Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.
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Methodenartikel
Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mückenspeicheldrüsen (SGs) sind ein notwendiges Einstiegsorgan für die Übertragung von durch Insekten übertragenen Krankheitserregern. Krankheitserreger, einschließlich Viren und die Plasmodium-Parasiten, die Malaria verursachen, sammeln sich in den sekretorischen Hohlräumen von SG-Zellen an. Hier sind sie bereit für die Übertragung auf ihre Wirbeltierwirte während einer anschließenden Blutmahlzeit. Da sich erwachsene Drüsen als Eine Ausarbeitung von Larven-SG-Gang-Knospenresten bilden, die über die frühe pupale SG-Histolyse hinaus bestehen bleiben, ist die Larven-SG ein ideales Ziel für Interventionen, die die Krankheitsübertragung begrenzen. Das Verständnis der Larven-SG-Entwicklung kann dazu beitragen, ein besseres Verständnis ihrer Morphologie und funktionellen Anpassungen zu entwickeln und bei der Bewertung neuer Interventionen zu helfen, die auf dieses Organ abzielen. Dieses Videoprotokoll demonstriert eine effiziente Technik zur Isolierung, Fixierung und Färbung von Larven-SGs von Anopheles gambiae-Mücken. Drüsen, die von Larven in einer 25% igen Ethanollösung seziert werden, werden in einem Methanol-Eisessig-Gemisch fixiert, gefolgt von einer kalten Acetonwäsche. Nach einigen Spülungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) können SGs mit einer breiten Palette von Markerfarbstoffen und/oder Antiseren gegen SG-exprimierte Proteine gefärbt werden. Diese Methode zur Larven-SG-Isolierung könnte auch verwendet werden, um Gewebe für die In-situ-Hybridisierungsanalyse, andere transkriptomische Anwendungen und Proteomstudien zu sammeln.
Einleitung
Malaria ist eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, die im Jahr 2019 fast 230 Millionen Infektionen und schätzungsweise 409.000 Todesfälle verursacht1. Die meisten Todesfälle sind in Subsahara-Afrika und werden durch den Parasiten Plasmodium falciparumverursacht, dessen Insektenvektor Anopheles gambiaeist, der Gegenstand dieser Videodemonstration ist. Obwohl die Zahlen auf einen signifikanten Rückgang der jährlichen Sterberate seit der Jahrhundertwende hindeuten (>300.000 weniger jährliche Todesfälle), nehmen die vielversprechenden Rückgänge der Krankheitsraten, die von 2000 bis 2015 beobachtet wurden, ab, was auf....
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Protokoll
1. Vorbereitung von Lösungen und Tools
- Herstellung der Dissektionslösung
- Zur Herstellung der Sezierlösung werden 2,5 ml 100% iges Ethanol zu 7,5 ml destilliertemH2Oin einem 15-jährigen Kunststoffröhrchen gegeben. Drehen Sie die Tube 3 mal um, um zu mischen.
HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Zur Herstellung der Sezierlösung werden 2,5 ml 100% iges Ethanol zu 7,5 ml destilliertemH2Oin einem 15-jährigen Kunststoffröhrchen gegeben. Drehen Sie die Tube 3 mal um, um zu mischen.
- Herstellung von 10x phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmaterial (PBS)
- Zur Herstellung von 10x PBS-Brühe werden 17,8 gNa2HPO4•2H 2O, 2,4 gKH2PO4,80 g NaCl und 2 g KCl auf 800 ml entionisiertes Wasser gegebe....
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Ergebnisse
Speicheldrüsen sind relativ einfach von allen Larven des Stadiums 4 zu sezieren. Männliche und weibliche Larven können im späten L4-Larvenstadium durch einen roten Streifen entlang des dorsalen Thorax von Weibchen, nicht aber von Männchen unterschieden werden (Abbildung 2). Wir beobachten auch, dass die Antennenmorphologie bei männlichen L4-Larven viel ausgefeilter ist als bei weiblichen L4-Larven (Abbildung 2), ähnlich den Unterschieden, die in dieser Struktur .......
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Diskussion
Das hierin beschriebene Protokoll wurde aus einem Drosophila SG-Dissektionsprotokoll und einem adulten Mückendissektionsprotokoll14,15,16angepasst. Die meisten Marker drangen jedoch nicht in die Basalmembran ein (Daten nicht gezeigt), wenn die Adult-Dissektions- und SG-Färbemethoden verwendet wurden. Zu den Anpassungen des Erwachsenenprotokolls gehörten das Sezieren der Drüsen in einer 25% igen EtOH-Lösung, das Waschen der Drüse.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken dem Johns Hopkins Malaria Research Institute für den Zugang zu und die Aufzucht von An. gambiae-Larven.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Aceton | Millipore Sigma | 179124 | |
| Pinsel mit weichen Borsten | Amazon (SN NJDF) Detail Pinsel Set | B08LH63D89 | |
| Deckgläser (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethylalkohol 200 Proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Eisessig | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Juwelier Pinzette, Dumont Nr. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nagellack | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nilrot (Lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Papierhandtücher/-tücher | ULINE | S-7128 | |
| Petriplatte (zur Herstellung von Spachtelplatten) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipettenspitzen | Gilson | Tips E200ST | |
| Kunststoff-Transferpipette | Fisher Wissenschaftliche | S304671 | |
| Primäre Antikörper (z. B. Crb, Rab11) | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Maus anti-Crb (Cq4) oder Kaninchen anti-Rab11 | |
| Sekundärantikörper mit fluoreszierenden Tags (z. B. Alexa Fluor 488 Ziegen-anti Kaninchen) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silikonharz und Härter für Spachtelplatten | Dow Chemicals - Ximeter Silikon | PMX-200 | |
| Objektträger, einseitig mattiert zur Beschriftung | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Weizenkeim-Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referenzen
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
