O) auf die Kittplatte, getrennt von den 10 Larven.
  3. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette oder Einweg-Glaspipette, um eine L4-Larve in den 25% igen EtOH-Tropfen zu legen.
  4. Nehmen Sie eine Pinzette (# 5), eine in jeder Hand, und greifen Sie mit der nicht dominanten Hand den Kopf der Larve. Mit der dominanten Hand greifen Sie die Larve mit einer Pinzette direkt unter dem Kopf und ziehen Sie vorsichtig mit minimaler konstanter Kraft, so dass sich der Kopf vom Rest des Körpers löst und die Drüsen am Kopf befestigt bleiben. Verwerfen Sie den Körperteil des Larvenkadavers.
    HINWEIS: Stellen Sie beim Sezieren ein Papiertuch in die Nähe, um die Larvenkadaver zu sammeln.
  5. Sammeln Sie den Kopf / die Drüsen in 1 ml 1x PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 1 ml PBS für ~ 40 sezierte Drüsen mit ihren angehängten Köpfen. Warten Sie, bis die Köpfe/SGs auf den Boden des Puffers sinken.

3. Fixierung auf Antikörperfärbung (Abbildung 1B)

  1. Lassen Sie das PBS von der Oberseite des Mikrozentrifugenröhrchens mit einer Glastransferpipette abtropfen, vermeiden Sie das klebrige Mückengewebe und entfernen Sie so viel PBS-Lösung wie möglich, ohne das Gewebe zu beschädigen. Ersetzen Sie die Lösung durch 800 μL eines 3:1-Gemisches von Methanol zu Eisessig. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht auf 4 °C (12-24 h empfohlen; 19 h bevorzugt).
  2. Am nächsten Tag die Lösung abtropfen lassen und durch 1 ml kaltes 100% Aceton ersetzen. Lassen Sie für 90 s.
  3. Entfernen Sie das Aceton und spülen Sie das Gewebe dreimal vorsichtig mit jeweils 1 ml 1x PBS ab.
    HINWEIS: Die Proben sollten langsam mit der Strömung nach oben schweben und dann bis zum Abschluss jeder PBS-Zugabe auf den Boden des Rohres zurückfallen.

4. Immunfärbung (Abbildung 1B)

  1. Primärantikörper (z. B. Rab11) in der entsprechenden Verdünnung (1:100) in 200 μL des Gesamtvolumens von 1x PBS zugeben. Den Röhrcheninhalt vorsichtig mit einer Pipettenspitze schwenken. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  2. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal mit 1 ml 1x PBS (vorsichtiges Pipettieren der Lösung in und aus der Pipette).
  3. Sekundärer Antikörper (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) in der entsprechenden Verdünnung (1:200) in 200 μL Gesamtvolumen zugeben. Den Röhrcheninhalt vorsichtig mit einer Pipettenspitze schwenken. Bei Raumtemperatur 90 Min. inkubieren.
  4. Fügen Sie Farbstoffe wie Nilrot (Lipide, 5 μL von 1 μg / μL) und / oder Hoechst (DNA, 3 μL von 1 μg / μL) in 200 μL PBS in diesem Stadium hinzu. Bei Raumtemperatur für weitere 60 Min. inkubieren. Dreimal vorsichtig mit 1x PBS waschen.

5. Befestigung gefärbter Drüsen für die Mikroskopie (Abbildung 1C)

  1. 200 μL 100% Glycerin auf einen Objektträger pipettieren.
    HINWEIS: Da Glycerin viskos ist, lassen Sie die Pipettenspitze in der Flüssigkeit, bis sie das entsprechende Volumen erreicht hat. Es wurde keine Gewebeschrumpfung beobachtet, wenn man direkt in 100% Glycerin ging. Forscher können jedoch 30% und 50% Glycerinwäschen in den Röhrchen durchlaufen, bevor sie die Proben in 100% Glycerin bewegen.
  2. Übertragen Sie die gefärbten Köpfe (bis zu 20 pro Objektträger) mit den angebrachten Drüsen (zusammen mit anderen inneren Strukturen) mit einem weichen Pinsel auf den Objektträger (Abbildung 3A). Verteilen Sie die Proben so, dass sie gleichmäßig entlang des Glasobjektträgers verteilt sind.
    HINWEIS: Beim Ablegen von Verschraubungen auf einem Abdeckschlitten mit einer Bürste können die SGs mit einer Pinzette sanft ausgerichtet werden, so dass sie alle in die gleiche Richtung ausgerichtet sind.
  3. Wenn Sie unter einem Seziermikroskop den Larvenkopf mit zwei Zangenpaaren von den Drüsen trennen und die beiden Gewebe vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
    HINWEIS: Da es schwierig ist, die SGs vollständig zu isolieren, entfernen Sie einfach die Köpfe und lassen Sie die SGs und die zugehörigen internen Strukturen zurück. Auch wenn die SGs mit anderen Geweben assoziiert bleiben, sind sie leicht zu erkennen, wenn sie mit Hoechst und anderen Markern angefärbt werden (Abbildung 3B, C).
  4. Entfernen und entsorgen Sie die Köpfe und wiederholen Sie den Trennvorgang für jedes SG.
    HINWEIS: Wenn Sie Köpfe entfernen, stellen Sie ein Papiertuch in die Nähe, um sie zu sammeln.
  5. Legen Sie vorsichtig einen 1,5 mm dicken Deckglas auf die Oberseite (Luftblasen vermeiden) und verschließen Sie ihn mit klarem Nagellack.
  6. Bei 4 °C in einem lichtdichten Behälter aufbewahren.
    HINWEIS: Vorbereitete Objektträger aus gefärbten Drüsen können bis zu sechs Monate bis zu einem Jahr bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt werden, ohne dass es zu nennenswerten Qualitätsänderungen kommt. Wenn Glycerin im Laufe der Monate zu lecken beginnt, heben Sie den Deckstab vorsichtig an und pipettieren Sie mehr Glycerin, um Löcher zu füllen.

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Representative Results

Speicheldrüsen sind relativ einfach von allen Larven des Stadiums 4 zu sezieren. Männliche und weibliche Larven können im späten L4-Larvenstadium durch einen roten Streifen entlang des dorsalen Thorax von Weibchen, nicht aber von Männchen unterschieden werden (Abbildung 2). Wir beobachten auch, dass die Antennenmorphologie bei männlichen L4-Larven viel ausgefeilter ist als bei weiblichen L4-Larven (Abbildung 2), ähnlich den Unterschieden, die in dieser Struktur bei erwachsenen Moskitos beobachtet wurden. Neben dem beträchtlichen Gesamtwachstum während des L4-Stadiums bilden die Speicheldrüsen während L412auch ein Lumen. Speicheldrüsen, die aus larven des frühen L4-Stadiums isoliert wurden, die mit Hoechst gefärbt sind, zeigen die proximalen und distalen Lappen, die durch eine enge Verengung getrennt sind (Abbildung 3B,C). Das sich bildende Lumen erstreckt sich vom Speichelgang am proximalsten Ende (nicht gezeigt) durch den distalen Lappen. Das sich bildende Lumen ist in der immungefärbten distalen Speicheldrüse einer mittleren bis späten L4-Larve zu sehen (Abbildung 4). Die apikalen Domänen der sekretorischen Zellen, die das sich bildende Lumen umgeben, weisen eine intensive Nilrotfärbung auf (Abbildung 4B,C), die auf mikrovilliartige Strukturen hindeutet. Ebenfalls in der Nähe der apikalen Oberfläche beobachtet wird die Rab11-Färbung(Abbildung 4C,D,Pfeile). Rab11 lokalisiert auf apikale Recycling-Endosomen. Die Rab11-Färbung, die sich auch entlang der Basaloberfläche der Drüse ansammelt, ist aufgrund der Klebrigkeit der Basalmembran ein Artefakt. Eine ähnliche Hintergrundfärbung ist bei der Immunfärbung sowohl der Larven- als auch der erwachsenen Speicheldrüsen üblich und wurde mit einem echten Signal verwechselt.

Figure 1
Abbildung 1: Cartoon-Visualisierung des Immunfärbungsprozesses von der Drüsendissektion bis zur Objektträgervorbereitung. Abkürzungen: SGs = Speicheldrüsen; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; MeOH = Methanol; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; Abs = Antikörper; LH = linke Hand; RH = rechte Hand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Männliche und weibliche L4-Larven von Anopheles gambaie. (A, B) Frühe L4-Larven. (C, D) Späte L4-Larven. Während der L4-Phase gibt es ein beträchtliches Wachstum. Weibchen (A, C) wurden mit einem unterscheidenden roten Streifen entlang des dorsalen Thorax (C; schwarzer Pfeil) beschrieben, der bei Männchen ( B, D ) nicht vorhandenist,aber auch ihre Antennen sind viel weniger aufwendig (Rüschen) als die von männlichen Larven aus dem frühen und späten L4 (weiße Pfeile in vergrößerten Bildern). Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Frühe L4-Speicheldrüsen. (A) Früher weiblicher L4-Larvenkopf mit Speicheldrüsen und anderen inneren Organen, die noch befestigt sind. Speicheldrüse ist umrissen. Mensur = 50 μm. (B, C) Isolierte Larvendrüsen, die mit Hoechst gefärbt sind. (B) Verschmelzung von fluoreszierenden und Nomarski-Bildern, die die Form der proximalen und distalen Lappen und die blaue Hoechst-Färbung in Kernen zeigen. (C) Das Fluoreszenzbild von Hoechst hebt nur Kerne hervor. Maßstabsleiste in den unteren Bereichen = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Immungefärbte distale L4-Speicheldrüse. (A) Drüse wurde mit Hoechst (Kern-DNA, blau) und (B) Nilrot (Membranmarker, rot) gefärbt; immungefärbt für Rab11 (apikale Recyclingvesikel, grün) (C). (D) Das zusammengeführte Bild. Beachten Sie, dass in der gezeigten Phase ein Lumen vorhanden ist (B-D). Die Pfeile in C und D zeigen auf die erwartete Rab11-Färbung von Vesikeln in der Nähe der apikalen Oberfläche, die die Nil-Rot-positive vesikuläre Färbung in der Verschmelzung (weiße Pfeile) überlappt. Unspezifische Hintergrundfärbungen um die Basaloberfläche (Sternchen) werden ebenfalls beobachtet, eine häufige Art von Hintergrund, die in Larven- und erwachsenen Speicheldrüsen beobachtet wird. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das hierin beschriebene Protokoll wurde aus einem Drosophila SG-Dissektionsprotokoll und einem adulten Mückendissektionsprotokoll14,15,16angepasst. Die meisten Marker drangen jedoch nicht in die Basalmembran ein (Daten nicht gezeigt), wenn die Adult-Dissektions- und SG-Färbemethoden verwendet wurden. Zu den Anpassungen des Erwachsenenprotokolls gehörten das Sezieren der Drüsen in einer 25% igen EtOH-Lösung, das Waschen der Drüsen mit einer Kombination aus MeOH und Eisessigsäure und eine 90-s-Acetonwäsche. Im ursprünglichen Erwachsenenprotokoll wurden erwachsene SGs in 1x PBS14,15,16seziert. Das Sezieren in einer 25% igen EtOH-Lösung trug dazu bei, die SGs zu erhalten und Schäden während der Färbezeiten zu vermeiden. Bei der Durchführung der anfänglichen Sezierung war es am einfachsten, die Larven-SGs so auszurichten, dass der Kopf der nicht dominanten Hand zugewandt ist und die dominante Hand sanft nach außen zieht (da sich die Larven sehr aktiv bewegen). Die verbesserte Gewebepenetration, die durch das Waschen der Drüsen mit einer MeOH: Eisessigsäurelösung erreicht wird, deutet darauf hin, dass sich der Lipidgehalt in der LARVEN-SG-Basalmembran und/oder den zellulären Plasmamembranen von dem der erwachsenen SG unterscheidet. Die 90er Jahre Acetonwäsche verbesserte die Klarheit der Drüsen für die Bildgebung. Obwohl empfohlen wurde, die Fixierungszeit mindestens 19 h (über Nacht) zu betragen, funktionierten längere Zeiträume genauso effektiv.

Die Morphologie der SGs kann stark variieren, je nachdem, wann die Larven im 2-tägigen L4-Stadium seziert werden. Bei frühen L4-Dissektionen (Tag 1) erscheint das Lumen viel kleiner12. Bei späten L4-Dissektionen (zweite Hälfte von Tag 2) ist das Lumen groß und die Zellen sind länglich. Wir fanden heraus, dass die optimale Zeit für die Arbeit mit Larven die L4 war; L1-L3 SGs sind einfach zu klein für manuelle Dissektionen. In bildgebenden Ergebnissen zeigten Drüsen, die mitte bis spät L4 seziert wurden, kleinere Zellen, die mit größeren, seitlich verlängerten Zellen gemischt waren, insbesondere im distalen Sack.

Frühere Berichte über die Entwicklung von Anopheles SG haben den aktuellen Studien viel Orientierung gegeben. Diese Berichte enthielten Illustrationen von sezierten embryonalen und larvenartigen SGs17,18, detaillierte mikroskopische Analyse der sezierten Drüsen19,20und transkriptomische Studien20,21,22. Die Merkmale des Anopheles stephensi SG wurden in den 1950er Jahren von zwei verschiedenen Gruppenberichtet 10,11. Viele der morphologischen Merkmale der Larvendrüsen wurden beschrieben, einschließlich der Gesamtorganisation des SG, der relativen Positionen verschiedener Zelltypen innerhalb des Organs (Ductus, adulte SG-Vorläufer und die proximalen und distalen sekretorischen Larvensäcke)10,11. Beide Gruppen berichteten auch über zusätzliche morphometrische Daten, einschließlich der Anzahl und Verteilung der sekretorischen Zellen in jedem Sack und ihrer Kerngröße10,11. Rishikesh zeigte, dass wie die Drosophila-Larven-SGs die Larven-SG-Chromosomen von Anopheles stephensi polytenisiert sind10. Diese wichtigen grundlegenden Übersichten beschrieben breite biologische Aspekte von Larven-Anopheles-SGs.

Die hier beschriebene Methode sollte nützlich sein, um nicht nur Larven-SGs von An. gambiae zu untersuchen, sondern kann auch für diejenigen gelten, die andere Arten von Moskitos untersuchen. In der Tat wurde das gleiche Protokoll erfolgreich (unveröffentlicht) mit An. stephensi, einer Spezies, die häufig im Labor untersucht wird, verwendet. Eine Einschränkung des Protokolls ist die begrenzte Anzahl von Antikörpern, die speziell gegen Mückenproteine erzeugt wurden. Obwohl die Verwendung von Drosophila-Antikörpern für hochkonservierte Proteine diese Einschränkung umschifft hat12, könnte das Feld von mehr Mückenprotein-spezifischen Antikörpern profitieren. Das Verständnis der Larven-SG-Zell- und Molekularbiologie kann zu neuen Kontroll- oder Zielstrategien beitragen und die Entdeckung neuer Kandidaten-Zielgene für SG-Störungen ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken dem Johns Hopkins Malaria Research Institute für den Zugang zu und die Aufzucht von An. gambiae-Larven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

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References

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Biologie Heft 175
Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von <em>Anopheles gambiae</em> Mücken
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Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

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